Name: 大肠杆菌无细胞蛋白合成: 一种强大、灵活和可访问的平台技术的协议 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: 学习大肠杆菌无细胞蛋白合成技术，掌握快速、低成本的体外蛋白表达方法。本方案适用于功能基因组学、生物传感器及代谢工程研究，基础实验培训即可操作。

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作者谨此感谢 Jennifer VanderKelen 博士、Andrea Laubscher 和 Tony Turretto 提供的技术支持，感谢 Wesley Kao、Layne Williams 和 Christopher Hight 提出的有益讨论。作者还感谢比尔和琳达·弗罗斯特基金（Bill and Linda Frost Fund）、应用生物技术中心雪佛龙生物技术应用研究捐赠基金（Center for Applications in Biotechnology's Chevron Biotechnology Applied Research Endowment Grant）、加州理工州立大学研究、学术与创造性活动资助计划（Cal Poly Research, Scholarly, and Creative Activities Grant Program，RSCA 2017）以及美国国家科学基金会（National Science Foundation，NSF-1708919）提供的经费支持。MZL 感谢加州州立大学研究生资助项目（California State University Graduate Grant）。MCJ 感谢美国陆军研究办公室（Army Research Office，W911NF-16-1-0372）、美国国家科学基金会（National Science Foundation，MCB-1413563 和 MCB-1716766）、美国空军研究实验室卓越中心（Air Force Research Laboratory Center of Excellence Grant，FA8650-15-2-5518）、美国国防威胁降低局（Defense Threat Reduction Agency Grant，HDTRA1-15-10052/P00001）、大卫和露西尔·帕卡德基金会（David and Lucile Packard Foundation）、卡米尔·德雷福斯教师学者计划（Camille Dreyfus Teacher-Scholar Program）、美国能源部基础能源研究计划（Department of Energy BER Grant，DE-SC0018249）、人类前沿科学计划（Human Frontiers Science Program，RGP0015/2017）、美国能源部联合基因组研究所 ETOP 资助项目（DOE Joint Genome Institute ETOP Grant）以及芝加哥生物医学联盟（Chicago Biomedical Consortium）在芝加哥社区信托基金会的 Searle 基金支持下提供的资助。

1. 培养基制备与细胞培养
<ol>
	<li>第1天
	<ol>
		<li>划线 E. coli 从甘油菌种中将BL21*(DE3)细胞接种至LB琼脂平板，37 °C条件下培养至少18小时。</li>
		<li>配制50 mL LB培养基，于121 °C液体循环条件下高压灭菌30 min，室温保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第2天
	<ol>
		<li>按照补充信息中的说明，配制750 mL的2x YTP培养基和250 mL的0.4 M D-葡萄糖溶液。</li>
		<li>将2倍浓度YTP培养基倒入已灭菌的2.5 L挡板烧瓶中，将D-葡萄糖溶液倒入已灭菌的500 mL玻璃瓶中。在121 °C条件下，对两种溶液均采用液体循环程序进行高压灭菌30分钟。</li>
		<li>确保两种无菌溶液在37 °C下保存，若次日将进行细胞培养，以在接种时最大化细胞生长速率。在接种前请勿混合溶液。 
		注意：如有需要，溶液可在 4 °C 下保存 1–2 天，但 2x YTP 培养基极易被污染。</li>
		<li>接种一环经灭菌的接种环，采用无菌操作技术，将单个BL21(DE3)菌落接种于50 mL LB培养基中，过夜培养。</li>
		<li>将50 mL BL21*(DE3) LB培养液置于37 °C、250 rpm的摇床培养箱中，培养15–18小时。</li>
