Name: Fissazione polmonare sotto pressione costante per la valutazione dellenfisema nei topi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 48 s
Description: Impara la fissazione polmonare a pressione costante per valutare l'enfisema nei topi. Questo metodo consente di fissare più campioni contemporaneamente mantenendo l'inflazione e garantendo una qualità istologica ottimale per l'analisi morfometrica.

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Questo lavoro è stato supportato in parte da JSPS KAKENHI Grant Number 26461199 (T. Sato) e dall'Institute for Environmental and Gender-Specific Medicine, Juntendo University Graduate School of Medicine, Grant Number E2920 (T. Sato). Il fingeto non ha avuto alcun ruolo nella progettazione dei metodi attuali e nella scrittura del manoscritto.

I seguenti metodi sono stati approvati dai comitati per la cura e l'uso degli animali della Juntendo University School of Medicine. Sono state seguite le Linee guida per la corretta condotta degli esperimenti sugli animali, Science Council of Japan, 1 giugno 2006. Ci sono tre passaggi principali in questo metodo: 1) dissezione del topo, 2) essanguinazione polmonare, e 3) fissazione dei tessuti polmonari assistiti da attrezzature specializzate. Tipicamente, i campioni polmonari vengono elaborati all'incorporamento dopo 48 h di fissazione12,15,16,17,18.
1. Dissezione del mouse
<ol><li>Misurare il peso corporeo del mouse, quindi determinare la quantità di pentobarbital da amministrare.</li>
	<li>Iniettare pentobarbital intraperitonealmente ad un dosaggio di 70 mg/kg di peso corporeo e confermare l'anestesia per l'assenza di reazione al pizzico dei dei dei dei dei dei dei dei pipi'.</li>
	<li>Iniettare l'ago con un angolo di 45 gradi fino a penetrare nella pelle e nel muscolo. Disegnare lo stantuffo e confermare un vuoto d'aria, quindi iniettare il pentobarbital.</li>
	<li>Confermare l'anestesia per assenza di movimento riflesso. NOTA: L'uso di un topo anestetizzato al contrario di un topo eutanasia è raccomandato per una essanguinazione completamente polmonare.</li>
	<li>Tagliare la pelle del topo e il muscolo addominale alla linea mediale, puntando all'area cefalica.</li>
	<li>Tagliare lateralmente per fornire uno spazio di lavoro più ampio.</li>
</ol>2. Essanguinazione polmonare
<ol><li>Esporre lo strato diaframma e forarlo con pinze.</li>
	<li>Aprire lo spazio toracico e tagliare l'area sternale, permettendo ai polmoni e al cuore di essere visti chiaramente.</li>
	<li>Tagliare il cuore nell'atrio sinistro e nel ventricolo destro.</li>
	<li>Inserire una cannula (24 G) nell'area ventricale destra e dirigerla verso l'area cefalica fino a raggiungere l'arteria polmonare, come mostrato nella Figura 1.</li>
	<li>Accendere la pompa e lasciare che la salina 1x tampone fosfato (PBS) circoli (circa 200 mL/h) fino a quando tutto il tessuto polmonare cambia in un colore bianco.</li>
</ol>3. Fissazione del tessuto polmonare
<ol><li>Rimuovere la trachea, i polmoni e il cuore.</li>
	<li>Liberare tutti e tre gli organi tagliando i tessuti connettivi circostanti.</li>
	<li>Legare il giusto bronco principale con un filo di sutura e tagliare tutti i lobi del polmone destro.</li>
	<li>(Facoltativo): i lobi del polmone destro sono costituiti da quattro parti. Tagliare queste parti dal bronco principale destro e dividere le parti per la lavorazione come campioni di tessuto congelato.</li>
	<li>Inserire il cuore e i lobi del polmone sinistro negli agenti di fissaggio, situati all'interno di una siringa da 10 mL. AVVISO: gli agenti di fissaggio sono pericolosi. Indossare attrezzature protettive adeguate (ad esempio, guanti di gomma lunghi) e lavorare in una stanza ben ventilata.</li>
	<li>Creare una condizione di vuoto utilizzando una siringa da 10 mL per gonfiare il polmone, come illustrato nella Figura 2.</li>
	<li>Inserire una cannula (20 G) nella trachea e legare un nodo.</li>
	<li>Gonfiare il polmone con agenti di fissaggio per verificare con eventuali perdite, utilizzando una siringa da 1 mL.</li>
	<li>Trasferimento alle apparecchiature di pressione per la fissazione polmonare, come illustrato nella figura 3.</li>
	<li>Dopo i periodi di fissaggio, rimuovere il campione polmonare legando la trachea con un nodo.</li>
</ol>

