Sintesi, caratterizzazione e applicazione di nanosondanti di ossido di ferro superparamagnetico per il rilevamento della tubercolosi extrapolmonare

A livello globale, la diagnosi di tubercolosi extrapolmonare è spesso ritardata, in quanto richiede un intervento chirurgico per la conferma a causa di presentazioni cliniche non specifiche e di scarse prestazioni nei test diagnostici. Per migliorare i test diagnostici sierologici per gli antigeni Mycobacterium tuberculosis, abbiamo sviluppato nanoprobenne di ossido di ferro super-paramagnetico per rilevare la tubercolosi extrapolmonare. Le nanoprobiche TB-SPIO possono fornire precise immagini di risonanza magnetica a basse concentrazioni a causa delle loro proprietà paramagnetiche senza indurre alcuna risposta autoimmune.

Le nanoprobenne TB-SPIO consentono il targeting e il rilevamento dell'infezione da tubercolosi di Mycobacterium. Possono anche essere applicati come agente di contrasto per la risonanza teste per l'individuazione di altre malattie. Assicurati di studiare attentamente il protocollo prima di tentare il protocollo, poiché ogni parte dell'esperimento utilizza una tecnologia di base specifica.

La dimostrazione visiva del metodo può aiutare gli alunni a capire come implementare il processo, specialmente per alcuni degli esperimenti più complicati. Per preparare nanoparticelle magnetiche di ossido di ferro rivestite di dextran, combinare vigorosamente cinque millilitri di dextran T40 con 45 milligrammi di cloruro ferrico acquoso esaidrato e 32 milligrammi di soluzioni di tetraidrato di cloruro ferroso a temperatura ambiente. Aggiungere rapidamente 10 millilitri di idrossido di ammonio e utilizzare una barra di agitazione per mescolare la sospensione nera risultante per un'ora a temperatura ambiente.

Al termine dell'incubazione di agitazione, centrifugare la soluzione e rimuovere gli aggregati. Per separare i prodotti SPIO finali dal Dextran T40 non legato, caricare l'intera miscela di reazione di cinque millilitri in una colonna cromatografica di filtrazione del gel di 2,5 per 33 centimetri ed elutare il dextran con 0,1 molare di acetato di sodio e 0,15 molare di soluzione tampone di cloruro di sodio. Quindi, raccogliere le nanoparticelle magnetiche di ossido di ferro rivestite di dextran purificate nel volume del vuoto e saggiare gli eluati della colonna per ferro ed estran a 330 e 490 nanometri secondo protocolli standard.

Per creare anticorpi superficiali Mycobacterium tuberculosis coniugati con SPIO, sintetizzare prima l'anidride spio-edbe-succinica mescolando 10 millilitri di una soluzione alcalina di SPIO-EBDE con un grammo di anidride succinica per 24 ore a temperatura ambiente. Il giorno successivo, utilizzare da 12.000 a 4.000 tubi molecolari a membrana porosa tagliati a peso molecolare per dializzare la soluzione con cambi di 26 ore di due litri di acqua distillata per cambio. Dopo l'ultima modifica, aggiungere 100 microlitri della soluzione risultante a 400 microlitri di 4,5 milligrammi per millilitri TB anticorpo superficiale, seguito dall'aggiunta di 1-idrossibenzotriazolo e benzotriazolo-1-yloxy tripyrrolidinofosphonium esafluorofosfato come catalizzatori a temperatura ambiente per 24 ore con agitazione.

Separare le soluzioni dall'anticorpo non legato attraverso la cromatografia di filtrazione del gel utilizzando PBS come tampone. Per determinare la dimensione media delle particelle, la morfologia e la distribuzione delle dimensioni, far cadere la dispersione composita su una griglia di rame a 200 maglie e asciugare ad aria il campione a temperatura ambiente prima di caricare su un microscopio elettronico a trasmissione per l'imaging a 100 kilovolt. Per misurare i valori del tempo di rilassamento delle nanoprobe, usate un rilassantometro a risonanza magnetica nucleare a 20 megahertz e 37 gradi Celsius più o meno un grado.

Per l'imaging cellulare pulsato con nanosoperforma, coltivare prima monociti THP-1 umani secondo protocolli standard di coltura cellulare. Quando le cellule hanno raggiunto lo stadio appropriato di attivazione, preincubare uno per 10 ai sette monociti con una per 10 alla sesta unità di formazione della colonia di Mycobacterium bovis BCG per un'ora. Al termine dell'incubazione, trasferire le cellule in tubi di microcentrifugo da un millilitro e aggiungere due millimolari di SPIO Mycobacterium tuberculosis nanoprobes coniugate con anticorpi superficiali a ciascun tubo per un'incubazione di un'ora a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.

