Name: Transdermico misurazione del tasso di filtrazione glomerulare in topi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Impara la misurazione transdermica del tasso di filtrazione glomerulare in topi coscienti con monitoraggio FITC-sinistrin. Questo metodo minimamente invasivo offre valutazione accurata della funzione renale ripetibile nel tempo.

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Quest'opera è stata sostenuta dal centro del Vanderbilt per la malattia del rene (VCKD) ed è stato in parte finanziata le seguenti sovvenzioni: DOD PR161028 e R01DK112688 (Mark de Caestecker)
Riconosciamo il supporto a LS, PM e BW dal MRC, EPSRC e BBSRC piattaforma finanziata dall'UK rigenerativa medicina "Sicurezza ed efficacia, concentrandosi su Imaging Technologies Hub" (MR/K026739/1).

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati realizzati conformemente agli orientamenti locali nel Regno Unito e Stati Uniti. Esperimenti condotti presso l'Università di Liverpool sono stati eseguiti sotto una licenza conferita ai sensi della legge di animali (procedure scientifiche) UK 1986 e sono stati approvati dal comitato di etica Università di Liverpool. Tutti gli esperimenti su animali condotti presso la Vanderbilt University Medical Center sono stati approvati dal comitato di uso e cura degli animali istituzionale di Vanderbilt.
1. preparare la FITC-sinistrin
<ol><li>Preparare FITC-sinistrin 40 mg/mL in tampone fosfato salino (PBS). Nota: Aliquote possono essere conservate a-20 ° C per diversi mesi con nessuna diminuzione notevole nella qualità; Tuttavia dovrebbero essere evitati più cicli di gelo-disgelo. FITC-sinistrin è sensibile alla luce - tenere il tubo al riparo dalla luce.</li>
	<li>Calcolare il volume di FITC-sinistrin necessaria per ogni mouse:<ol>
<li>Pesare ogni mouse ogni giorno di misura.</li>
		<li>La dose raccomandata è di 0,15 mg FITC-sinistrin per grammo di peso corporeo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. preparazione di Mouse
<ol><li>Preparare le gabbie separate per i topi mentre sottoposti a misure di GFR. Forniscono gli asciugamani di carta assorbente e pochi pellets di cibo.</li>
</ol>3. rimozione dei peli dal Mouse (1-2 giorni prima della misura di GFR)
<ol><li>Anestetizzare il mouse con isoflurano 3% e una volta che il mouse è addormentato, mantenere l'anestesia con isoflurano 1,5 – 2%, a seconda del tasso di respirazione del mouse. Posizionare il mouse incline su una piastra di calore.</li>
	<li>Utilizzare un rasoio elettrico, andando contro la direzione del pelo, per rimuovere la maggior parte della pelliccia da un lato della parte posteriore del mouse. La barba dalla parte superiore delle zampe posteriori fino al collo e attraverso le costole.</li>
	<li>Applicare uno strato sottile di Crema depilazione dell'area rasata usando un batuffolo di cotone (Figura 1A). Spostare il batuffolo di cotone contro la direzione della pelliccia per garantire che la crema viene applicata più vicino alla pelle possibile.</li>
	<li>Rimuovere la crema dopo 1 – 3 min da lavare via con acqua tiepida e tamponi di cotone. Non eseguire la misurazione se la pelle appare molto rossa e irritata dopo la misurazione e non ripetere depilazione entro 72h per evitare di danneggiare la pelle.</li>
</ol>4. preparazione del Monitor GFR transdermico
<ol><li>Utilizzare una delle due dimensioni delle patch disponibili. Il primo è 2,5 x 3 cm2 dimensioni e può essere utilizzato direttamente per le misurazioni in topi. Le altre patch sono 6 x 3 cm2 dimensioni e sono destinate ad essere utilizzati nei ratti o animali più grandi, ma possono essere tagliate a una dimensione inferiore per uso in topi.</li>
	<li>Staccare il rivestimento un lato della patch e attaccare il dispositivo GFR sul lato adesivo, i LED di posizionamento esattamente sopra la finestra trasparente.</li>
	<li>Tagliare il cerotto adesivo in eccesso per adattarsi alle dimensioni della batteria e attaccare un lato della patch alla batteria.</li>
</ol>5. fissaggio del Monitor GFR transdermico
<ol><li>Anestetizzare il mouse con isoflurano come descritto al punto 3.1 e posizionare il mouse incline su una piastra di calore. Anestetizzare topi solo per il posizionamento del monitor transcutaneo GFR e iniezione di FITC-sinistrin; garantiscono il recupero dall'anestesia per la misurazione del decadimento FITC.</li>