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<li>Stevenson, C. S., Birrell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moving+towards+a+new+generation+of+animal+models+for+asthma+and+COPD+with+improved+clinical+relevance%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Moving towards a new generation of animal models for asthma and COPD with improved clinical relevance.</a> Pharmacology and Therapeutics. 130 (2), 93-105 (2011).</li>
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<li>Laucho-Contreras, M. E., Taylor, K. L., Mahadeva, R., Boukedes, S. S., Owen, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+measurement+of+pulmonary+emphysema+and+small+airway+remodeling+in+cigarette+smoke-exposed+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Automated measurement of pulmonary emphysema and small airway remodeling in cigarette smoke-exposed mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (95), 52236(2015).</li>
<li>Nakanishi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clarithromycin+prevents+smoke-induced+emphysema+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Clarithromycin prevents smoke-induced emphysema in mice.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 179 (4), 271-278 (2009).</li>
<li>Maeno, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%2B+T+Cells+are+required+for+inflammation+and+destruction+in+cigarette+smoke-induced+emphysema+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">CD8+ T Cells are required for inflammation and destruction in cigarette smoke-induced emphysema in mice.</a> Journal of Immunology. 178 (12), 8090-8096 (2007).</li>
<li>Sato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+fixation+for+total+preanalytic+phase+evaluation+in+pathology+laboratories%3A+a+comprehensive+study+including+immunohistochemistry%2C+DNA%2C+and+mRNA+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Pathology+International%22%5BJournal%5D)">Optimal fixation for total preanalytic phase evaluation in pathology laboratories: a comprehensive study including immunohistochemistry, DNA, and mRNA assays.</a> Pathology International. 64 (5), 209-216 (2014).</li>
</ol>

Gli autori non hanno interessi contradditori da dichiarare.

La procedura di fissazione per i polmoni dei roditori qui presentata non è una novità; tuttavia, questo sistema ha diversi vantaggi. In primo luogo, può fissare molti polmoni (massimo 20) con la stessa condizione in una sola volta. La Società di Patologia Tossicologica afferma che la pressione per l'instillazione gravitazionale varia da 22 a 25 cmH2O22. In particolare, diversi studi hanno eseguito fissazione polmonare ad una pressione di 25 cmH2O13<sup...

