Microscopia a luce correlativa (CLEM) per il monitoraggio e la proteina virale di Imaging strutture in cellule di Cryo-immobilizzata associate
7 settembre 2018
Un metodo di microscopia luce correlativa (CLEM) viene applicato alle strutture intracellulari indotte da virus immagine tramite microscopia elettronica (EM) in cellule che sono già stati scelti da microscopia chiara (LM). LM ed EM sono combinati in un approccio di imaging ibrido per ottenere una visione integrata delle interazioni virus-ospite.
Questo metodo aiuta a rispondere a domande chiave nel campo della biologia su come le bioproteine che si trovano nelle membrane cellulari per creare ambienti che favoriscono la bio-replicazione e l'assemblaggio. I due capisaldi tecnici che vengono combinati qui sono, in primo luogo, la correlazione tra l'imaging di cellule vive e la microscopia elettronica, e in secondo luogo, il congelamento ad alta pressione. Sebbene questo metodo sia stato progettato e utilizzato con successo per affrontare le interazioni con la fonte del virus, può essere facilmente generalizzato a una vasta gamma di applicazioni nella biologia cellulare. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto ci sono molte fasi che richiedono esperienza pratica con successo, in particolare la crio-immobilizzazione mediante congelamento ad alta pressione e le fasi successive. Inizia posizionando dischi di zaffiro modellati con un motivo alfanumerico inciso su una delle loro superfici in una provetta da centrifugazione conica da 15 millilitri e lavando accuratamente i dischi con etanolo. Metti i dischi di zaffiro lavati in una capsula di Petri foderata con carta da filtro per l'asciugatura e usa una pinzetta lunga e sottile per trasferire i dischi di zaffiro essiccati su vetrini. Utilizzando un microscopio invertito con ingrandimento 4x, verificare che lo schema delle coordinate su ogni disco di zaffiro sia leggibile. Quindi, sterilizzare i dischi con un reticolante ultravioletto per cinque minuti. In una cappa di biosicurezza, aggiungere metà del terreno di coltura cellulare a una piastra di coltura cellulare e utilizzare una pinzetta lunga per trasferire con cura i dischi di zaffiro nella piastra. Quindi, seme 1x10
Panoramica
Questo articolo presenta un metodo di microscopia correlative di luce ed elettroni (CLEM) per visualizzare le strutture intracellulari indotte dai virus. Integrando la microscopia ottica (LM) e la microscopia elettronica (EM), i ricercatori possono ottenere informazioni sulle interazioni tra virus e ospite.
Componenti Chiave dello Studio
Settore Scientifico
- Biologia cellulare
- Tecniche di microscopia
- Interazioni virus-ospite
Sfondo
- Il metodo combina l'immagineggiatura di cellule vive con la microscopia elettronica.
- La congelazione ad alta pressione è un componente essenziale della tecnica.
- È stato applicato con successo per lo studio delle interazioni virali.
- Il metodo può essere generalizzato a varie applicazioni nella biologia cellulare.
Scopo dello studio
- Visualizzare le strutture indotte da virus nelle cellule.
- Migliorare la comprensione delle interazioni tra biomolecole nelle membrane cellulari.
- Fornire una guida pratica ai ricercatori che utilizzano questo metodo.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di dischi di zaffiro strutturati per l'analisi mediante imaging.
- Utilizzo della microscopia invertita per la conferma della struttura.
- Sterilizzazione dei dischi mediante cross-linking ultravioletto.
- Tecniche di coltura cellulare per la semina delle cellule sui dischi di zaffiro.
Risultati principali
- Visualizzazione riuscita di strutture intracellulari indotte da virus.
- Dimostrazione dell'efficacia della microscopia correlativa (CLEM) nello studio delle interazioni tra virus e ospite.
- Passaggi pratici descritti per l'implementazione del metodo.
- Applicazioni potenziali in contesti più ampi di biologia cellulare.
Conclusioni
- Il metodo CLEM fornisce informazioni preziose sulla biologia virale.
- Colma il divario tra microscopia ottica e microscopia elettronica.
- Sono incoraggiate ulteriori applicazioni in biologia cellulare.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La microscopia correlative tra luce ed elettroni (CLEM) affronta un collo di bottiglia fondamentale nella ricerca virologica, consentendo l'analisi mirata di popolazioni cellulari rare transfettate o infette. Combinando l'imaging in tempo reale basato sulla fluorescenza con la conservazione ultrastrutturale ad alta risoluzione ottenuta mediante congelamento ad alta pressione, questo metodo aumenta l'affidabilità predittiva negli studi meccanicistici delle interazioni virus-ospite. Supporta la validazione precoce degli obiettivi e lo sviluppo di saggi fornendo dati correlativi che collegano fenotipi funzionali e architettura subcellulare, fornendo indicazioni fondamentali per decisioni di tipo go/no-go nei percorsi di scoperta di agenti antivirali.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche collegando l'espressione di proteine virali marcate con fluorescenza a modifiche ultrastrutturali in cellule immobilizzate mediante crio-fissazione.