		<li>准备并灭菌第3天和第4天所需的所有材料，包括：两个1 L离心瓶、4个预冷的50 mL锥形管（称量并记录其中三个的质量），以及大量1.5 mL微量离心管。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第3天
	<ol>
		<li>从摇床培养箱中取出 BL21*(DE3) 在 LB 中的 50 mL 过夜培养物，测定 OD600 使用分光光度计，以LB培养基进行1:10稀释后测定。计算为使1 L培养基的初始OD达到所需值，应添加的过夜培养液体积600 0.1（例如，如果一个OD600 1:10 稀释液的吸光度值为 0.4 时，接种 25 mL 未稀释的 OD600 将4.0的过夜培养物接种至1升2x YTPG培养基中，过夜培养。</li>
		<li>从37 °C培养箱中取出预热的2x YTP培养基和D-葡萄糖溶液，以及50 mL的LB培养物。采用无菌操作技术，将D-葡萄糖溶液小心倒入2x YTP培养基中（避免接触挡板烧瓶的瓶壁）。 
		注意：添加 D-葡萄糖即可完成 1 L 2x YTPG 培养基的配制。</li>
		<li>在保持无菌操作技术的前提下，将适量的50 mL培养物接种至1 L的2x YTPG溶液中，使1 L培养物的起始OD值为0.1600立即将接种后的1 L培养物放入37 °C、200 rpm的摇床培养箱中。</li>
		<li>取第一次 OD 值600 生长1小时后（典型滞后期约为1小时）开始读数。不要稀释培养物。继续测定OD600 每 20-30 分钟测量一次，直至 OD600 达到 0.6。</li>
		<li>当达到 OD 时600 = 0.6 时，向2x YTPG培养基中加入1 mL 1 M IPTG（1 L培养液中的终浓度 = 1 mM）。 
		注意：理想的诱导OD600 为0.6；然而0.6-0.8范围也可接受。通过IPTG诱导以实现T7 RNA聚合酶（T7RNAP）的内源性表达。</li>
		<li>诱导后，测定OD值600 大约每20-30分钟一次，直至达到3.0。 
		注意：在此期间将离心机预冷至 4 °C。按照补充信息中的说明配制预冷的 S30 缓冲液。若提前配制 S30 缓冲液，请确保在使用当天再加入 DTT。</li>
		<li>一旦OD600 达到 3.0（图2A将培养物倒入置于冰水浴中的预冷1 L离心瓶中。准备一个装有水的1 L离心瓶作为配平管，使其重量与样品管相等，用于离心机平衡。 
		注意：吸光度值因仪器而异。尽管OD600 BL21(DE3)的收获时间并非敏感变量，但建议用户将其作为故障排查措施进行评估和优化。使用较大的分光光度计可能导致相对较低的OD值600 与较小的比色皿型分光光度计相比的读数。</li>
		<li>将1 L瓶子在5,000 × g、10 °C条件下离心10分钟，使细胞沉淀。</li>
		<li>缓慢倒出上清液，并根据机构的生物废弃物处理规程进行处置。将沉淀物置于冰上。</li>
		<li>使用无菌刮铲从离心瓶中刮下细胞沉淀，并转移至预冷的50 mL锥形管中。</li>
		<li>向锥形管中加入30 mL预冷的S30缓冲液，通过涡旋振荡（短时 bursts，20 - 30 s）并间隔冰上静置（1 min），直至细胞沉淀完全重悬且无团块。</li>
		<li>待沉淀完全重悬后，使用另一只装有水的50 mL锥形管配平，于5000 x g离心10 min，温度设为10 °C（预冷至4 °C）。 
		注意：此步骤完成第1个st 细胞收获过程中所需的3次洗涤步骤。</li>
		<li>倒出上清液，并根据机构的生物废弃物处理规程进行处置。用20-25 mL预冷的S30缓冲液重悬沉淀，于5000 × g、10 °C离心10分钟（离心机预先冷却至4 °C）。 
		注意：此步骤完成第2部分nd 3次洗涤。</li>
		<li>再次倒出上清液，并根据机构的生物废弃物处理规程进行处置。加入恰好30 mL的S30缓冲液，再次涡旋振荡以重悬沉淀。</li>
		<li>使用3个预先称重的冷50 mL锥形管，以及带有无菌移液管的移液器，将重悬的沉淀/S30缓冲液混合物各10 mL分装至这3个锥形管中。 
		注意：将细胞分装至3个试管中并非必需，但此步骤可获得较小的细胞沉淀（约1 g），便于后续操作。</li>
		<li>将所有离心管配平后，于10 °C（预先冷却至4 °C）条件下以5000 x g离心10分钟。 
		注意：此步骤完成最后一次洗涤。</li>