	<li>Pulire la pelle pre-rasata con etanolo al 70%. Mettere circa 12 cm di nastro di seta ipoallergenico sotto il mouse (Figura 1B; la larghezza del nastro deve essere ridotto a 1,5-2 cm in modo che non è troppo ampia per il mouse).</li>
	<li>Posizionare il nastro in modo che è solo circa 2 cm sul lato destro del mouse, e il resto è sulla sinistra. Piegare su un bordo del lato destro del nastro per il facile posizionamento e rimozione dopo la misurazione. Le istruzioni di sinistra-destra ai punti 5.3 e 5.6 sono per il posizionamento del dispositivo sul lato destro dell'animale e possono essere scambiate per il posizionamento del dispositivo sul lato sinistro dell'animale, se necessario.</li>
	<li>Collegare la batteria al dispositivo, rimuovere la protezione dalla batteria e posizionarlo saldamente sopra il dispositivo. Il dispositivo è pronto all'uso e acquisizione dati inizia quando i blu diodi emettitori di luce (LED) iniziano a lampeggiare.</li>
	<li>Rimuovere il rivestimento dal dispositivo e posizionare sulla pelle rasata. Posizionare il dispositivo in modo che la finestra esponendo i LED è sopra le costole – non è troppo vicino alla colonna vertebrale o degli arti (Figura 1).</li>
	<li>Fissare il dispositivo con il nastro bianco. Fissare il lato destro prima (Figura 1), avvolgendolo strettamente intorno a tutti i bordi del dispositivo, quindi avvolgere il lato sinistro intorno il mouse e il dispositivo (Figura 1E). Idealmente, il lato sinistro del nastro copre solo il dispositivo, e il lato destro finisce sotto l'addome del mouse.</li>
	<li>Fissate il nastro premendo lungo la circonferenza del corpo del mouse. Il nastro deve essere fissato saldamente, ma non strettamente. Se è troppo largo quindi il dispositivo si muoverà intorno troppo e causare artefatti di movimento. Tuttavia, non dovrebbe essere così stretto che limita la respirazione o movimento o mette troppa pressione sulla pelle.</li>
	<li>Lasciare invariato il dispositivo per 3 minuti prima dell'iniezione di FITC-sinistrin per consentire uno sfondo costante lettura per essere preso. In questo tempo, caldo la coda con un termoforo o guanto riempito con acqua calda per preparare per iniezione della vena della coda (se si utilizza questa rotta).</li>
</ol>6. FITC-sinistrin iniezione
<ol><li>Preparare una siringa da insulina con la quantità calcolata di FITC-sinistrin necessaria per l'iniezione (questo può essere arrotondato alla più vicina 10 μL).</li>
	<li>Amministrare FITC-sinistrin vena caudale o iniezione retro-orbitale. FITC-sinistrin deve essere somministrato in un bolo liscio ma rapido per evitare picchi multipli sulla curva di liquidazione. È preferibile somministrare solo una dose parziale di to hanno molteplici tentativi di amministrare la FITC-sinistrin.</li>
</ol>7. misurazione del GFR
<ol><li>Posizionare il mouse in una gabbia sul proprio per il recupero dall'anestesia isoflurano e per tutta la durata del periodo di misurazione.</li>
	<li>Osservare il mouse nella gabbia per 1,5 h e quindi rimuovere il dispositivo. Rimozione del dispositivo dal mouse cosciente è veloce, efficiente e generalmente ben tollerato dal mouse, ma nuovi utenti potrebbero preferire anestetizzare il mouse per questo passaggio.<ol>
<li>Come un'opzione, anestetizzare il mouse con isoflurano.</li>
		<li>Come l'altra opzione, è possibile posizionare il mouse sopra la griglia sopra la gabbia, permettendo il mouse per afferrare le barre di metallo, mentre il dispositivo viene rimosso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Togliere il nastro di intonaco bianco da sotto la pancia con un movimento rapido, liscio e rimuovere il dispositivo e gesso nero dalla pelle. Fare attenzione che la batteria non si disconnette dal dispositivo ancora.</li>
	<li>Tornare il mouse alla sua gabbia a casa.</li>
</ol>8. lettura e valutazione dei dati
<ol><li>Staccare con cautela la batteria dal dispositivo</li>
	<li>Collegare il dispositivo al cavo USB e quindi collegare il cavo al computer</li>
	<li>Aprire il software di lettura (Sensor_ctrl_app.exe)</li>
	<li>In ordine, fare clic su "connect", "leggere", "re-name" e "Salva", quindi chiudere il programma</li>
	<li>Elaborare e valutare i dati nel software di analisi come descritto nel rispettivo manuale</li>
</ol>

