Name: Preparazione di funghi e materiali vegetali per delucidazione strutturale utilizzando dinamico polarizzazione nucleare NMR allo stato solido (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Scopri la preparazione di campioni fungini e vegetali per NMR allo stato solido e DNP. Questo metodo consente analisi strutturali ad alta risoluzione per lo sviluppo di farmaci antifungini.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Science Foundation attraverso NSF OIA-1833040. Il laboratorio nazionale di campo magnetico alta (NHMFL) è supportata dalla National Science Foundation attraverso DMR-1157490 e dello stato della Florida. Il sistema di MAS-DNP presso NHMFL è in parte finanziato dal NIH S10 OD018519 e NSF CHE-1229170.

1. crescita di 13C, 15N-labeled fumigatus dell'aspergillo mezzo liquido
<ol><li>Preparazione di adenoide e 13C, 15N-labeled crescita medio Nota: Entrambi mezzo lievito estrarre Peptone destrosio (YPD) e il miglioramento medio minimo43 sono stati utilizzati per il mantenimento della coltura fungosa. Tutti i passaggi dopo la sterilizzazione in autoclave sono eseguiti in una cappa a flusso laminare per minimizzare la contaminazione.<ol>
<li>Preparazione del mezzo liquido senza etichetta: sciogliere 6,5 g di polvere YPD in 100 mL di acqua distillata e quindi autoclave per 25 minuti a 134 ° C.</li>
		<li>Preparazione del mezzo solido senza etichetta<ol>
<li>Aggiungere 1,5 g di agar e 6,5 g di polvere YPD in 100 mL di acqua distillata.</li>
			<li>Autoclave medio per 25 minuti a 121 ° C e poi raffreddare fino a circa 50 ° C.</li>
			<li>13-15 mL di terreno di trasferimento in ogni capsula di Petri di plastica pre-sterile e coprire il recipiente con un coperchio immediatamente.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Preparazione di 13C, 15N-labeled mezzo liquido Nota: Per preparare la soluzione di crescita isotopo etichettatura, un medium minimo contenente 13C-glucosio e 15N-sodio nitrato e una soluzione di oligoelementi sono preparati separatamente e poi mescolati prima dell'uso.<ol>
<li>Preparare 100 mL di terreno minimo isotopo-contenente, come elencato nella tabella 1. Regolare il pH a 6.6 usando NaOH (1m) o una soluzione di HCl (1M).</li>
			<li>Autoclave il terreno minimo per 25 min a 121 ° C.</li>
			<li>Preparare 100 mL (1, 000 x) della soluzione di oligoelementi, sciogliere i sali elencati nella tabella 2 in acqua distillata. Autoclave la soluzione per 25 minuti a 134 ° C. Raffreddare e conservare la soluzione a 4 ° C per uso a breve termine. Il pH sarà circa 6.5 e può essere controllato utilizzando un pH-metro.</li>
			<li>Aggiungere 0,1 mL di soluzione di oligoelementi per 100 mL di 13C, medium minimo di 15N-etichettato come elencato nella tabella 2 prima dell'uso.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Crescita dei materiali fungini<ol>
<li>Trasferire una piccola quantità di funghi dal deposito su un piatto YPD utilizzando un'ansa da inoculo in cappa a flusso laminare. Conservare la cultura a 30 ° C per 2 giorni in un'incubatrice.</li>
		<li>Utilizzare un'ansa da inoculo per trasferire un bordo fungina crescente attivo a 13C,15N-etichettatura di soluzione in una cappa a flusso laminare. Mantenere la cultura a 30 ° C per 3-5 giorni a 220 giri/min in un incubatore d'agitazione.</li>
		<li>Centrifugare a 4.000 x g per 20 minuti rimuovere il surnatante e raccogliere il pellet.</li>
		<li>Utilizzare una pinzetta per raccogliere ~0.5 g di pellet ben idratata (> 50% di idratazione wt) per gli studi NMR. Perdita di idratazione in qualsiasi punto peggiorerà notevolmente la risoluzione spettrale. Nota: Se necessario, una piccola quantità (0,1 g) del micelio idratata possono essere separate e completamente essiccata sotto flusso di gas di N2 in un cappuccio o un liofilizzatori per stimare il livello di idratazione e calcolare la percentuale della massa secca. Di solito, un pellet contenenti ~0.3 g massa secca può essere ottenuta dopo 3 giorni. Se l'esperimento NMR per essere condotto è lungo (> 7 giorni) e/o se lo stato dei funghi deve essere risolto, il materiale fungo possa essere profondamente congelato in liquido N2 per 10-20 min prima del successivo trattamento. Se l'esperimento sarà breve (3-6 giorni), il congelamento può essere ignorato il campione può rimanere fresco.</li>