		<li>倒出上清液，并根据机构的生物废弃物处理规程进行处置。用干净的纸巾轻轻擦拭锥形管内壁和管盖，去除残留的S30缓冲液；注意避免触碰沉淀物。</li>
		<li>在分析天平上重新称量各管，记录每管中沉淀物的最终重量。 
		注意：此步骤可暂停。沉淀物可用液氮速冻，并在 -80 °C 保存长达一年，直至需要用于提取制备。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 粗制细胞提取物制备 - 第4天
<ol>
	<li>进行提取物制备时，每一步操作均需将细胞置于冰上保持低温。每1 g细胞沉淀加入1 mL预冷的S30缓冲液。确保S30缓冲液中已添加二硫苏糖醇（DTT），使其终浓度为2 mM。 
	注意：在此期间将微量离心机预冷至4 °C。</li>
	<li>通过短时间涡旋（20 - 30 s）并间隔冰上静置（1 min）的方式重悬细胞沉淀，直至完全分散。若重悬困难，可将沉淀在冰上静置30 min以部分解冻。</li>
	<li>将1.4 mL重悬后的细胞转移至1.5 mL微量离心管中。</li>
	<li>将装有1.4 mL重悬细胞的1.5 mL离心管置于烧杯中的冰水浴中。设定超声仪振幅为50%，超声处理45 s，间歇59 s，共循环3次。在间歇期间轻轻闭合并倒置离心管以混匀。总共向每管含1.4 mL重悬细胞的1.5 mL微量离心管中输入800–900 J的能量（图3A &#38; 3B）。 
	注意：此步骤对所用超声仪的类型和型号较为敏感，若设备与本方案所列不同，需进行优化。可通过两种互补方式扩大本步骤中提取物的制备量：1）并行对多个1.5 mL微量离心管进行超声处理；和/或2）在锥形管中对更大体积的细胞重悬液进行超声处理（每管最多15 mL），同时按前述方法相应增加输入能量29,45。</li>
	<li>超声处理完成后立即向1.4 mL裂解液中加入4.5 µL的1 M DTT（额外补充2 mM DTT），并反复倒置混匀数次。将离心管放回冰上。在进行离心前，对所有其他重悬细胞管重复步骤2.4和2.5。</li>
	<li>在18,000 x g、4 °C条件下对样品进行微量离心，离心10 min（图3C）。</li>
	<li>用移液器将上清液转移至新的1.5 mL微量离心管中。操作时避免扰动沉淀；为保持提取物纯度，宁可残留少量上清液，也不应为提高得率而破坏沉淀。</li>
	<li>将上一步所得上清液用胶带固定于恒温振荡培养箱的振荡平台上，在250 rpm、37 °C条件下孵育60 min（此为“runoff反应”）。</li>
	<li>在10,000 x g、4 °C条件下对样品进行微量离心，离心10 min。</li>
	<li>小心移除上清液，避免扰动沉淀，并将其转移至新管中。将提取物分装为多个100 µL的等份用于储存。 
	注意：本方案可在此处暂停，提取物可立即在液氮中速冻，并于-80 °C保存长达一年，待进行无细胞蛋白合成（CFPS）反应时使用。至少可经历5次冻融循环而不影响提取物的活性（图4）。</li>
</ol>
3. 无细胞蛋白合成批量反应
<ol>
	<li>解冻溶液A和溶液B、DNA模板、BL21(DE3)提取物（若为冷冻状态）、T7RNAP以及一份分子级水。 
	注意：CFPS反应模板可在补充信息中找到。溶液A和溶液B的配方详见补充信息，其对应多种试剂的特定浓度，以支持基于PANOx-SP的能量系统用于CFPS。每种试剂的作用以及可支持CFPS的试剂浓度允许变动范围已有研究确定50。T7RNAP纯化方案见补充信息51。额外添加T7RNAP可提高体积产率，但如果在细胞生长过程中已诱导表达T7RNAP，则无需额外补充。质粒DNA模板（pJL1-sfGFP）可使用大提试剂盒制备，用试剂盒中的洗涤缓冲液洗涤两次，随后使用PCR纯化试剂盒进行DNA后处理纯化（图2B）。线性DNA模板也可用于CFPS反应。</li>
	<li>标记进行CFPS反应所需数量的微量离心管。 
	注意：反应可在不同规格容器中进行，但较小容器可能降低蛋白质的体积产率（图2C）。在同一规格容器中放大反应体积也可能因表面积与体积比降低导致氧气交换减少，从而降低体积产率。当反应体积超过100 μL时，建议使用平底孔板31,37,52。</li>
	<li>在每个反应体系中加入2.2 µL溶液A、2.1 µL溶液B、5 µL BL21*(DE3)提取物、0.24 μg T7RNAP（终浓度16 μg/mL）、0.24 ng DNA模板（终浓度16 ng/µL），并加水至终体积为15 µL。 