La BPCO è una delle principali cause di morte a livello mondiale1. Il fumo di sigaretta è la causa più importante della BPCO, ma i meccanismi di patogenesi rimangono incompleti. La BPCO dimostra due caratteristiche principali, tra cui la progressiva limitazione del flusso d'aria e una risposta infiammatoria anormale del polmone. Il disturbo dell'insensato si verifica frequentemente nei polmoni dei pazienti affetti da BPCO2. I risultati patologici dell'enfisema sono caratterizzati dalla distruzione della parete alveolare3. Diverse specie animali sono state utilizzate per generare modelli di BPCO in vivo (ad esempio cani, porcellini d'India, scimmie e roditori)4. Tuttavia, il mouse è diventato il più comunemente utilizzato nella costruzione di modelli di BPCO. Questo ha molti vantaggi, tra cui il suo basso costo, la capacità di essere geneticamente modificato, ampia disponibilità di informazioni genomiche, disponibilità di anticorpi, e la capacità di utilizzare una varietà di ceppi di topo5. Attualmente, non esiste un modello di mouse in grado di imitare tutte le caratteristiche della BPCO umana; pertanto, i singoli ricercatori devono scegliere quale modello è più adatto per la ricerca specifica sulla BPCO6. Il modello murino enfisematoso è uno dei molti modelli di topo BPCO attualmente disponibili. Altri modelli includono il modello del mouse di esacerbazione, il modello di co-morbidità sistemiche e il modello di suscettibilità della BPCO7.
Il modello murino enfisematoso può essere generato da diversi tipi di agenti esogeni, tra cui agenti chimici e esposizione al fumo di sigaretta4. L'esposizione chimica (ad esempio, per elastasi) produce un grave tipo di enfisema, mentre il fumo di sigaretta provoca un lieve enfisema8,9. Si ritiene che il fumo di sigaretta sia la causa principale della patogenesi della BPCO; pertanto, la scelta del fumo di sigaretta come mezzo per creare un modello di topo BPCO è ragionevole10. Molti studi hanno usato il fumo di sigaretta per creare enfisema nel mouse. Ad esempio, Nikula ealtri hanno creato con successo un modello di topo enfisematoso da topi femminili B6C3F1 esponendoli al fumo di sigaretta per 7 o 13 mesi11. Abbiamo anche stabilito un modello di topo enfisematoso tramite proteina marcatore di senescenza/topi SMP-30 KO12. È fondamentale eseguire un metodo di fissazione polmonare in grado di visualizzare correttamente questo modello di enfisema lieve dall'esposizione al fumo di sigaretta.
Sono stati stabiliti vari metodi per la fissazionepolmonare 13. Tuttavia, non esiste un metodo gold standard di fissazione del tessuto polmonare per la valutazione dell'enfisema14. Diversi studi di questo laboratorio hanno dimostrato che il sistema di fissazione qui presentato è utile creando una condizione stabile per la valutazione dell'enfisema12,15,16,17,18. Il vantaggio principale del sistema attuale è che può fissare molti polmoni con la stessa condizione in una sola volta senza collasso polmonare o deflazione. L'attuale sistema di fissazione polmonare utilizza alcune attrezzature speciali che consentono ai campioni polmonari di essere gonfiati ad una pressione costante appropriata per un determinato periodo. Questa attrezzatura speciale è composta da tre parti, tra cui un contenitore inferiore, contenitore superiore e pompa. I campioni polmonari vengono collocati nel contenitore inferiore collegato agli agenti di fissaggio pressurizzati, determinando una differenza di pressione di 25 cmH2O nel livello degli agenti tra i contenitori superiore e inferiore19.

<table><tbody><tr><td>10% formalina (soluzione tampone neutra in formalina)</td><td>Wako</td><td>060-01667</td><td></td></tr><tr><td>Forcipe piegato</td><td>Hammacher</td><td>HSC187-11</td><td></td></tr><tr><td>Cannula, misura 20G</td><td>Cannula Terumo</td><td>SR-FS2032</td><td></td></tr><tr><td>, misura 22G</td><td>Cannula Terumo</td><td>SR-OT2225C</td><td>per dissanguare il polmone</td></tr><tr><td></td><td>Hammacher</td><td>HSC184-10</td><td></td></tr><tr><td>Kimtowel</td><td>Nippon Paper Crecia (Kimberly Clark)</td><td>61000</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Nippon Paper Crecia (Kimberly Clark)</td><td>62011</td><td></td></tr><tr><td>Contenitore inferiore (materiale in vetro acrilico)</td><td>Tokyo</td><td>Science Su misura</td><td>Componente per apparecchiature a pressione</td></tr><tr><td>Pompa a rulli</td><td>Nissin Scientific Corp</td><td>NRP-75</td><td>Pompa per dissanguare il polmone</td></tr><tr><td>Pompa a rulli RP-2000</td><td>Eyela (Tokyo Rikakikai Co. Ltd)</td><td>160200</td><td>Pompa per apparecchiature a pressione</td></tr><tr><td>Tubo in silicone e Oslash; 9 mm</td><td>Sansyo</td><td>94-0479</td><td>Componente per apparecchiature a pressione</td></tr><tr><td>Somnopentyl (64,8 mg/mL)</td><td>Kyoritsu Seiyaku</td><td>SOM02-YA1312</td><td>Pentobarbital Sodio</td></tr><tr><td>Forbice chirurgica</td><td>Hammacher</td><td>HSB014-11</td><td></td></tr><tr><td>Filettatura di sutura, misura 0</td><td>Nescosuture</td><td>GA01SW</td><td></td></tr><tr><td>Siringa, 1 mL</td> Siringa <td>Terumo</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>, 1 ml con ago</td><td>Siringa Terumo</td><td>SS-01T2613S</td><td></td></tr><tr><td>, 10 mL</td><td>Terumo</td><td>SS-10ESZ</td><td></td></tr><tr><td>Rubinetto a tre vie</td><td>Terumo</td><td>TS-TR1K01</td><td></td></tr><tr><td>Contenitore superiore (materiale in vetro acrilico)</td><td>Tokyo Science</td><td>Componente per apparecchiature a pressione</td> <td>su misura</td></tr></tbody></table>