		<li>Mescolare il materiale in eccesso con il 20% (v/v) di glicerolo in una provetta da centrifuga e tenerlo in un congelatore-80 ᵒC per immagazzinaggio a lungo termine.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. preparazione di a. fumigatus per NMR allo stato solido e studi di DNP
<ol><li>Preparazione di a. fumigatus per esperimenti NMR allo stato solido<ol>
<li>Dializzare il 13C, 15N-labeled fungine campione (passo 1.2.4.) contro 1 L di tampone fosfato 10 mM (pH 7,0) a 4 ° C, con un sacchetto di dialisi con 3,5 peso molecolare kDa taglio per rimuovere piccole molecole da mezzo di crescita per un periodo complessivo di 3 giorni. Modificare il buffer due volte al giorno. Nota: In alternativa, il campione potrebbe essere lavato per 6 - 10 volte con acqua deionizzata per rimuovere residui piccole molecole.</li>
		<li>Trasferire il campione in una provetta da 15 mL e centrifugare per 5 min (10.000 x g) utilizzando una centrifuga da banco. Rimuovere il supernatante e raccogliere i restanti materiali fungini.</li>
		<li>Confezione: 70-80 mg dell'uniformemente 13campione marcato C e ben idratata incollare in un di ZrO2 rotore a 4 mm o 30-50 mg per rotori di 3,2 mm per esperimenti NMR. Ripetutamente spremere l'esempio delicatamente utilizzando una bacchetta di metallo e assorbire l'acqua in eccesso con carta.</li>
		<li>Strettamente il rotore di cap e inserire il campione lo spettrometro per caratterizzazione NMR allo stato solido. Nota: I rotori nuovo di zecca sono suggeriti per minimizzare la possibilità di arresto del rotore e fuoriuscita nello spettrometro NMR di esempio. Se necessario, un inserto monouso di Kel-F con viti di tenuta può essere utilizzato per servire come un contenitore secondario all'interno del rotore.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparazione di campioni di a. fumigatus per esperimenti DNP<ol>
<li>Preparare 100 µ l di DNP solventi29,44 (noto anche come la matrice DNP) in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL per 13C,15N-labeled fungine campioni. Questa matrice DNP contiene una miscela di d8-glicerolo/D2O/H2O (30/60/10% in volume). Nota: Se senza etichetta campioni sono da studiare, quindi preparare la matrice di DNP utilizzando 13C-vuotati d8-glicerolo (12C3, 99,95%; D8, 98%) e D2O e H2O per evitare 13C segnale contributo da solventi.</li>
		<li>Sciogliere 0,7 mg di AMUPol45 a 100 µ l di solventi DNP di soluzione stock radicale modulo 10 mM. Vortex per 2-3 min garantire che i radicali sono completamente dissolto nella soluzione.</li>
		<li>Ammollo 10 mg del dializzato 13C, 15N-labeled fungine materiali come descritto nei passaggi precedenti (punti 2.1.1 e 2.1.2) in 50 µ l di soluzione di AMUPol e macinare leggermente il composto con un mortaio e un pestello per garantire la penetrazione dei radicali in le pareti della cellula porose. Nota: Per ridurre il tasso di perdita di idratazione, la macinazione può anche avvenire in una microcentrifuga utilizzando un micropestle.</li>
		<li>Aggiungere un altro 30 µ l della soluzione radicale al pellet macinato all'ulteriore idrato il campione fungo.</li>
		<li>Imballare il pellet in un rotore di zaffiro di 3,2 mm, spremere leggermente e rimuovere l'eccesso di solvente DNP. Aggiungere un tappo di silicone 3,2 mm per evitare la perdita di idratazione. In genere, 5-30 mg di campione possono essere confezionati al rotore. L'importo esatto deve essere determinata dall'esigenza di sensibilità degli esperimenti NMR essere condotto.</li>
		<li>Inserire e girare il campione in uno spettrometro DNP, misurare un spettro di DNP-aumentata sotto irradiazione a microonde e confrontarlo con lo spettro di forno a microonde. Questo porterà ad un aumento fattore εinserita/disinserita, che dovrebbe essere di 20-40 per questi materiali complessi. Eseguire gli esperimenti progettati per determinare la struttura della parete cellulare.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. preparazione di biomassa vegetale per NMR e studi DNP
<ol><li>Preparazione di materiali vegetali per NMR allo stato solido<ol>
<li>Uniformemente producono 13C-etichetta piante interne utilizzando 13CO2 forniture in un crescita camera o 13C-medium del glucosio come descritto in precedenza46,47 o acquistare direttamente i materiali etichettati dai marcatura a isotopi aziende. Nota: 13C-glucosio utilizzabile solo in crescita scuro per evitare l'introduzione di 12C dalla fotosintesi.</li>