	注意：在配制反应体系期间应频繁涡旋振荡溶液A和溶液B，以防止组分沉淀，并确保每个反应获得均一的溶液取样。避免涡旋振荡提取物，应通过翻转混匀。</li>
	<li>所有试剂加入反应体系后，通过移液吹打或轻柔涡旋混匀各管，确保最终反应混合物在1.5 mL微量离心管底部形成单一的15 µL液滴。</li>
	<li>将每个反应置于37 °C恒温培养箱中静置孵育4小时，或30 °C过夜孵育。 
	注意：可通过CFPS反应混合物中sfGFP产物呈现的绿色进行目视定性判断反应是否成功（图3D）。目标蛋白的表达也可通过SDS-PAGE进一步验证（补充图2）。</li>
</ol>
4. 报告蛋白 [sfGFP] 的定量
<ol>
	<li>在每个需要定量的孔中加入 48 µL 的 0.05 M HEPES（pH 8）。</li>
	<li>从培养箱中取出反应样品，用移液器吹打混匀每个反应体系，然后将 2 µL 反应液转移至含有 48 µL 0.05 M HEPES（pH 8）的孔中，再次吹打混匀。</li>
	<li>待所有反应样品加样并混匀后，将 96 孔板放入荧光仪中，测定 sfGFP 的终点荧光强度。 
	注意：sfGFP 荧光定量的激发波长和发射波长分别为 485 nm 和 510 nm。</li>
	<li>根据先前建立的标准曲线，由测得的荧光读数确定 [sfGFP] 浓度。 
	注意：sfGFP 浓度与荧光强度的标准曲线建立方法详见补充信息（Supplementary Figure 3）。由于不同仪器的灵敏度可能存在差异，用户需针对所用仪器建立相应标准曲线。</li>
</ol>

作者声明不存在竞争性财务利益或其他利益冲突。

无细胞蛋白质合成已成为一种强大且具有推动作用的技术，适用于从生物制造到生化系统快速原型构建等多种应用。其广泛的应用得益于实时监测、操控和增强细胞机制的能力。尽管该平台技术的影响不断扩大，但由于实验方法在实施过程中存在技术上的细微复杂性，其广泛应用仍进展缓慢。本研究旨在为新实验室建立该技术提供简便性和清晰性。为此，我们提供的基于 E. coli 的无细胞蛋白质合成平台，可由受过基本训练但非专家的实验人员（如本科生）在四天内完成启动（图1）。此外，一旦制备出试剂和提取物的储备液，后续的CFPS批次反应可在仅5小时内完成设置、孵育和定量分析。一次1 L的细胞培养可获得足够进行四百次15 µL CFPS反应的提取物，而其他无细胞试剂的单次批量制备则可支持数千次反应。若需要更大的储备量，试剂制备也可相应放大。CFPS反应可通过使用96孔板或PCR管并行测试多种条件，以高通量方式设置。当使用较小容器时，体积产率会下降，如图2C所示。CFPS反应也可从微升级别放大至数十毫升的总体积，以提高单一条件下的总蛋白产量。在...

无细胞蛋白质合成（CFPS）技术在过去50年中已发展成为一项开创性技术，为蛋白质生产、功能基因组学、代谢工程等领域带来了诸多新机遇1,2与标准相比 在体 蛋白质表达平台中，CFPS 具有三个关键优势：1）该平台的无细胞特性能够实现对细胞可能具有毒性或外源性蛋白的生产3,4,5,6；2）通过失活基因组DNA并引入编码目标基因的模板DNA，可将反应体系中的全部系统能量导向目标蛋白的表达；3）该平台的开放性使用户能够实时调整并监测反应条件与组分7,8这种对反应的直接介入支持在扩展的化学体系和氧化还原条件下增强生物系统，以实现新型蛋白质的合成及代谢过程的调控。2,9,10直接访问还允许用户将CFPS反应与活性检测结合在单一体系中，从而实现更快速的设计-构建-测试循环11在小体积液滴或基于纸张的装置中进行CFPS反应的能力，进一步支持了高通量发现研究和快速原型开发。12,13,14,15,16由于这些优势以及系统的即插即用特性，无细胞蛋白表达系统（CFPS）独特地实现了多种生物技术应用，例如可溶性表达困难蛋白的生产 体内17,18,19,20疾病检测21,22,23按需生物制造18,24,25,26,27以及教育28,29，这些均体现了无细胞平台的灵活性与实用性。
CFPS系统可由多种原核和真核细胞系的粗裂解物制备而成，这为系统的选择提供了多样化的方案，每种方案均根据具体应用需求具有各自的优势与局限性。CFPS系统在制备时间、成本和生产效率方面也存在显著差异。最常用的细胞提取物来源于小麦胚芽、兔网织红细胞、昆虫细胞以及 大肠杆菌 细胞，其中后者迄今为止成本效益最高，且能产生最高的体积产率蛋白质30尽管其他CFPS系统因其固有的翻译后修饰机制而在某些应用中具有优势，但利用这些系统的新兴应用正在不断涌现 E. coli基于此的装置能够通过按需生成位点特异性磷酸化和糖基化的蛋白质，从而弥补这一差距31,32,33,34,35.
