Microscopia a luce correlativa (CLEM) per il monitoraggio e la proteina virale di Imaging strutture in cellule di Cryo-immobilizzata associate
September 7th, 2018
Un metodo di microscopia luce correlativa (CLEM) viene applicato alle strutture intracellulari indotte da virus immagine tramite microscopia elettronica (EM) in cellule che sono già stati scelti da microscopia chiara (LM). LM ed EM sono combinati in un approccio di imaging ibrido per ottenere una visione integrata delle interazioni virus-ospite.
Questo metodo aiuta a rispondere a domande chiave nel campo della biologia su come le bioproteine che si trovano nelle membrane cellulari per creare ambienti che favoriscono la bio-replicazione e l'assemblaggio. I due capisaldi tecnici che vengono combinati qui sono, in primo luogo, la correlazione tra l'imaging di cellule vive e la microscopia elettronica, e in secondo luogo, il congelamento ad alta pressione. Sebbene questo metodo sia stato progettato e utilizzato con successo per affrontare le interazioni con la fonte del virus, può essere facilmente generalizzato a una vasta gamma di applicazioni nella biologia cellulare. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto ci sono molte fasi che richiedono esperienza pratica con successo, in particolare la crio-immobilizzazione mediante congelamento ad alta pressione e le fasi successive. Inizia posizionando dischi di zaffiro modellati con un motivo alfanumerico inciso su una delle loro superfici in una provetta da centrifugazione conica da 15 millilitri e lavando accuratamente i dischi con etanolo. Metti i dischi di zaffiro lavati in una capsula di Petri foderata con carta da filtro per l'asciugatura e usa una pinzetta lunga e sottile per trasferire i dischi di zaffiro essiccati su vetrini. Utilizzando un microscopio invertito con ingrandimento 4x, verificare che lo schema delle coordinate su ogni disco di zaffiro sia leggibile. Quindi, sterilizzare i dischi con un reticolante ultravioletto per cinque minuti. In una cappa di biosicurezza, aggiungere metà del terreno di coltura cellulare a una piastra di coltura cellulare e utilizzare una pinzetta lunga per trasferire con cura i dischi di zaffiro nella piastra. Quindi, seme 1x10
Panoramica
Questo articolo presenta un metodo di microscopia elettronica a luce correlata (CLEM) per visualizzare le strutture intracellulari indotte da virus. Integrando la microscopia ottica (LM) e la microscopia elettronica (EM), i ricercatori possono ottenere informazioni sulle interazioni virus-ospite.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Biologia cellulare
- Tecniche di microscopia
- Interazioni virus-ospite
Sfondo
- Il metodo combina l'imaging di cellule vive con la microscopia elettronica.
- Il congelamento ad alta pressione è un componente critico della tecnica.
- È stato applicato con successo per studiare le interazioni virali.
- Il metodo può essere generalizzato a varie applicazioni nella biologia cellulare.
Obiettivo dello studio
- Visualizzare le strutture indotte da virus nelle cellule.
- Migliorare la comprensione delle interazioni bio-proteiche nelle membrane cellulari.
- Fornire una guida pratica per i ricercatori che utilizzano questo metodo.
Metodi utilizzati
- Preparazione di dischi di zaffiro modellati per l'imaging.
- Utilizzo della microscopia invertita per la conferma del modello.
- Sterilizzazione dei dischi mediante crosslinking ultravioletto.
- Tecniche di coltura cellulare per la semina delle cellule sui dischi di zaffiro.
Risultati principali
- Visualizzazione riuscita delle strutture intracellulari indotte da virus.
- Dimostrazione dell'efficacia di CLEM nello studio delle interazioni virus-ospite.
- Passi pratici delineati per l'implementazione del metodo.
- Possibili applicazioni in contesti più ampi di biologia cellulare.
Conclusioni
- Il metodo CLEM fornisce preziose informazioni sulla biologia dei virus.
- Colma il divario tra la microscopia ottica e quella elettronica.
- Sono incoraggiate ulteriori applicazioni nella biologia cellulare.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Correlative Light Electron Microscopy (CLEM) addresses a critical bottleneck in virology research by enabling targeted analysis of rare transfected or infected cell populations. By combining fluorescence-based live-cell imaging with high-resolution ultrastructural preservation via high pressure freezing, this method enhances predictive confidence in mechanistic studies of virus-host interactions. It supports early-stage target validation and assay development by providing correlative data that bridges functional phenotypes with subcellular architecture, informing go/no-go decisions in antiviral discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking fluorescently tagged viral protein expression to ultrastructural changes in cryo-immobilized cells.
- Operational Value: Increases efficiency in studying low-efficiency transfection or infection events through pre-screening via light microscopy.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by visualizing virus-induced membrane alterations and assembly sites relevant to replication complexes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates correlated fluorescence and electron density readouts that enable quantitative assessment of viral protein localization and structural perturbations.
- Operational Value: Standardizes sample preparation using patterned sapphire discs, facilitating reproducible correlation across experiments and users.
- Assay Readiness: Produces ultrastructurally preserved samples suitable for downstream imaging and morphometric analysis in screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains structural fidelity from live-cell imaging to electron microscopy, supporting biomarker-aligned phenotypic screening in disease-relevant systems.
- Preclinical Modeling: Enables detailed characterization of virus-induced cytopathic effects in near-native states, improving confidence in translational extrapolation.
- Risk-Adjusted Advancement: Provides ultrastructural evidence to support or refute mechanisms of action for antiviral candidates.
Pipeline & Workflow Integration
CLEM fits within the discovery continuum from hypothesis generation in early virology to mechanistic validation in lead optimization, particularly when structural correlates of protein function are needed.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling direct visualization of viral protein-associated structures in defined cellular subpopulations.
- Screening: Enhances assay reliability through standardized cell localization and cryo-preservation, reducing variability in structural readouts.
- Analytics: Delivers correlated light and electron microscopy datasets that allow quantitative comparison of conditions based on fluorescence intensity and ultrastructural features.
- Translational Research: Bridges functional imaging with high-resolution structural data, supporting continuity from cell-based assays to mechanistic validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying virus-host interactions applicable across multiple targets and viral families.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing direct correlative evidence of viral protein localization and induced structural changes.
- Operational Value: Improves reproducibility through standardized use of patterned substrates and high pressure freezing, minimizing artifacts from chemical fixation.
- Strategic Value: Informs better go/no-go decisions by validating target engagement at the ultrastructural level, reducing late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of antiviral candidates based on confirmed effects on viral replication compartments or assembly sites.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live-cell fluorescence imaging, high pressure freezing, freeze substitution, and transmission electron microscopy.
- Dependent on access to high pressure freezers, ultramicrotomes, and correlated light and electron microscopy imaging systems.
- Necessitates standardization of fiducial markers (e.g., patterned sapphire discs) and coordinate mapping protocols across teams.
- Adaptation to different cell types or viral systems may require optimization of transfection efficiency, fluorescence labeling, and freezing parameters.
- Practical limitations include low throughput due to specialized equipment and the need for correlative software alignment, as noted in the source material.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:51
Patterned Sapphire Disc Preparation, Cell Culture, and Imaging
3:16
Cryo-immobilization and Freeze Substitution (FS)
5:24
Resin Embedding and Patterned Sapphire Disc Removal from the Polymerized Resin Block
6:43
Ultrathin Section Preparation and Imaging via Transmission Electron Microscopy (TEM)
8:06
Results: Tracking and Imaging of Viral Protein-associated Structures via Correlative Light Electron Microscopy (CLEM)
8:47
Conclusion