		<li>Tagliare l'uniformemente 13C con etichetta materiale vegetale in piccoli pezzi (in genere 1-2 mm di dimensione) utilizzando una lama di rasoio di laboratorio. Nota: A seconda dello scopo, le pareti della cellula estratte a volte sono usate per la caratterizzazione strutturale e i protocolli dettagliati sono riportati nel precedente studi21,46.</li>
		<li>Se il campione è stato preventivamente essiccato, aggiungere 100 µ l di acqua a 30 mg di materie vegetali in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL, vortice, equilibrare a temperatura ambiente per 1 giorno. Centrifugare a 4.000 x g per 10 min e togliere l'acqua in eccesso utilizzando una pipetta.</li>
		<li>Se il campione è stato mai seccato in qualsiasi punto, utilizzare direttamente il campione senza ulteriore trattamento.</li>
		<li>Imballare i materiali di pianta risultante in 3,2 mm o 4 mm ZrO2 rotori per esperimenti NMR allo stato solido.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparazione di materiali vegetali per studi DNP<ol>
<li>Preparare 60 µ l di soluzione di 10 mM AMUPol radicale come descritti passaggi 2.2.1 e 2.2.2.</li>
		<li>Tagliare l'uniformemente 13C con etichetta materiale vegetale da studiare in piccoli pezzi (1-2 mm di dimensione) utilizzando una lama di rasoio di laboratorio e pesano 20 mg di materiali vegetali.</li>
		<li>Mano-frantumare i pezzi di pianta in piccole particelle (~ 1-2 mm di dimensione) utilizzando un mortaio e un pestello. Le polveri finale hanno un aspetto omogeneo.</li>
		<li>Aggiungere 40 µ l di soluzione madre DNP preparato nel passaggio precedente (punto 2.2.2) e al materiale vegetale e macinare leggermente per 5 min garantire omogeneità di miscelazione con il radicale.</li>
		<li>Aggiungere un altro 20 µ l di soluzione di riserva per idratare ulteriormente il materiale vegetale dopo macinazione.</li>
		<li>Imballare il campione di pianta equilibrato in un rotore di zaffiro di 3,2 mm per esperimenti di DNP. Inserire un tappo di silicone per evitare la perdita di idratazione.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. gli esperimenti NMR allo stato solido standard per la caratterizzazione iniziale dei biomateriali ricchi di carboidrati
Nota: Una breve descrizione degli esperimenti NMR è fornita in questa sezione. Tuttavia, delucidazione strutturale richiede in genere una vasta esperienza. Pertanto, si raccomanda agli sforzi di collaborazione con strutturisti NMR.
<ol><li>Misura 1D 13C Cross polarizzazione (CP), 13C polarizzazione diretta (DP) con 2 s e 35-s riciclare ritardi e 1H -13C inetto49 spettri48,per ottenere una comprensione generale della dinamica distribuzione di componenti delle cellule (Figura 1a). Le pareti cellulari sono in genere parte relativamente rigida e mostrano segnali dominanti nello spettro CP.</li>
	<li>Misurare una serie di esperimenti di correlazione 2D standard 13C -13C per le assegnazioni di risonanza dei segnali 13C. Iniziare con inadeguata riorientato50,51 per ottenere la connettività di carbonio, che hanno bisogno di essere assistito da una serie di esperimenti, attraverso lo spazio come 1.5-ms RFDR52 (Figura 1b) e cavo di 50 ms/DARR53 esperimenti. Nota: Se è di interesse per trovare un campione ricco di un componente specifico, ad esempio, il primario o pareti di cella secondaria, quindi più segmenti o impianti multipli necessario misurare separatamente per trovare l'esempio con la composizione ottimale.</li>
	<li>Condurre esperimenti di correlazione13C 2D 15N - che possono essere misurati per facilitare le assegnazioni di risonanza di proteine e carboidrati azotate. Nota: L'assegnazione di risonanza è in genere molto tempo. Un metodo è attualmente in fase di sviluppo per facilitare l'assegnazione di risonanza dei segnali di carboidrati per quegli scienziati senza precedente esperienza.</li>
	<li>Misurare gli esperimenti più specializzati per determinare la prossimità spaziale (Figura 1 c, d), l'idratazione e la mobilità di biomolecole complesse per determinare la struttura tridimensionale dei materiali ricchi di carboidrati come sistematicamente descritta precedentemente22,29.</li>
</ol>