Al termine dell'incubazione, raccogliere le cellule mediante centrifugazione e rimosogliere il pellet in 200 microlitri di mezzo fresco. Quindi, scansionare i campioni usando una sequenza di impulsi eco gradiente veloce attraverso la risonanza magnetica 3.0-T per determinare la specificità e la sensibilità delle nanoprobe. Per inoculare animali da esperimento con M.bovis BCG, ricostituire prima il vaccino licofilizzato o lo stock batterico nel mezzo di Sauton e diluire la soluzione di stock ricostituita con soluzione salina.

Successivamente, caricare 100 microlitri della soluzione in una siringa da un millilitro per animale e iniettare l'intero volume di batteri intradermally nella pelle scapolare dorsale sinistra o destra di ciascun topo. Per la risonanza magnetica in vivo di animali vivi iniettati da nanoprobe, acquisire immagini di spin-eco veloce ponderate T2 di ciascun animale sperimentale anestetizzato prima di iniettare due nanomolari di sonde anticorpali SPIO-TB sospese in 200 microlitri di soluzione salina nella vena di coda di ciascun topo. Quindi, immagine degli animali immediatamente dopo l'iniezione e ogni cinque minuti per i successivi 30 minuti.

Al termine della sessione di imaging, analizzare quantitativamente tutte le immagini di risonanza magnetica utilizzando l'intensità del segnale come misura delle regioni definite di interesse in posizioni comparabili di un centro granuloma M.tuberculosis e del muscolo posteriore adiacente a un'area granulomatica. Quindi, utilizzare la formula per calcolare i miglioramenti relativi del segnale utilizzando la misurazione dell'intensità del segnale prima e da zero a tre ore dopo l'iniezione degli agenti di contrasto. Un mese dopo l'inoculazione, raccogliere il tessuto dal sito di inoculazione intradermica di ogni animale e macchiare le macchie di paraffina fissa formalina da cinque a 10 micrometri di spessore con ematossilina ed eosina, macchie di Ziehl-Neelsen per i batteri acido-veloci e blu di Berlino per il ferro ferrico.

L'imaging a microscopia elettronica a trasmissione delle nanoprobe anticorpali superficiali SPIO-TB rivela che le nanoprobe mostrano un aspetto ben disperso con una dimensione media di 3,8 più o meno 0,4 nanometri per nucleo. M.bovis BCG e ceppo batterico acido-veloce possono essere rilevati attraverso la colorazione Ziehl-Neelsen. Dopo l'isolamento e la coltura con sonde contenenti ferro ferrico, i batteri possono essere identificati attraverso la colorazione blu di Berlino.

Il grado di puntamento della TBC delle nanoprobe anticorpali superficiali SPIO-TB può essere determinato attraverso la risonanza magnetica ponderata T2 come indicato da una diminuzione dell'intensità del segnale in presenza delle nanoprobe che si verifica in modo dipendente dalla concentrazione. Negli animali iniettati da nanoprobe, il miglioramento ponderato T2 della riduzione del segnale nelle aree di M.tuberculosis granulomatis è circa 14 volte superiore a quello dei siti di controllo. Un mese dopo l'infezione, un granuloma sottocutaneo organizzato può essere osservato nei topi C57 black 6 iniettati con nanoprobe con nuova vascolarizzazione del sangue e aggregati di macrofagi linfociti ed epitelioidi noti all'interno di queste lesioni.

L'espressione positiva di M.tuberculosis si osserva anche nelle aree granulomatose con bacilli acido-veloci che macchiano positivi nel sito di lesione. Il blu di Berlino, una macchia positiva in ferro ferrico, può anche essere usato per determinare la sensibilità delle sonde alla TBC. Per l'immagine di risonanza magnetica in vivo della vita, gli animali iniettati da nanoprobe acquisiscono l'immagine di spin-echo veloce ponderata in T2 di ogni animale sperimentale anestetizzato prima di iniettare le sonde anticorpali SPIO-TB. Ora che abbiamo stabilito la tecnica SOP per rilevare la tubercolosi extrapolmonare, questi anticorpi possono essere usati per diagnosticare specificamente la tubercolosi extrapolmonare.