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<li>MediBeacon. Related Publications. , Available from:
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<li>Qi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+determination+of+glomerular+filtration+rate+in+conscious+mice+using+FITC-inulin+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Serial determination of glomerular filtration rate in conscious mice using FITC-inulin clearance.</a> American Journal of Physiology - Renal Physiology. 286 (3), F590-F596 (2004).</li>
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</ol>

D S-K, JF e YS sono dipendenti alle MediBeacon GmbH il produttore e distributore del monitor transcutaneo GFR. D S-K e JF sono inventori su brevetti e domande di brevetto per la tecnologia presentata.

Questo manoscritto e il video di formazione accompagnamento forniscono orientamenti pratici per l'uso di transdermal GFR monitor nei topi. I passaggi più critici nella procedura sono il fissaggio corretto del dispositivo sulla schiena dell'animale e in modo sicuro avvolgere il nastro intorno all'addome. La posizione migliore è leggermente o a sinistra della linea mediana, sopra la gabbia toracica. La patch e il dispositivo devono essere saldamente attaccati alla pelle, ma non dovrebbero essere così stretti che limitare la respirazione, movimento, o influenzare la circolazione sanguigna della pelle sotto il dispositivo, come questo porterebbe a misurazioni difettose/imprecise. Inoltre, poiché il monitoraggio avviene in topi coscienti dopo hanno recuperato dall'anestesia, correggere il posizionamento del dispositivo da parte del corpo con la minima interferenza da risultati di movimento nelle misurazioni transdermico con piccoli artefatti di movimento. Per questo motivo, è importante che il dispositivo non è posizionato troppo vicino alla tomaia delle membra così che i topi possono muoversi liberamente le loro spalle.
È importante depilare i topi uno o due giorni prima della misura di GFR, come depilazione colpisce la misurazione della clearance di FITC-sinistrin, con dati preliminari indicanti che depilazione immediatamente prima della misurazione di transdermal GFR aumenta la emivita apparente di FITC-sinistrin. Il meccanismo per questo è sconosciuto. Pertanto, al fine di ottenere misure affidabili su più punti di tempo e tra esperimenti, si consiglia per depilare i topi in anticipo, per permettere alla pelle di recuperare da questo processo prima di procedere con le misurazioni di GFR. Depilazione crema non deve essere applicata nella stessa area della pelle entro 72 h di un'applicazione preventiva, per evitare danni chimici per la pelle. In molti casi, la ricrescita del pelo prende parecchi giorni o fino a una settimana, e così può essere facilmente evitato riapplicazione della depilazione crema entro 72 h.
Perché fino al 50% di siero creatinina viene escreto dalla sezione tubolare in topi13, e perché c'è aumentato riassorbimento di urea da tubuli renali quando i topi sono disidratati14, creatinina e BUN sono poveri indicatori della funzione renale. Tuttavia, a causa della loro convenienza, queste analisi continuano a essere usato come la principale misura della funzione renale negli studi preclinici di AKI e CKD in topi. Tuttavia, coerentemente con l'importante contributo della secrezione tubulare di escrezione della creatinina nei topi con normale o vicino a, la funzione renale normale13, creatinina del siero ha mostrato poca correlazione con FITC-sinistrin liquidazione al prezzo alto spazio (basso Half-Life FITC-sinistrin), che indica che la creatinina è una misura insensibile della funzione renale nei topi con danno renale lieve. Al contrario, mentre BUN correla bene con FITC-sinistrin liquidazione in topi con compromissione renale lieve, c'è scarsa correlazione tra liquidazione BUN e FITC-sinistrin in topi con più grave danno renale (alta FITC-sinistrin Half-Life). Questo è probabilmente causato da effetti di riassorbimento di urea associato a disidratazione in animali malati con insufficienza renale grave.