Non abbiamo nulla di divulgare.

Confrontato con i metodi biochimici, NMR allo stato solido ha vantaggi come una tecnica non distruttiva e ad alta risoluzione. NMR è anche in analisi della composizione quantitativa, e a differenza di molti altri metodi analitici, fa non sono le incertezze introdotte dalla solubilità limitata dei biopolimeri. Istituzione dell'attuale protocollo facilita gli studi futuri su biomateriali ricchi di carboidrati e polimeri funzionalizzati. Tuttavia, dovrebbe essere notato che l'analisi di dati e di assegnazione di risonanza p...

Carboidrati svolgono un ruolo centrale in vari processi biologici come stoccaggio di energia, costruzione strutturale e riconoscimento cellulare e adesione. Sono arricchiti nella parete delle cellule, che è un componente fondamentale in piante, funghi, alghe e batteri1,2,3. La parete cellulare funge da una fonte centrale per la produzione di biocombustibili e biomateriali, come pure un bersaglio promettente per terapie antimicrobiche4,5,6,7,8 , 9.
La moderna comprensione di questi materiali complessi è stato sostanzialmente avanzata da decenni di sforzi che sono stati dedicati alla caratterizzazione strutturale utilizzando quattro principali metodi biochimici o genetici. Il primo metodo principale si basa su trattamenti sequenziali utilizzando sostanze chimiche aggressive o enzimi per abbattere i muri della cella in diverse porzioni, che è seguita da compositivo e analisi di linkage di zuccheri in ogni frazione10. Questo metodo mette in luce la distribuzione di dominio dei polimeri, ma l'interpretazione può essere fuorviante a causa delle proprietà chimiche e fisiche di biomolecole. Ad esempio, è difficile determinare se la frazione di alcali-estraibile ha origine da un singolo dominio di molecole meno strutturati o da molecole nello spazio separate con solubilità paragonabile. In secondo luogo, le porzioni estratte o intere pareti della cellula può anche essere misurate utilizzando soluzione NMR per determinare i legami covalenti, anche definiti come reticolazione, tra molecole diverse11,12,13, 14,15. In questo modo, potrebbe essere sondata la struttura dettagliata delle ancore covalente, ma possono esistere limitazioni a causa della bassa solubilità di polisaccaridi, il numero relativamente piccolo di reticolazione siti e l'ignoranza degli effetti non-covalente che stabilizza imballaggio di polisaccaride, inclusi legami a idrogeno, forza di van der Waals, interazione elettrostatica e dell'intrico di polimero. In terzo luogo, l'affinità di legame è stata determinata in vitro utilizzando polisaccaridi isolato16,17,18,19, ma la purificazione delle procedure possono alterare sostanzialmente la struttura e le proprietà di queste biomolecole. Questo metodo inoltre non riesce a replicare la deposizione sofisticato e l'assemblaggio di macromolecole dopo biosintesi. Infine, il fenotipo, morfologia delle cellule e proprietà meccaniche dei mutanti genetici con produzione attenuato di certo componente della parete cellulare capannone luci sulle funzioni strutturali di polisaccaridi, ma prova più molecolare è necessaria per colmare questi osservazioni macroscopiche con la funzione ingegnerizzata di proteina macchinari20.
Recenti progressi nello sviluppo e applicazione della spettroscopia NMR allo stato solido multidimensionale hanno introdotto un'occasione unica per risolvere questi enigmi strutturali. Indagini ad alta risoluzione della composizione e architettura di materiali ricchi di carboidrati nello stato nativo senza perturbazione principali abilitare esperimenti NMR allo stato solido 2D/3D. Studi strutturali sono stati condotti con successo sia primaria e pareti di cella secondaria delle piante, la biomassa cataliticamente trattata, biofilm batterico, il pigmento fantasmi in funghi e, di recente dagli autori, le pareti della cellula intatte in un fungo patogeno Aspergillus fumigatus 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31. lo sviluppo di polarizzazione nucleare dinamica (DNP)32,33,34,35,36,37,38 , 39 , 40 , 41 , 42 facilita sostanzialmente delucidazione strutturale NMR in quanto l'aumento di sensibilità di DNP contrassegnato riduce il tempo sperimentale su questi biomateriali complessi. Il protocollo descritto qui i dettagli le procedure per la marcatura a isotopi del fungo a. fumigatus e preparando fungine e campioni di piante per la caratterizzazione NMR e DNP a stato solido. Procedure di etichettatura simili dovrebbero essere applicabile ad altri funghi con alterato medio, e le procedure di preparazione del campione dovrebbero essere generalmente applicabile ad altri biomateriali ricchi di carboidrati.

