Fissazione polmonare sotto pressione costante per la valutazione dell'enfisema nei topi
26 settembre 2019
Presentato qui è un protocollo utile per la fissazione polmonare che crea una condizione stabile per la valutazione istologica di campioni polmonari da un modello murino di enfisema. Il vantaggio principale di questo modello è che può fissare molti polmoni con la stessa pressione costante senza collasso polmonare o deflazione.
La pressione costante all'interno del dispositivo di fissazione mantiene i polmoni in uno stato ragionevolmente gonfiato generando un campione polmonare istologico adatto per valutare l'enfisema indotto dal fumo di sigaretta lieve. Il vantaggio principale di questo modello è che può riparare molti polmoni allo stesso tempo usando la stessa pressione costante senza collasso polmonare o deflazione. A dimostrare la procedura sarà Naoko Arano, uno studente laureato del mio laboratorio.
Dopo aver confermato la mancanza di risposta al movimento riflesso, fai un'incisione nella pelle e nel tessuto muscolare lungo la linea mediale del topo, mirando alla regione cefalica, e taglia lateralmente per creare uno spazio di lavoro più ampio. Dopo aver esposto lo strato diaframma perforare il tessuto con pinza e aprire lo spazio toracico. Tagliare l'area sternale permettendo di visualizzare i polmoni e il cuore.
E tagliare l'atrio sinistro e il ventricolo destro. Inserire una cannula calibro 24 collegata a una pompa perfusione nella zona del ventricolo destro e dirigere la cannula verso l'area cefalica fino a raggiungere l'arteria polmonare. Quindi, accendere la pompa e perfondere il tessuto con circa 200 millilitri di PBS per un'ora fino a quando tutto il tessuto polmonare non è cambiato in un colore bianco.
Alla fine della perfusione tagliare il tessuto connettivo che circonda la trachea, i polmoni e il cuore, e utilizzare una sutura per legare il bronco principale destro. Successivamente, raccogliere tutti i singoli lobi del polmone destro e posizionare il cuore e i lobi del polmone sinistro in singole siringhe da 10 millilitri contenenti un appropriato fissatore. Ritrarre lo stantuffo creando un vuoto nella siringa per gonfiare i polmoni e rimuovere il polmone dalla siringa.
Inserire una cannula calibro 20 nella trachea e utilizzare una sutura per fissare la cannula in posizione. Collegare una siringa millilitro riempita con fissante alla cannula e riempire il polmone con un fissatore aggiuntivo per verificare la presenza di perdite. Assicurarsi che il sito di inserimento sia stato fissato per evitare che il campione polmonare si distacci dalla scheda polmonare durante la fissazione.
Quindi trasferire il tessuto all'apparecchiatura di pressione di fissazione polmonare, rimuovendo il campione e legando la trachea con un nodo alla fine del periodo di fissazione. Il componente inferiore dell'apparecchiatura di pressione di fissazione polmonare in cui viene inserito il campione polmonare è collegato tramite cannula calibro 20 alla punta del flusso di formalina con un fermafo a tre vie. La pressione viene generata dai diversi livelli superficiali del fissatore tra i compartimenti inferiore e superiore.
La differenza di pressione è di 25 centimetri d'acqua, ma la manopola di regolazione dell'altezza può essere utilizzata per regolare la pressione tra 25 e 30 centimetri di acqua. Una pompa collega i contenitori inferiore e superiore, preservando una differenza di 25 centimetri nell'altezza fissa della superficie, e dirige il flusso dell'agente. Dopo 48 ore di fissazione i polmoni dei topi knockout SMP30 esposti all'aria ambiente non mostrano un marcato allargamento dello spazio aereo.
Significativi allargamenti dello spazio aereo e distruzione delle pareti alveolari, tuttavia, si osservano nei topi knockout SMP30 esposti al fumo di sigaretta cronico. Inoltre, l'intercetta lineare media e l'indice distruttivo dei campioni polmonari sono significativamente maggiori nei topi knockout SMP30 esposti al fumo rispetto agli animali esposti all'aria. Il nostro laboratorio utilizza il 10% di formalina, ma i ricercatori possono utilizzare altri agenti di fissazione in base alle loro esigenze sperimentali.
Come abbiamo riferito utilizzando il sistema di fissazione dimostrato, i campioni polmonari possono essere raccolti da vari modelli di enfisema del topo per la loro valutazione morfometrica. Poiché gli agenti di fissaggio possono essere pericolosi, indossare sempre i dispositivi di protezione del personale appropriati e lavorare in una stanza ben ventilata.
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Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo per la fissazione del polmone che garantisce condizioni stabili per la valutazione istologica di campioni polmonari provenienti da un modello murino di enfisema. La tecnica consente la fissazione simultanea di più polmoni senza collasso o sgonfiamento.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia
- Istologia
Sfondo
- L'enfisema è una condizione polmonare spesso indotta dal fumo di sigaretta.
- La valutazione istologica è fondamentale per comprendere la patologia polmonare.