Dei principali vantaggi della misurazione transcutanea GFR, rispetto a tutti gli altri liquidazione bolo o tecniche di infusione costante per la misura di GFR, è che non richiede accuratamente temporizzate raccolte di sangue o nelle urine. Questi possono essere particolarmente impegnativi in topi che hanno volumi di sangue totale basso e l'uscita urinaria rispetto ai ratti. Inoltre, topi devono essere gestite solo per il fissaggio del dispositivo e iniezione, ma non per più venipunctures, come richiesto per bolo classica liquidazione esperimenti15. Inoltre, la durata dell'anestesia è breve, e come tale è possibile eseguire misurazioni ripetute in topi individuali nel corso del tempo. La frequenza alla quale le misure possono essere effettuate principalmente dipende lo stato di salute di topi, attitudine del ricercatore per iniezioni endovenose e normative istituzionali locali sulle sessioni di anestesia ripetuta. In topi sani, illesi, misurazioni di GFR transdermico possono essere eseguite giornalmente, con minima o no negativi effetti sul mouse. Tuttavia, feriti topi affetti da AKI o CKD sono improbabili da tollerare l'anestesia ripetute sessioni come pure i topi sani, e così dovrebbe essere ridotto la frequenza delle misurazioni.
La principale limitazione di misura di GFR transdermico, rispetto ai metodi di liquidazione del bolo per misurare il GFR nei topi è che la cinetica di escrezione sono misurati solo come cambiamento di intensità di fluorescenza relativa nel tempo e non come concentrazioni tracciante assoluta. Per questo motivo, è solo possibile misurare la costante di velocità del singolo decadimento esponenziale dell'escrezione cinetico, che è una stima molto vicina del GFR normalizzato su extracellulare del volume16. Per esprimere GFR in mL/min, volume extracellulare dell'animale deve essere stimata utilizzando un fattore di conversione che è stato stabilito in studi precedenti in cui erano misure simultanee di concentrazioni plasmatiche di FITC-sinistrin eseguito1. Tuttavia, questo fattore di conversione potrebbe non correttamente stimare volumi fluidi extracellulari ugualmente bene in tutti i topi, poiché il volume del liquido può essere influenzato da una varietà di fattori estranei, tra cui età, sesso, stato di idratazione (che può essere influenzato da chirurgica interventi come pure il danno renale) e17di peso. Tuttavia, a differenza del bolo metodo per valutare GFR nei topi di dosaggio, misurazione transcutanea di GFR è soggetto minore variabilità dipendente dall'operatore come non è influenzato da errori di dosaggio o da errori nella sincronizzazione delle raccolte di sangue.
Un'altra limitazione della tecnica di misurazione del GFR transcutanea è che turni segnale basale possono verificarsi nel corso della misurazione a causa di sbiancamento della pelle fluorofori e l'anestesia necessaria per dispositivo per iniezione di attaccamento e tracciante. Questa limitazione è stata indirizzata da Friedemann e colleghi mediante l'implementazione di un algoritmo di correzione3. L'implementazione di questo algoritmo ha condotto ad un miglioramento nella precisione della tecnica transdermica paragonabile ad una tecnica di infusione costante di valutazione del GFR.
Una domanda frequente è se la pigmentazione della pelle in diversi ceppi di topi diversi colpisce transdermico FITC-sinistrin liquidazione. La pigmentazione della pelle riduce l'intensità di segnale di FITC-sinistrin poiché pigmenti scuri assorbe l'eccitazione blu e il verde emissione segnali da FITC-sinistrin misure. Tuttavia, il tasso di escrezione di FITC-sinistrin è indipendente nel suo complesso l'intensità del segnale. Inoltre, mentre il segnale misurato è inferiore, il segnale di fondo è anche più basso in topi pigmentati. Poiché il segnale di fondo è una miscela di autofluorescenza di pelle fluorofori e riflessione della luce di eccitazione, abbiamo trovato che il rapporto di fondo-a-massimo segnale è paragonabile, o addirittura migliorate, in animali pigmentati. Inoltre, artefatti di movimento, che sono causati dall'esposizione della pelle circostante a luce riflessa, sono ridotti in topi pigmentati, poiché la luce riflessa è anche assorbita dalla pelle pigmentata.
In conclusione, la tecnica che abbiamo presentato permette la misura precisa della GFR in consapevole, liberi di muoversi topi di tutti i tipi di pelle. Come la tecnica è indipendente del prelievo di sangue, può essere utilizzato ripetutamente sull'animale stesso per osservazioni longitudinali nei modelli CKD, nonché per la misurazione di rapidi cambiamenti della GFR che si verificano dopo induzione di AKI.