<table><tbody><tr><td>Molibdato di ammonio tetraidrato</td><td>Acros Organics</td><td>12054-85-2</td><td></td></tr><tr><td>AMUPol</td><td>Cortecnet</td><td>C010P002</td><td></td></tr><tr><td>Bilancia analitica</td><td>Ohaus</td><td>B730439218</td><td>Modello PA84C</td></tr><tr><td>Bioclave 16 L</td><td>VWR</td><td>470230-598</td><td></td></tr><tr><td>Armadio di biosicurezza</td><td>Labconco corporation</td><td>302319100</td><td></td></tr><tr><td>Acido borico</td><td>Negozio VWR</td><td>BDH9222</td><td>a 15-30 gradi C</td></tr><tr><td>Cloruro di cobalto (II) esaidrato</td><td>Honeywell|Fluka</td><td>60820</td><td>&ge; 98</td></tr>% <tr><td>di rame (II) solfato pentaidrato</td><td>BDH</td><td>BDH9312</td><td>&ge; 98 %</td></tr><tr><td>Corning LSE incubatore di agitazione</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>7202152</td><td></td></tr><tr><td>D2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>151882</td><td>99,9 atom %</td></tr><tr><td>D d6-DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>151874</td><td>99,9 atom % D</td></tr><tr><td>d8-glicerolo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>447498</td><td>&ge; 99 atomi % D</td></tr><tr><td>Tubo per dialisi 3,2 kDa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2272</td><td>132724</td></tr><tr><td>Dipotassio fosfato</td><td>VWR</td><td>BDH9266</td><td>&ge; 98 %</td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5516</td><td>&ge; 99,5 %</td></tr><tr><td>Heraus Megafuge 16R Centrifuga</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>750004271</td><td>RCF massima 25.830 x g</td></tr><tr><td>HR-MAS Kit di inserti monouso</td><td>Bruker</td><td>B4493</td><td>Kel-F</td></tr><tr><td>Solfato di ferro (II) eptaidrato</td><td>Alfa Aesar</td><td>14498</td><td>&ge; 99+ %</td></tr> <tr><td>di solfato di magnesio eptaidrato</td><td>VWR</td><td>10034998</td><td>conservare a 18-26 gradi C</td></tr><tr><td>Cloruro di manganese (II) tetraidrato</td><td>Alfa Aesar</td><td>11563</td><td>&ge; 99 %</td></tr> <tr><td>fosfato monopotassico</td><td>VWR</td><td>470302-254</td><td>&ge; 99 %</td></tr><tr><td>pHmetro</td><td>Mettler Toledo</td><td>B706689216</td><td></td></tr><tr><td>Tetrasodio Etilendiamminotetraacetato</td><td>Acros Organics</td><td>13235-36-9</td><td>&ge; 99,5 %</td></tr> <tr><td>Solfato di Zinco Eptaidrato</td><td>Alfa Aesar</td><td>33399</td><td>&ge; 98 %</td></tr><tr><td>12C3, d8-glicerolo</td><td>Cambridge Isotope Laboratory</td><td>CDLM-8660</td><td>12C3, 99,95%; D8, 98%</td></tr><tr><td>13C6-glucosio</td><td>Sigma Alrdrich</td><td>364606</td><td>&ge; 99 % (CP)</td></tr><tr><td>15N-nitrato di sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>364606</td><td>&ge; 98 % 15N, &ge; 99 (cp)</td></tr><tr><td>Rotore NMR in zaffiro da 3,2 mm</td><td>Cortecnet</td><td>B6939</td><td></td></tr><tr><td>Tappo in silicone da 3,2 mm</td><td>Bruker</td><td>B7089</td><td></td></tr><tr><td>Kit rotore MAS da 4 mm</td><td>Bruker</td><td>H14355</td><td>Zirconia</td></tr></tbody></table>