CFPS 反应可以采用分批式（batch）、连续交换无细胞（CECF）或连续流动无细胞（CFCF）的形式进行。分批式是一种封闭系统，由于反应物数量逐渐减少以及抑制性副产物的积累，其反应持续时间有限。CECF 和 CFCF 方法可延长反应寿命，从而实现比分批式反应更高的体积蛋白产率。这是通过在反应过程中不断向反应容器补充新的反应物，同时将蛋白质合成的副产物移除而实现的2。在 CFCF 情况下，目标蛋白也可从反应室中移出；而在 CECF 中，目标蛋白保留在由半透膜构成的反应室内36,37。这些方法在克服难表达目标蛋白的低体积产率方面具有重要价值38,39,40,41,42,43。实施 CECF 和 CFCF 方法面临的挑战在于：1）尽管它们能更高效地利用负责转录和翻译的生物系统，但需要显著更多的试剂，从而增加总体成本；2）与分批式相比，它们需要更复杂的反应装置和专用设备44。为了确保新用户能够便捷使用，本文所述方案聚焦于 15 µL 反应体积的分批式反应，并提供了将反应体积扩大至毫升级的具体建议。
本文所述方法可使具备基本实验技能（如本科学生）的非专业人员能够开展细胞培养、提取物制备以及批量反应体系的建立 E. coli基于细胞的无细胞蛋白表达（CFPS）系统。与商业化的试剂盒相比，该方法具有成本效益，同时不牺牲基于试剂盒的反应体系搭建的便捷性。此外，该方法适用于实验室和现场应用。在决定实施CFPS时，新用户应充分评估传统蛋白表达系统在启动投资方面的有效性，因为在某些情况下CFPS未必更具优势。本文所述的CFPS方法可使用户直接开展多种应用，包括功能基因组学、高通量筛选，以及难以通过常规方法表达的蛋白质的生产 在体 表达，以及在生物传感器和合成生物学教育工具包等领域的应用。其他应用如代谢工程、蛋白质表达条件的优化、疾病检测，以及使用CECF或CFCF方法进行放大生产也是可行的，但可能需要具备CFPS平台的操作经验，以进一步调整反应条件。我们的方法结合了在富集培养基和带挡板锥形瓶中的培养，通过超声波破碎实现相对快速且可重复的细胞裂解，随后采用简化的CFPS反应体系，使用经过优化的预混试剂45尽管细胞培养方法在该领域内已趋于标准化，但细胞裂解方法却存在较大差异。除了超声处理外，常用的裂解方法还包括使用弗氏压榨器、均质器、珠磨破碎仪，以及溶菌酶和其他生化与物理破碎方法。46,47,48,49使用我们的方法，每1升细胞可获得约2 mL粗制细胞提取物。该提取物产量可支持四百个15 µL的无细胞蛋白合成（CFPS）反应，每个反应从模板质粒pJL1-sfGFP产生约900 µg/mL的报告蛋白sfGFP。此方法生产的sfGFP成本为0.021美元/µg（反应液成本为0.019美元/µL），未包含人力和设备费用。补充图1）。从零开始，单人可在4天内完成该方法的建立，且可重复的CFPS反应可在数小时内完成（图1）。此外，该方案可根据需要扩大反应体积，以制备更大批次的试剂。重要的是，本方案可由受过基本实验室培训但非专业人员的人员（如本科生）实施，仅需具备基础的实验操作技能。下述操作步骤及配套视频旨在提高该 E. coli 适用于广泛用途的CFPS平台

<table><tbody><tr><td>LB培养基</td><td>ThermoFisher</td><td>12795027</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>73049-73-7</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>1/2/8013</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014-1KG</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60353-250G</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791-500G</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5958-500G</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758-1G</td><td></td></tr><tr><td>Mg(OAc)₂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5661-250G</td><td></td></tr><tr><td>K(OAc)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1190-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Tris(OAc)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066-500G</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>ThermoFisher</td><td>15508013</td><td></td></tr><tr><td>tRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10109541001</td><td></td></tr><tr><td>亚叶酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7878-100MG</td><td></td></tr><tr><td>NTPs</td><td>ThermoFisher</td><td>R0481</td><td></td></tr><tr><td>草酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0963-100G</td><td></td></tr><tr><td>NAD</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N8535-15VL</td><td></td></tr><tr><td>CoA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3144-25MG</td><td></td></tr><tr><td>PEP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>860077-250MG</td><td></td></tr><tr><td>K(Glu)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1501-500G</td><td></td></tr><tr><td>NH₄(Glu)</td><td>MP