L'uso di transcutanea GFR monitor nei topi in primo luogo è stato segnalato da Schreiber e colleghi nel 2012 ed è stato validato confrontando misure di GFR ottenute utilizzando questa tecnica, con i risultati ottenuti tramite la misura diretta della clearance del bolo FITC-sinistrin da campioni di sangue di serie1. Fin qui, ci sono stati 35 pubblicazioni peer-reviewed in cui transcutanea GFR monitor sono stati utilizzati nei ratti e nei topi (un elenco regolarmente aggiornato degli articoli di giornale e abstract di conferenze in cui è stato utilizzato il monitor GFR preclinico può essere trovato presso il MediBeacon sito Web2). Misurazioni di GFR transdermico nei ratti e nei topi è stato descritto in un certo numero di pubblicazioni1,3,4,5, e un video tutorial che dimostrano il suo uso nei ratti è stato pubblicato6. Tuttavia, la misura in topi presenta ulteriori sfide tecniche. Qui, forniamo la prima guida pratica dettagliata per l'utilizzo di monitor GFR transdermico in topi.
Ci sono una serie di motivi perché gli investigatori stanno iniziando a favorire l'utilizzo di monitor GFR transdermico per valutare la funzione renale nei modelli del roditore. Misurazione transcutanea della clearance di FITC-sinistrin ha dimostrato di fornire una misura più sensibile e accurata della funzione renale rispetto ai tradizionali parametri di funzione renale come siero della creatinina e sangue urea azoto (BUN)7, 8. Mediante l'implementazione di un algoritmo di valutazione migliore, Friedemann e colleghi hanno dimostrato che il sistema raggiunge una precisione paragonabile al gold standard, la tecnica dell'infusione costante per GFR misura3. Recenti studi hanno dimostrato anche analisi sequenziale utilizzando transcutanea GFR monitor può essere utilizzato per studiare i cambiamenti in anticipo nella funzione renale come pure il recupero funzionale dopo induzione di danno renale acuto (AKI) senza interferire con il sangue degli animali volume o emodinamica, poiché il test non richiede sequenziale sangue campionamento9,10. La capacità di misurare GFR con alta precisione e sensibilità ripetutamente nello stesso animale rende questa tecnica per una varietà di discipline di ricerca diversi. Transdermico GFR monitor sono stati utilizzati da aziende farmaceutiche per valutare la tossicità di nuovi composti, così come nelle Università per la ricerca di base e traslazionale.

<table><tbody><tr><td>Monitor GFR transdermico (viene fornito con 1 dispositivo, 2 batterie e 1 caricabatterie)</td><td>MediBeacon GmbH</td><td>TDM-MH001</td><td>Software di lettura: MPD Lab; Software di analisi: MPD Studio</td></tr><tr><td>Batterie aggiuntive</td><td>MediBeacon GmBH</td><td>PWR-BT0001</td><td></td></tr><tr><td>Cerotti di fissaggio</td><td>MediBeacon GmbH</td><td>piccolo: PTC-SM001; grande: PTC-LG001</td><td></td></tr><tr><td>FITC-sinistrin</td><td>MediBeacon GmbH</td><td>FTC-FS001</td><td></td></tr><tr><td>Nastro di seta ipoallergenico</td>, <td>ad es. Durapore (1538-2), Kendall (7138C) o Leukosilk (01032-00)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Camera per anestesia, isoflurano, ossigeno</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Termoforo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rasoio</td><td></td><td></td><td></td>elettrico</tr><tr><td>Crema depilatoria (depilazione<</td><td>em>es. Veet o Nair</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cotton fioc Cotton fiocs</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Timer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bilance 70</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>% salviette</td><td></td><td></td><td></td> all'etanolo</tr></tbody></table>

transdermico misurazione del tasso di filtrazione glomerulare in topi

Transdermal Measurement of Glomerular Filtration Rate in Mice

Transdermico analisi del tasso di filtrazione glomerulare (GFR) è una tecnica consolidata, che viene utilizzata per valutare la funzione renale in modelli di topo e di ratto di danno renale acuto e la malattia renale cronica. Il sistema di misura è costituito da un rivelatore a fluorescenza miniaturizzati che è direttamente collegato alla pelle sul retro degli animali coscienti, liberamente commoventi e misura la cinetica di escrezione del tracciante GFR esogeno, isotiocianato di fluorescina (FITC) sinistrin coniugato (un analogico di inulina). Questo sistema è stato descritto in dettaglio in ratti. Tuttavia, a causa della loro dimensione più piccola, misura della GFR transcutanea in topi presenta ulteriori sfide tecniche. In questo articolo forniamo dunque la prima guida pratica dettagliata per l'utilizzo di monitor GFR transdermico in topi sulla base dell'esperienza combinata di tre diversi investigatori che hanno suonato questo test nei topi un certo numero di anni.