- Il mantenimento dell'insufflazione polmonare durante la fissazione è essenziale per una valutazione accurata.
- Questo protocollo affronta le difficoltà nelle tecniche di fissazione del polmone.
Scopo dello studio
- Fornire un metodo affidabile per la fissazione del polmone.
- Facilitare la valutazione di campioni polmonari nella ricerca.
- Migliorare la coerenza nell'analisi istologica dei modelli di enfisema.
Metodi Utilizzati
- Utilizzo di un dispositivo di fissazione che mantiene una pressione costante.
- Incisione lungo la linea mediana del topo per accedere alla cavità toracica.
- Perforazione del diaframma per aprire lo spazio toracico.
- Visualizzazione di polmoni e cuore per il prelievo del campione.
Risultati principali
- Mantenimento con successo del'insufflazione polmonare durante la fissazione.
- Capacità di fissare più polmoni contemporaneamente.
- Campioni istologici stabili adatti alla valutazione.
- Dimostrazione della procedura da parte di uno studente laureato.
Conclusioni
- Il protocollo fornisce un metodo affidabile per la fissazione del polmone.
- Migliora la qualità delle valutazioni istologiche nella ricerca.
- Questa tecnica può essere applicata a vari studi che coinvolgono la patologia polmonare.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La fissazione polmonare costante sotto pressione costante affronta una sfida fondamentale nei modelli preclinici di malattie respiratorie, consentendo una valutazione istologica riproducibile dell'enfisema nei topi. Questo metodo supporta un'analisi morfometrica affidabile, riducendo la variabilità e migliorando la fiducia predittiva nella validazione precoce dei bersagli nella ricerca sulla BPCO. La possibilità di processare contemporaneamente più campioni semplifica gli studi comparativi e supporta decisioni solide di triage del portafoglio.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Prima Fase della Scoperta e Validazione del Target
- Consente una valutazione morfometrica standardizzata della gravità dell'enfisema nei modelli murini.
- Supporta la validazione funzionale di bersagli candidati fornendo un'architettura tissutale riproducibile.
- Facilita la riduzione del rischio biologico minimizzando gli artefatti indotti dalla fissazione.
- Migliora la fiducia predittiva nell'associare endpoint istologici a ipotesi meccanicistiche.
Sviluppo di screening e saggi
- Prepara campioni di polmone validati per saggi istologici quantitativi successivi.
- Garantisce riproducibilità e confrontabilità tra diversi gruppi sperimentali.
- Permette l'elaborazione scalabile di più campioni in condizioni identiche.
- Consente una valutazione affidabile degli effetti dei composti sulla struttura del polmone in campagne di screening.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea modelli preclinici di patologia polmonare a endpoint rilevanti per la malattia, in vista di studi traslazionali.
- Garantisce continuità dalla fase di scoperta alla validazione preclinica, standardizzando la preparazione dei tessuti.
- Riduce il rischio di risultati artefatti che potrebbero alterare le valutazioni di biomarcatori o di efficacia.
- Supporta decisioni di avanzamento proporzionate al rischio, basate su dati istologici solidi.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo di fissazione a pressione costante si integra nel percorso di scoperta precoce e validazione preclinica, sostenendo sia la validazione del bersaglio che l'identificazione del composto promettente nei modelli di malattie respiratorie.
- Biologia della scoperta: Fornisce un'architettura tissutale affidabile per la verifica di ipotesi e l'analisi dei percorsi nei modelli di enfisema.
- Screening: Fornisce risultati istologici quantitativi e riproducibili per la valutazione dei composti.
- Analisi: Consente misurazioni morfometriche come l'intercetta lineare media e l'indice distruttivo per analisi comparative.
- Ricerca traslazionale: Favorisce l'allineamento dei risultati preclinici con la patologia clinica dell'enfisema, quando pertinente.
- Riutilizzo aziendale: Offre una capacità standardizzata di fissazione adattabile a vari modelli murini di malattie polmonari.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e la validazione degli obiettivi riducendo la variabilità della fissazione.
- Valore operativo: Incrementa la produttività e la standardizzazione consentendo la fissazione simultanea di più campioni.
- Valore strategico: Migliora la qualità delle decisioni di avanzamento o interruzione e l'efficienza del capitale sostenendo endpoint istologici robusti.
- Impatto sul portafoglio: Facilita la priorizzazione corretta in base al rischio dei programmi per le malattie respiratorie sulla base di dati tissutali affidabili.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nelle procedure chirurgiche su topi e nella manipolazione del tessuto polmonare.
- Necessita di attrezzature specializzate per la fissazione in grado di mantenere una pressione costante.
- Richiede una standardizzazione tra i gruppi di ricerca dei parametri di fissazione per garantire la riproducibilità.
- È adattabile a diversi agenti di fissazione in base ai requisiti sperimentali.
- Deve prevedere protocolli di sicurezza per la manipolazione di agenti di fissazione pericolosi.