Biomedicals</td><td>02180595.1</td><td></td></tr><tr><td>Mg(Glu)₂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49605-250G</td><td></td></tr><tr><td>亚精胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0266-5G</td><td></td></tr><tr><td>腐胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D13208-25G</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>ThermoFisher</td><td>11344041</td><td></td></tr><tr><td>分子生物学级水</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7732-18-5</td><td></td></tr><tr><td>L-天冬氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7219-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-缬氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V0500-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-色氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0254-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-苯丙氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2126-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-异亮氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2752-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-亮氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8000-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-半胱氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7352-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-甲硫氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9625-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-丙氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7627-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-精氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8094-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-天冬酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0884-25G</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7126-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G3126-250G</td><td></td></tr><tr><td>L-组氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8000-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-赖氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5501-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-脯氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0380-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-丝氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4500-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-苏氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8625-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-酪氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3754-100G</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 高级微量离心管：2.0 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-138</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 高级微量离心管：1.5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 高级微量离心管：0.6 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-120</td><td></td></tr><tr><td>PureLink HiPure 质粒提取试剂盒</td><td>ThermoFisher</td><td>K210007</td><td></td></tr><tr><td>超声波处理器</td><td>QSonica</td><td>Q125-230V/50Hz</td><td>3.175 mm 直径探头</td></tr><tr><td>Avanti J-E 离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td>369001</td><td></td></tr><tr><td>JLA-8.1000 转子</td><td>Beckman Coulter</td><td>366754</td><td></td></tr><tr><td>1L 离心管</td><td>Beckman Coulter</td><td>A99028</td><td></td></tr><tr><td>Tunair 2.5L 带挡板摇瓶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z710822</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge 20</td><td>Beckman Coulter</td><td>B30134</td><td></td></tr><tr><td>New Brunswick Innova 42/42R 恒温摇床</td><td>Eppendorf</td><td>M1335-0000</td><td></td></tr><tr><td>Cytation 5</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Strep-Tactin XT 初级试剂盒</td><td>IBA</td><td>2-4998-000</td><td></td></tr><tr><td>pJL1-sfGFP</td><td>Addgene</td><td>69496</td><td></td></tr><tr><td>BL21(DE3)</td><td>New England BioLabs</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

大肠杆菌基于细胞的无细胞蛋白质合成：一种稳健、灵活且易于获取的平台技术的操作方案

Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

在过去的50年中，无细胞蛋白质合成（CFPS）作为一种强大的技术逐渐兴起，能够在试管中利用细胞的转录和翻译能力。由于无需维持细胞的活性，并且消除了细胞屏障，CFPS已成为生物制造传统上难以表达的蛋白质、快速构建代谢工程原型以及功能基因组学等新兴应用的基础。我们所提供的基于大肠杆菌（E. coli）的CFPS平台实施方法，使新用户能够便捷地开展上述多种应用。本文描述了通过使用富集培养基、带挡板的锥形瓶以及可重复调控的超声波细胞裂解方法来制备细胞提取物的技术流程。该提取物可用于蛋白质表达，在实验开始后仅5小时内即可产生900 µg/mL或更高浓度的超折叠绿色荧光蛋白（sfGFP），前提是相关试剂储备已预先配制完成。获取所需试剂的初始成本约为4,500美元，此后可支持数千次反应，每次反应的蛋白质生产成本约为0.021美元/µg，或0.019美元/µL反应体系。此外，由于对试剂预混液进行了优化，该蛋白质表达方法在操作便捷性上可媲美商业系统，而成本仅为后者的极小部分。为了帮助用户充分发挥CFPS平台的灵活性以适应广泛的应用需求，我们总结了该平台中多个可根据可用资源和目标蛋白表达效果进行调节与优化的关键环节。

我们介绍了一种基于超声处理的 E. coli 提取物制备方案，可在四天内完成，图1 展示了每一天的具体操作流程。各步骤在时间安排上具有一定灵活性，并可在多个节点暂停，但我们发现当前的工作流程执行效果最佳。此外，细胞沉淀（步骤1.3.18）和完全制备好的提取物（步骤2.10）在-80 °C下至少可稳定保存一年，用户可制备较大批量的样品以供后续使用17。该提取物不仅长期稳定，还可经历至少五次冻融循环而不会显著降低其活性（图4）。因此，若冰箱存储空间有限，可将提取物分装为较大体积的 aliquot 以供多次使用。然而，我们建议尽可能分装为多个较小体积的 aliquot（约100 μL）。
每次制备新的提取物时，建议用户进行镁离子滴定实验，以确...