In questa sezione vi presentiamo i risultati rappresentativi dell'uso del monitor transcutaneo GFR. Il monitor transcutaneo è stato utilizzato in una varietà di diversi ceppi di topi e modelli di AKI e CKD2.
Figura 2 Mostra rappresentante FITC-sinistrin liquidazione curve in topi BALB/c maschili, prima e dopo l'ischemia e riperfusione (IRI) con il nephrectomy controlaterale simultaneo. FITC-sinistrin scompare rapidamente dalla circolazione in topi sani (Figura 2A), ma la liquidazione è drammaticamente in ritardo in topi con AKI (Figura 2B, C). In topi con AKI molto grave, potrebbe non esserci alcun cambiamento nella fluorescenza FITC-sinistrin durante il periodo di misurazione di 90 minuti, che indica un'assenza completa di filtrazione glomerulare (Figura 2).
Misura di GFR transdermico è minimamente invasivo e può essere utilizzato per monitorare i cambiamenti nella funzione renale nei topi stessi su più punti di tempo. Figura 3 raffigura le modifiche della GFR determinato tramite le misure di liquidazione sequenziale transdermica FITC-sinistrin alla linea di base e 1, 2 e 4 giorni dopo l'induzione IRI (ischemia unilaterale con nefrectomia controlaterale simultaneo). I dati indicati includono Half-Life di FITC-sinistrin liquidazione (Figura 3A) e GFR (Figura 3B) calcolato dall'emivita di liquidazione FITC-sinistrin misurato, come descritto da Schreiber et al.1.
Nella Figura 4, malattia renale cronica (CKD) è stata indotta in topi BALB/c maschi eseguendo prolungata IRI unilaterale seguito dal nephrectomy controlaterale in ritardo, come descritto11. GFR è stato valutato da clearance transdermico FITC-sinistrin il giorno 26 dopo l'iniziale IRI. L'aumento nell'emivita di FITC-sinistrin (Figura 4A) e conseguenza la diminuzione della GFR (Figura 4B), indica la funzione renale alterata in questi topi. Questi dati dimostrano che la misurazione transcutanea di GFR può essere utilizzato per misurare i cambiamenti nella funzione renale nei topi con CKD.
Figura 5A Mostra che FITC-sinistrin Half-Life correla strettamente con la valutazione semi-quantitativa istologica della lesione tubolare sopra le misurazioni gamma completo di GFR nei topi illesi e nei topi con diversi livelli di gravità di AKI IRI-indotta. Al contrario, siero della creatinina e sangue dell'azoto ureico (BUN) hanno mostrato un positivo ma più debole correlazione con FITC-sinistrin clearance (figura 5B, C), che indica che le misure di GFR transcutanea forniscono una misura più affidabile di renale lesioni (segni di lesione tubolare) seguito indotta da IRI AKI rispetto sia della creatinina sierica o BUN.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58520/58520fig1.jpg"> Figura 1: collegare il monitor GFR transdermico. Fotografie di rimozione dei capelli (A), posizionamento del nastro sotto il mouse (B), il posizionamento del dispositivo sulla pelle (C) il mouse e fissare il dispositivo di avvolgimento del nastro intorno il mouse e il dispositivo (D-E), <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58520/58520fig1large.jpg" target="_blank">per favore clicca qui per Mostra una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58520/58520fig2.jpg"> Figura 2: esempio FITC-sinistrin curve di liquidazione in topi BALB/c maschi prima e dopo l'ischemia e riperfusione (IRI) con il nephrectomy controlaterale simultaneo. Curve di liquidazione al basale (A) e un giorno dopo chirurgia IRI (B) il mouse stesso, che indica la funzione renale in questo mouse alterata. (C) Clearance della curva da un mouse più gravemente ferito un giorno dopo l'intervento chirurgico IRI. Non c'era nessun gioco di FITC-sinistrin durante il periodo di misura, che indica l'indebolimento renale. Punti neri dati rappresentano dati grezzi, linee blu rappresentano la misura 3-vano e linee verdi rappresentano gli intervalli di confidenza del 95%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58520/58520fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58520/58520fig3.jpg"> Figura 3: 8-10 settimane di età di topi BALB/c maschio, ha subito l'ischemia unilaterale con nefrectomia controlaterale simultaneo (n = 5). GFR era valutati al basale e nei giorni 1, 2 e 4 dopo chirurgia e rispetto ai topi falsità-azionati di controllo (n = 5). FITC-sinistrin Half-Life in (A) è stato utilizzato, insieme con il peso corporeo dei topi, per calcolare il GFR (B). Punti dati rappresentano singoli animali e barre di errore rappresentano media e l'errore standard. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58520/58520fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58520/58520fig4.jpg"> Figura 4: età di topi BALB/c maschio 8-10 settimane ha subito ischemia unilaterale con nefrectomia controlaterale in ritardo al giorno 8 (n = 5). GFR è stata valutata tramite il giorno 26 e venivano paragonati ai topi sani di pari età di controllo (n = 5). FITC-sinistrin Half-Life in (A) è stato utilizzato, insieme con il peso corporeo dei topi, per calcolare il GFR (B). Punti dati rappresentano singoli animali e barre di errore rappresentano la media e deviazione standard. Lesione tubolare è stato segnato 0-50 in base al grado di formazione di necrosi e cast da un osservatore cieco (L.R.) su sezioni di rene acido periodico-Schiff-macchiate. Questo metodo è stato adattato da Wang e colleghi12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58520/58520fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58520/58520fig5.jpg"> Figura 5: correlazione di tre misure di funzione/danno renale (valutazione istologica della lesione tubolare (n = 39), la creatinina del siero (n = 30) e dell'azoto ureico (BUN) del sangue (n = 30)) con FITC-sinistrin clearance (emivita). Topi BALB/c maschili ha subito vari periodi di bloccaggio del pedicle renale unilaterale (25 – 45 min) o interventi chirurgici di sham, con il nephrectomy controlaterale simultaneo per indurre la severità differente dell'AKI, e l'istopatologia e parametri di funzione renale sono stati valutati al giorno 4 dopo IRI. Il Punteggio di lesione tubolare ha mostrato una forte correlazione positiva con FITC-sinistrin clearance (A; R2 = 0,88), mentre la creatinina del siero (B) e BUN (C) entrambi hanno mostrato positivo ma più debole correlazione con FITC-sinistrin liquidazione (R2 = 0,64 e 0,52, rispettivamente). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58520/58520fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Qui descriviamo un protocollo per misurare il tasso di filtrazione glomerulare (GFR) in consapevole, liberi di muoversi topi utilizzando un monitor GFR transdermico.