preparazione di funghi e materiali vegetali per delucidazione strutturale utilizzando dinamico polarizzazione nucleare nmr allo stato solido

Preparation of Fungal and Plant Materials for Structural Elucidation Using Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR

Questo protocollo viene illustrato come uniformemente 13C, 15N-labeled fungine materiali possono essere prodotta e come questi materiali morbidi dovrebbero essere proceduti per NMR allo stato solido e sensibilità avanzata DNP esperimenti. La procedura di elaborazione del campione di biomassa vegetale è anche dettagliata. Questo metodo consente la misurazione di una serie di 1D e 2D 13C -13C / gli spettri di correlazioni15N, che consente ad alta risoluzione delucidazione strutturale dei complessi biomateriali nel loro stato nativo, con minima perturbazione. L'isotopo-etichettatura può essere esaminato da quantificare l'intensità negli spettri di 1D e l'efficienza del trasferimento di polarizzazione negli spettri di correlazione 2D. Il successo della preparazione del campione di polarizzazione nucleare dinamica (DNP) possa essere valutato per il fattore di aumento di sensibilità. Ulteriori esperimenti esaminando gli aspetti strutturali del polisaccaridi e proteine porterà ad un modello dell'architettura tridimensionale. Questi metodi possono essere modificati e adattati per studiare una vasta gamma di materiali ricchi di carboidrati, tra cui le pareti della cellula naturale di piante, funghi, alghe e batteri, così come sintetizzato o progettato carboidrati polimeri e il loro complesso con altri molecole.

La marcatura a isotopi sostanzialmente aumenta la sensibilità di NMR e rende possibile per una serie di 13C -15N correlazione spettri per analizzare la composizione, l'idratazione, la mobilità e 2D 13C -13C di misura e l'imballaggio di polimeri, che saranno integrati per costruire un modello tridimensionale dell'architettura della parete cellulare (Figura 1). Se l'etichettatura uniforme ha esito positivo, un set com...

Un protocollo per la preparazione 13C,15campioni fungini e vegetali N-etichettati per spettroscopia NMR allo stato solido multidimensionale e indagini di polarizzazione nucleare dinamica (DNP) è presentato.

Preparazione di funghi e materiali vegetali per delucidazione strutturale utilizzando dinamico polarizzazione nucleare NMR allo stato solido

This protocol shows how uniformly 13C, 15N-labeled fungal materials can be produced and how these soft materials should be proceeded for solid-state NMR ...