本方案详细说明了在4天或更短时间内制备基于大肠杆菌（E. coli）的细胞提取物并实施体外（in vitro）蛋白质合成反应所需的步骤、成本和设备。为了充分利用该平台的灵活性以适用于广泛的应用，我们讨论了可调整和优化的反应条件。

在过去的50年中，无细胞蛋白质合成（Cell-Free Protein Synthesis, CFPS）已发展成为一种强大的技术，用于利用细胞的转录和翻译能力……

本方案简化并阐明了非专业人员实施自复制蛋白质合成的方法。改进后的方法可及性将有助于去中心化该平台及其所支持的广泛应用。该技术的主要优势在于与其它自复制蛋白质合成平台相比，反应体系搭建更快速、更具成本效益且操作简便。我们的平台可支持多种应用，包括功能基因组学、植物药效测试、生物传感器、教学套件，以及经过少量修改后的代谢工程和遗传密码扩展。尽管该技术仅需基本的实验室培训，但新用户应计划熟悉超声处理等技术，以确保实验方案的顺利实施。开始此实验前，请按照文本方案中所述准备所有培养基和大肠杆菌（E.coli）培养物。将一个一升的离心瓶放入冰水浴中。当菌液的 OD600 达到 3.0 时，将细胞培养物倒入预冷的离心瓶中。使用双盘天平，向第二个一升离心瓶中加入水，直至其重量与第一个离心瓶相同，以平衡离心机。将离心机预冷至 4 摄氏度后，在 10 摄氏度下以 5,000 g 离心 10 分钟，使细胞沉淀。随后，缓慢倾倒并弃去上清液。将细胞沉淀置于冰上。 用无菌刮勺将细胞沉淀从离心瓶中刮出，转移至预冷的 50 毫升锥形管中。加入 30 毫升含 2 毫摩尔 DTT 的预冷 S30 缓冲液，通过短暂涡旋振荡并间歇置于冰上，直至沉淀完全重悬且无团块。随后，使用另一装有水的 50 毫升锥形管作为配平，于 10 摄氏度下以 5,000 g 离心 10 分钟。倒掉上清液并妥善处理。用 20 至 25 毫升预冷的 S30 缓冲液重悬沉淀。在 10 摄氏度下以 5,000 ×g 离心 10 分钟。倒出上清液并妥善处理。然后加入 30 毫升 S30 缓冲液，使用涡旋振荡器重悬沉淀，操作方法同前。准备三个预先称重的、冰冷的 50 毫升锥形管。使用血清学移液管助吸器和无菌移液管，将沉淀悬浮液每管10毫升分装至十个离心管中。将所有离心管置于适当的平衡条件下，在5,000 ×g、10 °C下离心10分钟。随后倾倒并弃去上清液。用干净的纸巾小心擦拭每个离心管内壁和管盖，以去除多余的缓冲液，注意避免触碰沉淀。使用分析天平重新称量各离心管，并记录每个离心管的沉淀最终重量。开始操作时，每1克细胞质量向每个沉淀中加入1毫升含2毫摩尔DTT的预冷S30缓冲液。使用涡旋振荡器重新悬浮沉淀物，操作方法如前所述。然后将每份重新悬浮的沉淀物各1.4毫升转移至不同的1.5毫升微量离心管中。将其中一管置于烧杯内的冰水浴中，并将超声破碎仪探头置于管内液面下，确保探头不接触管底或管壁。将试管置于50%的振幅下超声处理45秒，随后静置59秒。在超声间歇期间，务必关闭并倒置试管。超声处理一结束，立即向裂解液中加入4.5微升1摩尔的DTT。将离心管颠倒数次以混匀，然后置于冰上。重复此过程，对每管重悬的细胞进行超声处理并加入DTT。在4°C条件下以18,000 g离心10分钟。此后，将每管上清液用移液器转移至新的1.5毫升微量离心管中，保留少量上清液以确保沉淀物不被扰动。将含有上清液的离心管置于摇床培养箱中，在37°C、250 RPM振荡条件下孵育60分钟。此步骤称为跑脱反应（run-off reaction）。然后，在 4 °C 条件下以 10,000 g 离心样品 10 分钟。小心移除上清液，避免扰动沉淀，将其转移至新管中。将提取物分装成多份 100 µL 的等分试样用于储存。首先，将溶液A、溶液B、DNA模板、BL21DE3提取物、T7 RNA聚合酶以及一份分子级水在冰上解冻。接着，标记进行无细胞蛋白表达系统（CFPS）反应所需数量的微量离心管。通过移液或涡旋混合各试剂，然后将溶液加入已标记的反应管中，注意不要涡旋细胞提取物，而应通过倒置试管进行混匀。确保最终反应液充分混匀，并在每根离心管底部合并成一个15微升的液滴。将每个反应体系在37摄氏度下静置孵育4小时，或在30摄氏度下过夜孵育。开始实验时，取一块96孔板，向每个需要用于定量的孔中加入48微升pH 8的0.05摩尔HEPES溶液。接下来，从培养箱中取出反应管。通过反复吹打混匀每个反应体系，并将每个反应体系中的 2 µL 转移至含有 HEPES 的孔中。通过反复吹打混匀各孔中的溶液。在所有反应完成加样和混匀后，将酶标板放入荧光计中，使用485纳米的激发波长和510纳米的发射波长测定SFGFP终点荧光值。利用先前生成的标准曲线，根据测得的荧光读数确定折叠良好的超级GFP的浓度。本研究探讨了一种基于超声处理的大肠杆菌提取物制备方法。细胞沉淀和细胞提取物在负80摄氏度下至少可稳定保存一年。此外，细胞提取物可经历至少五次冻融循环而不会显著降低活性。本方案中的某些步骤可根据需要进行调整，而不会影响系统的整体活性。最重要的是，细胞可以在 600 纳米处光密度值为 2.7 至 4.0 的范围内收获，而对细胞提取物的生产效率无明显影响。然而，模板 DNA 的质量是导致批次间差异的一个因素，会影响 CFPS 反应的体积产量。这一问题可通过 Midi 或 Maxiprep 方法纯化 DNA，再辅以额外的 DNA 清洁步骤来解决。反应容器也会影响无细胞蛋白表达（CFPS）反应的体积产率。表面积与体积之比增大时，体积产率更高。为了优化 CFPS 反应的体积产率并减少细胞提取物批次间的差异，应对每一批新制备的提取物进行镁离子滴定。对于总蛋白浓度为每毫升30毫克的细胞提取物，为最大限度减少试剂消耗并提高体积产率，最佳镁离子浓度和提取物体积分别为10毫摩尔和5微升。通过调整反应规模，使用者可选择从高通量筛选到目标蛋白的大规模表达等多种方法。该技术具有两个关键优势：一是能够更快速地筛选蛋白质产物，二是能够合成难以表达的蛋白质。例如，具有细胞毒性的蛋白质或需要氧化条件才能发挥功能的蛋白质。与任何实验室操作一样，所有试剂都应谨慎处理。此外，离心机必须始终保持平衡，超声处理时应使用耳部防护装备。

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