Transdermico misurazione del tasso di filtrazione glomerulare in topi

Transdermal analysis of glomerular filtration rate (GFR) is an established technique that is used to assess renal function in mouse and rat models of ...

Oggi, disporremo la tecnica della misurazione transdermica della filtrazione glomerulare o tGFR nei topi. Ci sono una serie di caratteristiche di questo metodo che penso valga la pena menzionare. Prima di tutto, attualmente il tGFR è il modo più accurato per valutare la funzione renale nei topi.In secondo luogo, il tGFR viene eseguito in topi coscienti e liberamente in movimento in modo da evitare le complicazioni dell'anestesia. In terzo luogo, una volta padroneggiata la tecnica, è ragionevole essere in grado di eseguire misurazioni da 30 a 40 tGFR in un solo giorno. Infine, le misurazioni tGFR possono essere eseguite ripetutamente in un topo in vitro.Ciò significa che possiamo eseguire misurazioni seriali della funzione renale in contesti di malattia acuta e cronica. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente ai ricercatori di misurare il tasso di filtrazione glomerulare o GFR in topi coscienti e liberamente in movimento con alta precisione e sensibilità. Uno o due giorni prima della misurazione del tGFR, dopo aver confermato una mancanza di risposta al dito del piedino, posizionare un mouse anestetizzato nella posizione prona su un riscaldatore.Utilizzando un rasoio elettrico, tagliare contro la direzione di crescita per rimuovere la maggior parte della pelliccia da un lato della schiena del mouse dalla parte superiore delle zampe posteriori fino al collo e attraverso le costole. Utilizzare un cotton fioc per applicare un sottile strato di crema di depilazione sulla pelle esposta contro la direzione della crescita per garantire che la crema sia applicata il più vicino possibile alla pelle e rimuovere la crema dopo uno o tre minuti con tamponi di cotone puliti e acqua tiepida. Il giorno della procedura, tagliare un cerotto adesivo di sei per tre centimetri delle dimensioni del dispositivo GFR prima di staccare la parte posteriore del cerotto e attaccare il dispositivo al lato adesivo del cerotto con i diodi emettitori di luce posizionati immediatamente sopra la finestra chiara.Quindi attaccare un piccolo pezzo del cerotto alla batteria. Per fissare il monitor, con il mouse anestetizzato in posizione prona, pulire la pelle pre-rasata con il 70% di etanolo e regolare la larghezza di un pezzo di nastro di circa 12 centimetri strapparla longitudinalmente. Posizionare il nastro sotto il mouse con due centimetri su un lato dell'animale ripiegato su un bordo del lato destro del nastro per un facile posizionamento e rimozione dopo la misurazione.Quindi, collegare la batteria al dispositivo, rimuovendo il supporto dalla batteria e posizionando saldamente la batteria sul dispositivo. Il dispositivo è pronto all'uso e l'acquisizione dei dati inizia quando i LED blu iniziano a lampeggiare. Rimuovere il supporto dalla patch sul dispositivo e posizionare il dispositivo sulla pelle rasata in modo che la finestra che espone i LED si trova sopra le nervature che fissano il lato destro del dispositivo con nastro adesivo.