Questo protocollo può essere utilizzato per preparare materiali fungini e vegetali per la risonanza magnetica nucleare allo stato solido, o NMR, e la polarizzazione nucleare dinamica, o DNP, esperimenti per la caratterizzazione di biosistemi complessi. Questa tecnica ci permette di studiare i biomateriali a un livello di risoluzione atomica nel loro ambiente nativo, ad esempio, in intere cellule. L'acquisizione di informazioni strutturali ad alta risoluzione sui materiali fungini contribuirà allo sviluppo di farmaci antifungini.Il metodo fornisce informazioni sulla composizione e la struttura dei carboidrati complessi nelle pareti cellulari fungine e può essere applicato a molti organismi ricchi di carboidrati, tra cui piante, funghi, alghe e batteri. Alcuni investigatori possono lottare con la contaminazione fungina nelle loro colture cellulari. Il mio consiglio è di sterilizzare accuratamente il mezzo e le attrezzature prima dell'uso per prevenire questa contaminazione.Questa dimostrazione aiuterà gli investigatori con poca esperienza nella coltura NMR o cellulare a imparare come implementare queste tecniche nei sistemi fungini e vegetali. Per preparare un mezzo di crescita liquido non etichettato, sciogliere 6,5 grammi di estratto di lievito peptone destrosio o polvere YPD in 100 millilitri di acqua distillata, quindi autoclavare la soluzione risultante per 25 minuti a 134 gradi Celsius. Per preparare un mezzo di crescita solido senza etichetta, aggiungere 6,5 grammi di polvere di agar YPD a 100 millilitri di acqua distillata e autoclavare il mezzo per 25 minuti a 121 gradi Celsius, prima di raffreddare il mezzo a circa 50 gradi Celsius.Quindi, trasferire da 13 a 15 millilitri del mezzo di crescita solido fuso in singole piastre di Petri di plastica sterile e posizionare immediatamente i coperchi sui piatti. Per preparare il mezzo di crescita liquido etichettato carbonio-13, etichettato azoto-15, regolare un volume di 100 millilitri di mezzo minimo contenente isotopi a un pH di 6,6 con acido o base, se necessario. Successivamente, sciogliere i sali elencati nella tabella in 100 millilitri di acqua distillata, aggiungere al carbonio-13, al mezzo di crescita liquido etichettato azoto-15 e autoclavare la soluzione risultante per 25 minuti a 121 gradi Celsius.Quando la soluzione si è raffreddata a temperatura ambiente, aggiungere 100 microlitri di oligoelementi soluzione all'intero volume di carbonio-13, mezzo minimo etichettato azoto-15. Per far crescere i materiali fungini, utilizzare un anello inoculato per trasferire una piccola quantità di funghi dallo stoccaggio su una piastra YPD e coltivare il fungo per due giorni in un incubatore Celsius di 30 gradi. Alla fine dell'incubazione, utilizzare un nuovo anello inoculante per trasferire un bordo fungino in crescita attiva sul mezzo di crescita liquido etichettato carbonio-13, etichettato azoto-15, e posizionare la coltura a 30 gradi Celsius e 220 rotazioni al minuto per tre o cinque giorni in un incubatore di scuotimento.Quando grandi quantità del fungo coprono il fondo del pallone e galleggiano nel liquido, raccogliere i funghi per centrifugazione e scartare il supernatante. Idratare il pellet con una soluzione appropriata e utilizzare le forcep per raccogliere circa 0,5 grammi del pellet ben idratato per le analisi NMR e DNP. Quindi, mescolare il materiale rimanente con una soluzione di glicerolo al 20% in un tubo conico e posizionare il campione fungino a meno 80 gradi Celsius per la conservazione a lungo termine.Per preparare l'A.fumigatus per l'analisi NMR allo stato solido, utilizzare prima un sacchetto di dialisi con un taglio del peso molecolare di 3,5 kilodalton per dializzare il campione fungino etichettato da 0,5 grammi di carbonio-13, etichettato azoto-15 contro un litro di tampone fosfato 10 millimolare a quattro gradi Celsius per tre giorni per rimuovere piccole molecole dal mezzo di crescita. Al termine della dialisi, trasferire il campione in un tubo da 15 millilitri per la centrifugazione e imballare da 70 a 80 milligrammi della pasta campione uniformemente etichettata al carbonio-13 e ben idratata in un rotore di biossido di zirconio di quattro millimetri. Utilizzare un'asta metallica per spremere delicatamente e ripetutamente