fissazione polmonare sotto pressione costante per la valutazione dell'enfisema nei topi

Lung Fixation under Constant Pressure for Evaluation of Emphysema in Mice

L'enfisema è una caratteristica significativa della broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO). Gli studi che coinvolgono un modello murino enfisematoso richiedono una fissazione polmonare ottimale per produrre campioni istologici affidabili del polmone. A causa della natura della composizione strutturale del polmone, che consiste in gran parte di aria e tessuto, c'è il rischio che collassi o si sgonfi durante il processo di fissazione. Esistono vari metodi di fissaggio polmonare, ognuno dei quali ha i propri vantaggi e svantaggi. Il metodo di fissazione polmonare qui presentato utilizza una pressione costante per consentire una valutazione ottimale dei tessuti per gli studi che utilizzano un modello polmonare di topo infisematoso. Il vantaggio principale è che può fissare molti polmoni con la stessa condizione in una sola volta. Gli esemplari polmonari sono ottenuti da topi cronici esposti al fumo di sigaretta. La fissazione polmonare viene eseguita utilizzando apparecchiature specializzate che consentono la produzione di pressione costante. Questa pressione costante mantiene il polmone in uno stato ragionevolmente gonfiato. Così, questo metodo genera un esemplare istologico del polmone che è adatto per valutare il fumo di sigaretta indotta enfisema lieve.

Come descritto in precedenza, l'apparecchiatura specializzata, che genera una pressione costante estesa, può essere suddivisa in tre parti (Figura 3A). La parte inferiore è il punto in cui inserire il campione polmonare (Figura 4A). Il polmone è collegato tramite una cannula (20 G) alla punta del flusso di formalina utilizzando un cazzo di arresto a tre vie (Figura 4B). La pressione...

Presentato qui è un protocollo utile per la fissazione polmonare che crea una condizione stabile per la valutazione istologica di campioni polmonari da un modello murino di enfisema. Il vantaggio principale di questo modello è che può fissare molti polmoni con la stessa pressione costante senza collasso polmonare o deflazione.

Fissazione polmonare sotto pressione costante per la valutazione dell'enfisema nei topi

Emphysema is a significant feature of chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Studies involving an emphysematous mouse model require optimal lung ...

La pressione costante all'interno del dispositivo di fissazione mantiene i polmoni in uno stato ragionevolmente gonfiato generando un campione polmonare istologico adatto per valutare l'enfisema indotto dal fumo di sigaretta lieve. Il vantaggio principale di questo modello è che può riparare molti polmoni allo stesso tempo usando la stessa pressione costante senza collasso polmonare o deflazione. A dimostrare la procedura sarà Naoko Arano, uno studente laureato del mio laboratorio.Dopo aver confermato la mancanza di risposta al movimento riflesso, fai un'incisione nella pelle e nel tessuto muscolare lungo la linea mediale del topo, mirando alla regione cefalica, e taglia lateralmente per creare uno spazio di lavoro più ampio. Dopo aver esposto lo strato diaframma perforare il tessuto con pinza e aprire lo spazio toracico. Tagliare l'area sternale permettendo di visualizzare i polmoni e il cuore.E tagliare l'atrio sinistro e il ventricolo destro. Inserire una cannula calibro 24 collegata a una pompa perfusione nella zona del ventricolo destro e dirigere la cannula verso l'area cefalica fino a raggiungere l'arteria polmonare. Quindi, accendere la pompa e perfondere il tessuto con cir

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Pressione di ventilazione controllata per indurre lesioni polmonari acute nei topi

Il presente protocollo fornisce una dettagliata descrizione passo-passo le procedure necessarie per eseguire le misurazioni della meccanica del sistema respiratorio, nonché la valutazione della reattività delle vie aeree alla metacolina inalata nei topi usando la tecnica delle oscillazioni forzate (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, Qc , Canada).

