Name: Espressione transiente in barbabietola rossa di un vaccino di biofarmaceutica candidato per il diabete di tipo 1 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Scopri come produrre un vaccino orale candidato per il diabete di tipo 1 mediante espressione transiente in barbabietola rossa. Questo metodo sfrutta un sistema vegetale per ottenere alte rese di proteine ricombinanti.

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Questo lavoro è stato supportato dal progetto congiunto "L'uso delle piante per la produzione di un vaccino commestibile di diabete autoimmune (eDIVA)" (progetto ID: 891854) finanziato dall'Università di Verona nell'ambito della chiamata 2014.

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<li>Merlin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+GAD65+production+in+plants+using+the+MagnICON+transient+expression+system%3A+Optimization+of+upstream+production+and+downstream+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Enhanced GAD65 production in plants using the MagnICON transient expression system: Optimization of upstream production and downstream processing.</a> Biotechnology Journal. 11 (4), 542-553 (2016).</li>
<li>Gecchele, E., Merlin, M., Brozzetti, A., Falorni, A., Pezzotti, M., Avesani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comparative+Analysis+of+Recombinant+Protein+Expression+in+Different+Biofactories%3A+Bacteria%2C+Insect+Cells+and+Plant+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems.</a> Journal of Visualized Experiments. 23 (97), (2015).</li>
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<li>Bertini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+a+type-1+diabetes+vaccine+candidate+using+edible+plants+expressing+a+major+autoantigen%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Design of a type-1 diabetes vaccine candidate using edible plants expressing a major autoantigen.</a> Frontiers in Plant Science. 9, Article 572 (2018).</li>
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<li>Sepúlveda-Jiménez, G., Rueda-Benítez, P., Porta, H., Rocha-Sosa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+red+beet+%28Beta+vulgaris%29+UDP-glucosyltransferase+gene+induced+by+wounding%2C+bacterial+infiltration+and+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">A red beet (Beta vulgaris) UDP-glucosyltransferase gene induced by wounding, bacterial infiltration and oxidative stress.</a> Journal of Experimental Botany. 56, jxb/eri036 (2005).</li>
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<li>Tuesca, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complexation+hydrogels+for+oral+insulin+delivery%3A+effects+of+polymer+dosing+on+in+vivo+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Complexation hydrogels for oral insulin delivery: effects of polymer dosing on in vivo efficacy.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 97, 2607-2618 (2008).</li>
<li>Twyman, R. M., Schillberg, S., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+the+yield+of+recombinant+pharmaceutical+proteins+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Design%22%5BJournal%5D)">Optimizing the yield of recombinant pharmaceutical proteins in plants.</a> Current Pharmaceutical Design. 19, 5486-5494 (2013).</li>
<li>Dhama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant-based+oral+vaccines+for+human+and+animal+pathogens+%E2%80%93+a+new+era+of+prophylaxis%3A+current+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology+and+Agricultural+Sciences%22%5BJournal%5D)">Plant-based oral vaccines for human and animal pathogens – a new era of prophylaxis: current and future perspectives.</a> Journal of Experimental Biology and Agricultural Sciences. 447 (0), 75-93 (2013).</li>
<li>Hefferon, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconceptualizing+cancer+immunotherapy+based+on+plant+production+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Future+science%22%5BJournal%5D)">Reconceptualizing cancer immunotherapy based on plant production systems.</a> Future science. O3, FSO217 (2017).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

In questo studio abbiamo mostrato analisi preliminare per la progettazione di un candidato vaccino orale per il diabete autoimmune. La proteina dell'obiettivo per questo esperimento era una forma mutata dell'umana 65 kDa glutammato decarbossilasi, quali produzione e funzionalità sono facilmente rilevabili e misurabili12. Sua espressione nei tessuti vegetali commestibili diversi è stata mediata da vettori5, che mediare un elevato livello di produzione di proteine ricombinant...