- Valore operativo: Aumenta l'efficienza nello studio di eventi di trasfezione o infezione a bassa efficienza grazie a un pre-screening mediante microscopia ottica.
- Valore predittivo: Supporta la riduzione del rischio meccanicistico visualizzando alterazioni delle membrane indotte dal virus e siti di assemblaggio rilevanti per i complessi di replicazione.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera letture correlate di fluorescenza e densità elettronica che consentono una valutazione quantitativa della localizzazione delle proteine virali e delle perturbazioni strutturali.
- Valore operativo: Standardizza la preparazione del campione mediante dischi di zaffiro strutturati, facilitando una correlazione riproducibile tra esperimenti e utenti.
- Prontezza del saggio: Produce campioni con preservazione ultrastrutturale adatti per analisi morfometriche e imaging successivi in campagne di screening.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità Translazionale: Mantiene la fedeltà strutturale dall'immagine in cellule vive alla microscopia elettronica, supportando lo screening fenotipico allineato ai biomarcatori in sistemi rilevanti per la malattia.
- Modellizzazione Preclinica: Permette una caratterizzazione dettagliata degli effetti citopatici indotti dai virus in stati quasi nativi, migliorando la fiducia nelle estrapolazioni traslazionali.
- Avanzamento Basato sul Rischio: Fornisce evidenze ultrastrutturali per supportare o confutare i meccanismi d'azione di candidati antivirali.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
La microscopia correlativa (CLEM) si inserisce nel percorso della scoperta, dalla generazione di ipotesi nella virologia iniziale fino alla validazione meccanicistica nell'ottimizzazione dei composti promettenti, in particolare quando sono necessarie correlazioni strutturali della funzione proteica.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi consentendo la visualizzazione diretta di strutture associate a proteine virali in sottopopolazioni cellulari definite.
- Screening: Migliora l'affidabilità dei saggi attraverso la localizzazione standardizzata delle cellule e la crioconservazione, riducendo la variabilità nei risultati strutturali.
- Analisi: Fornisce set di dati combinati di microscopia ottica ed elettronica che permettono il confronto quantitativo tra condizioni basato sull'intensità di fluorescenza e su caratteristiche ultrastrutturali.
- Ricerca traslazionale: Collega l'imaging funzionale ai dati strutturali ad alta risoluzione, sostenendo la continuità dai saggi su cellule alla validazione meccanicistica.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per lo studio delle interazioni virus-ospite, applicabile a diversi bersagli e famiglie virali.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica fornendo evidenze dirette di correlazione sulla localizzazione delle proteine virali e sui cambiamenti strutturali indotti.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità attraverso l'uso standardizzato di substrati strutturati e congelamento ad alta pressione, minimizzando gli artefatti derivanti dalla fissazione chimica.
- Valore strategico: Permette decisioni più informate di tipo go/no-go convalidando l'interazione con la proteina bersaglio a livello ultrastrutturale, riducendo il rischio di fallimento in fasi avanzate.
- Impatto sul portafoglio: Consente una priorizzazione adeguata al rischio dei candidati antivirali in base agli effetti confermati sui compartimenti di replicazione virale o sui siti di assemblaggio.
Considerazioni per l'Implementazione
- Richiede competenze nell'immagine fluorescente di cellule vive, congelamento ad alta pressione, sostituzione del congelante e microscopia elettronica a trasmissione.
- È subordinato all'accesso a congelatori ad alta pressione, ultramicrotomi e sistemi di imaging correlative di luce ed elettroni.
- Necessita della standardizzazione di marcatori fiduciali (ad esempio, dischi di zaffiro con pattern) e di protocolli di mappatura delle coordinate tra diversi gruppi di lavoro.
- L'adattamento a diversi tipi cellulari o sistemi virali potrebbe richiedere un'ottimizzazione dell'efficienza di trasfezione, dell'etichettatura fluorescente e dei parametri di congelamento.
- I limiti pratici includono una bassa produttività a causa dell'impiego di apparecchiature specializzate e della necessità di allineamento software correlative, come indicato nella fonte.
Domande frequenti sul biopharma
Chapters in this video
0:04
Title
0:51
Patterned Sapphire Disc Preparation, Cell Culture, and Imaging
3:16
Cryo-immobilization and Freeze Substitution (FS)
5:24
Resin Embedding and Patterned Sapphire Disc Removal from the Polymerized Resin Block
6:43
Ultrathin Section Preparation and Imaging via Transmission Electron Microscopy (TEM)
8:06
Results: Tracking and Imaging of Viral Protein-associated Structures via Correlative Light Electron Microscopy (CLEM)
8:47
Conclusion