Valutazione della Meccanica Respiratoria sistema nei topi utilizzando la tecnica delle oscillazioni forzate

L'obiettivo di questo protocollo è fornire metodi automatizzati per quantificare le patologie polmonari croniche in un modello murino di BPCO. Il protocollo include l'esposizione dei topi al fumo di sigaretta (CS), la misurazione della funzione polmonare, il gonfiaggio dei polmoni e l'utilizzo di metodi morfometrici per misurare l'enfisema e il rimodellamento delle piccole vie aeree nei topi.

Misurazione automatica di enfisema polmonare e piccole vie aeree ritocca in sigaretta Mice-fumo esposti

Qui presentiamo un protocollo per misurare in modo semplice e affidabile la curva pressione-volume polmonare nei topi, dimostrando che è sufficientemente sensibile per rilevare cambiamenti parenchimali fenotipici in due patologie polmonari comuni, la fibrosi polmonare e l'enfisema. Questa metrica fornisce un mezzo per quantificare i cambiamenti strutturali del polmone con lo sviluppo della patologia.

Misura della curva di pressione-volume in mouse polmoni

L'obiettivo di questo lavoro è quello di descrivere i metodi semplici che sarà di grande aiuto nella messa a punto e l'analisi dei polmoni del mouse con cancro ai polmoni o altre patologie. Vi presentiamo 3 protocolli modo semplice e affidabile per effettuare instillazioni polmone, la fissazione, e misurazioni del volume polmonare.

Instillazione e fissaggio Metodi utili in mouse Lung Cancer Research

Questo studio descrive la generazione di successo di un nuovo modello animale di malattia polmonare ostruttiva cronica (COPD) esponendo ripetutamente topi ad alte concentrazioni di ozono.

Generazione di un modello di malattia polmonare ostruttiva cronica nei topi da esposizione ripetuta dell'ozono

La superficie interna polmonare (ISA) è un criterio critico per valutare la morfologia polmonare e la fisiologia delle malattie polmonari e della rigenerazione alveolare indotta da lesioni. Qui descriviamo un metodo standardizzato che può ridurre al minimo la polarizzazione di misura per ISA sia nei modelli di polmonite polmonare sia nei modelli di protesi.

Un metodo standardizzato per la misurazione della superficie interna polmonare tramite la polmonite e l&#39;impianto di protesi

Lo scopo di questo metodo è quello di presentare un metodo semplice ed efficiente per la perfusione, l'inflazione e la fissazione dei polmoni del topo per l'esame della patologia tumorale polmonare e la valutazione delle metastasi al polmone.

Perfusione e inflazione del polmone del topo per l'istologia tumorale

Qui, presentiamo un protocollo per utilizzare la tomografia micro-computerizzata (micro-CT) per quantificare le regioni ventilate in un modello di fibrosi polmonare indotta da bleomicina unilaterale tramite instillazione intratracheale sul lato lesionale.

Analisi unilaterale del volume polmonare mediante micro-CT per una valutazione avanzata della fibrosi polmonare in modelli preclinici

Il nuovo protocollo riportato nel presente studio permette la rilevazione selettiva delle metastasi polmonari con una risoluzione singola cellula nei topi...

Una migliore visualizzazione delle metastasi polmonari a risoluzione singola cella in Mouse di combinata<em&gt; In-situ</emPerfusione&gt; del tessuto polmonare e X-Gal colorazione del<em&gt; LacZ</em&gt;-Tagged cellule tumorali

Impara la fissazione polmonare a pressione costante per valutare l'enfisema nei topi. Questo metodo consente di fissare più campioni contemporaneamente mantenendo l'inflazione e garantendo una qualità istologica ottimale per l'analisi morfometrica.

Fissazione polmonare sotto pressione costante per la valutazione dell'enfisema nei topi

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