il campione, usando la carta per assorbire l'acqua in eccesso.Quindi, limitare saldamente il rotore e inserire il campione nello spettrometro per la caratterizzazione NMR allo stato solido. Per preparare l'A.fumigatus per l'analisi DNP, aggiungere 100 microlitri di matrice DNP in un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri per campione fungino etichettato carbonio-13 e sciogliere 0,7 milligrammi di agente polarizzante in ogni tubo per formare una soluzione di calcio radicale da 10 millimolare. Dopo aver vortice per due o tre minuti per garantire che i radicali siano completamente sciolti nella soluzione, immergere 10 milligrammi di carbonio dializzato-13, campione fungino etichettato azoto-15 in 50 microlitri della soluzione di agente polarizzante e utilizzare un pestello e una malta per macinare delicatamente la miscela per garantire la penetrazione dei radicali nelle pareti cellulari porose.Aggiungere altri 30 microlitri della soluzione radicale al pellet macinato per idratare ulteriormente il campione fungino e imballare il pellet in un rotore di zaffiro da 3,2 millimetri. Spremere leggermente e rimuovere il solvente DNP in eccesso come dimostrato e aggiungere una spina in silicone da 3,2 millimetri per prevenire la perdita di idratazione. Quindi, aggiungere il rotore a uno spettrometro NMR per esperimenti di routine o uno spettrometro DNP per la misurazione dello spettro potenziato da DNP sotto irradiazione a microonde.Per preparare i materiali vegetali per gli studi DNP, utilizzare una lama di rasoio per tagliare il materiale vegetale etichettato in uniforme carbonio-13 in pezzi da uno a due millimetri. Utilizzare un mortaio e un pestello per macinare i pezzi in particelle più piccole fino a quando la polvere finale non ha un aspetto omogeneo. Aggiungere 40 microlitri di soluzione di massa radicale da 10 millimolare al materiale vegetale e macinare leggermente il campione per altri cinque minuti per garantire una miscelazione omogenea con il radicale.Idratare il campione macinato con altri 20 microlitri di soluzione di calcio radicale e imballare il campione di piante equilibrate in un rotore di zaffiro da 3,2 millimetri per l'analisi DNP. Quindi, inserire una spina in silicone per evitare la perdita di idratazione e caricare il campione sullo spettrofotometro DNP. L'etichettatura isotopica migliora sostanzialmente la sensibilità NMR e consente di misurare una serie di spettri di correlazione bidimensionali carbonio-13-carbonio-13 e carbonio-13-azoto-15 per analizzare la composizione, l'idratazione, la mobilità e l'imballaggio dei polimeri per la loro integrazione per la costruzione di un modello tridimensionale di architettura della parete cellulare.Se i segnali off-diagonali sono difficili da ottenere nello spettro 2D carbonio-13-carbonio-13, potrebbe essersi verificata un'etichettatura statistica. I due picchi di carbonio-13 a 96 e 92 parti per milione sono segnali caratteristici di carbonio-1 di glucosio. Pertanto, le loro forti intensità negli spettri quantitativi di polarizzazione diretta carbonio-13 misurati con lunghi ritardi di riciclo di 35 secondi indicano tipicamente il predominio di piccole molecole a causa di dialisi o lavaggio incompleti.Con campioni ben etichettati, le correlazioni a lungo raggio possono essere ulteriormente misurate per rilevare le prossimità spaziali delle biomolecole e per costruire un modello strutturale delle pareti cellulari intatte. Questa tecnica consente di esplorare la funzione di struttura in molti materiali naturali e ingegnerizzati, facilitando studi futuri su biomateriali ricchi di carboidrati e polimeri funzionalizzati. Poiché alcuni funghi possono causare infezioni o malattie sistematiche nell'uomo, assicurarsi di gestire materiali fungini in una cappa di flusso laminare per la protezione e ridurre al minimo l'esposizione.

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Preparazione di funghi e materiali vegetali per delucidazione strutturale utilizzando dinamico polarizzazione nucleare NMR allo stato solido (Video) | JoVE Journal

Preparazione di funghi e materiali vegetali per delucidazione strutturale utilizzando dinamico polarizzazione nucleare NMR allo stato solido

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