È importante garantire un fissaggio sicuro del dispositivo senza limitare la mobilità del mouse o esercitare troppa pressione sulla pelle. Quindi avvolgere saldamente il lato sinistro del nastro attorno al mouse e al dispositivo. Consentire al dispositivo di registrare una lettura costante dello sfondo per tre minuti.Nel frattempo, riscaldare la coda con un cuscinetto per la testa e caricare una siringa per insulina con il volume sperimentale appropriato di FITC-sinistrin per l'iniezione arrotondata ai 10 microlitri più vicini. Somministrare il FITC-sinistrin per via endovenosa in un bolo liscio ma rapido. È importante che l'utente sia a proprio agio con le iniezioni di IV in quanto è necessario somministrare con successo il FITC-sinistrin in un bolo piuttosto che su diversi tentativi che si tradurranno in più picchi nella curva di gioco.Per misurare il tGFR, posizionare il mouse nella propria gabbia con il monitoraggio fino alla piena rimiccanza e consentire la registrazione dello spazio FITC-sinistrino per 1,5 ore. Alla fine del periodo di misurazione, posizionare il mouse sulla griglia sopra la gabbia e consentire al mouse di afferrare le barre metalliche, estrarre il nastro da sotto la pancia in un rapido movimento liscio. Quindi rimuovere qualsiasi nastro dal dispositivo e dal cerotto dalla pelle facendo attenzione che la batteria non si disconnetta dal dispositivo e restituisca il mouse alla sua gabbia.Per valutare i dati, scollegare attentamente la batteria e utilizzare un cavo USB per collegare il dispositivo al computer. Aprire il software di lettura e fare clic su Connetti, Leggi, Rinomina e Salva. Quindi chiudere il programma ed elaborare e valutare i dati nel software di analisi secondo le istruzioni del produttore.Mentre fitc-sinistrin viene rapidamente cancellata dalla circolazione nei topi sani, questa clearance è drammaticamente ritardata nei topi con lesione renale acuta. Nei topi con lesioni renali acute molto gravi, può esserci pochissima o nessuna clearance della fluorescenza FITC-sinistrina durante l'intero periodo di misurazione di 90 minuti che indica una completa assenza di filtrazione glomerulare. La misurazione del GFR transdermico è minimamente invasiva e quindi può essere utilizzata per monitorare i cambiamenti nella funzione renale nei singoli animali in più punti di tempo.In effetti, in questo esperimento rappresentativo, le misurazioni sequenziali hanno dimostrato cambiamenti nella funzione renale a zero, uno, due e quattro giorni dopo la lesione da riperfusione dell'ischemia. In questo modello di malattia renale cronica del topo, la relazione inversa dell'emidità FITC-sinistrina con il GFR può essere direttamente correlata alla funzione renale compromessa osservata in questi animali. In effetti, l'emiprotezione FITC-sinistrina è strettamente correlata alla valutazione istologica semi-quantitativa della lesione tubolare su tutta la gamma di misurazioni del GFR nei topi illesi e nei topi con diverse gravità di lesione reperfusionale indotta da lesioni da ischemia.Al contrario, la creatinina sierica e l'azoto dell'urea nel sangue dimostrano una correlazione positiva ma più debole con la clearance FITC-sinistrina che indica che le misurazioni del GFR transcutaneo forniscono una misura più affidabile della lesione renale rispetto alla creatinina sierica o all'azoto urea nel sangue. La misurazione transdermica del GFR è una misura più sensibile della funzione renale rispetto ai biomarcatori tradizionali come la creatinina e il BUN. Ciò fornisce una valutazione più accurata dell'efficacia delle nuove terapie per le malattie renali nella ricerca preclinica.I passaggi più critici di questo metodo sono il corretto attaccamento del dispositivo alla schiena del mouse e la corretta somministrazione IV di FITC-sinistrin. Questi passaggi sono essenziali per ottenere una valutazione accurata del GFR nei topi.

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