Dopo la rivoluzione di biologia molecolare vegetale del 1980, sistemi basati su impianto per la produzione di prodotti biofarmaceutici possono essere considerati come un'alternativa ai sistemi tradizionali basati su cellule microbiche e mammiferi1. Piante mostrano diversi vantaggi rispetto ai tradizionali piattaforme, con scalabilità, economicità e sicurezza essendo il più rilevanti2. Il prodotto ricombinante può essere purificato da tessuti vegetali trasformati e quindi somministrato, sia per via parenterale o per via orale e, inoltre, trasformata pianta commestibile può essere utilizzata direttamente per la consegna orale. Via orale contemporaneamente promuove l'immunità mucosa e sistemica, ed elimina la necessità per gli aghi e personale medico specializzato. Inoltre, la consegna orale Elimina la complessa elaborazione a valle, che normalmente rappresenta l'80% del costo totale di produzione di una proteina ricombinante3. Tutti questi vantaggi possono essere tradotte in risparmio in produzione, di forniture e di lavoro riducendo i costi di ogni dose, rendendo il farmaco a prezzi accessibili alla maggior parte della popolazione mondiale.
Diverse strategie, sia per la trasformazione stabile ed espressione transitoria, sono state sviluppate per la produzione di proteine ricombinanti in pianta. Fra loro, un sistema di espressione basata su virus ad alto rendimento decostruito pianta (per esempio, magnICON) fornisce prestazioni superiori che portano alti rendimenti di proteine ricombinanti sulle scale cronologiche relativamente breve4. Molti esempi di espressione transiente utilizzando il sistema di espressione basata su virus vegetali in piante di Nicotiana benthamiana sono segnalati, essendo l'host di produzione aurea. Tuttavia, questa pianta di modello non è considerata una specie commestibile a causa gli alcaloidi e altri metaboliti tossici che si accumulano nelle sue foglie.
In questo lavoro descriviamo il confronto tra due sistemi di pianta commestibile, barbabietola rossa (Beta vulgaris cv Moulin Rouge) e spinaci (Spinacea oleracea cv Industria), per l'espressione delle due forme di candidato dell'isoforma 65 kDa di acido glutammico decarbossilasi (GAD65), l'impianto basato su virus vettori5. GAD65 è un autoantigen principale associato al diabete di tipo 1 (T1D) ed è attualmente sotto inchiesta nei test clinici umani per impedire o ritardare il T1D inducendo tolleranza6. La produzione di GAD65 nelle piante è stata studiata estesamente in specie di piante modello come Nicotiana tabacum e benthamiana N.4,5,6,7. Qui, descriviamo l'uso di specie vegetali commestibili per la produzione della molecola nei tessuti che può essere destinata per una consegna orale diretta. Da un punto di vista tecnico, abbiamo studiato e selezionato il sistema per pianta agroinfiltrazione e la piattaforma di pianta commestibile per la produzione di GAD65 valutando diversi parametri: livelli di espressione della proteina ricombinante, la carica microbica residua nell'impianto tessuto significato per somministrazione orale, la resistenza di GAD65 alla digestione gastrica e la bioequivalenza delle piante trasformate con il tipo selvaggio.

<table><tbody><tr><td>0.2-&mu; m Filtri a membrana Minisart RC4</td><td>Sartorius-Stedim</td><td>17764</td><td></td></tr><tr><td>2&ndash; mercaptoetanolo</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td>Tossico; 4 % per fare tampone di carico con glicerolo, SDS e Tris-HCl</td></tr><tr><td>4-Morfolinetsulfonic acid (MES)</td><td>Sigma</td><td>M8250</td><td>pH 5.5</td></tr><tr><td>Piastra a 96 pozzetti</td><td>Sarstedt</td><td>833924</td><td></td></tr><tr><td>Acido acetico</td><td>Sigma</td><td>27221</td><td>Corrosivo</td></tr><tr><td>Acetonitrile LC-MS grado</td><td>Sigma</td><td>34967</td><td></td></tr><tr><td>Acetosyringone</td><td>Sigma</td><td>D134406</td><td>Tossico - 0,1 M stock in DMSO</td></tr><tr><td>Agar Grado batteriologico</td><td>Applichem</td><td>A0949</td><td>15 g/L per rendere LB medium (pH 7,5 con NaOH) con estratto di lievito, NaCl e triptone</td></tr><tr><td>formiato di ammonio</td><td>Sigma</td><td>70221</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-eGFP</td><td>ABCam</td><td>ab290</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-GAD 65/67</td><td>Sigma</td><td>G5163</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-LHCB2</td><td>Agrisera</td><td>AS01 003</td><td></td></tr><tr><td>Blu Brillante R-250</td><td>Sigma</td><td>B7920</td><td></td></tr><tr><td>C18 Colonna Grace</td><td></td><td> &nbsp; -</td><td>Alltima HP C18 (150 mm x 2,1 mm; 3 &mu; m) Colonna</td></tr><tr><td>C18 Colonna di guardia</td><td>Grace</td><td>&nbsp; &nbsp; -</td><td>Alltima HP C18 (7,5 mm x 2,1 mm; 5 &mu; m) Guardia&nbsp; Colonna</td></tr><tr><td>CalMag Grower</td><td>Peter Excel</td><td>15-5-15</td><td>Fertilizzante</td></tr><tr><td>Carbenicillina disodica</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>C0109</td><td>Sistema di</td></tr><tr><td>imaging a chemiluminescenza</td> tossica <td>BioRad</td><td>1708370</td><td>ChemiDoc Touch Imaging System</td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>Sigma</td><td>C2432</td><td></td></tr><tr><td>Detergente</td><td>Sigma</td><td>P5927</td><td>Polisorbato 20</td></tr><tr><td>Lettore a fluorescenza</td><td>Perkin-Elmer</td><td> 1420-011</td><td>VICTOR Multilabel Counter</td></tr><tr><td>Acido formico LC-MS grado</td><td>Sigma</td><td>94318</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td>15 % per fare tampone di carico con Tris-HCl, SDS e 2&ndash; mercaptoetanolo</td></tr><tr><td>GoTaq G2 polimerasi</td><td>Promega</td><td>M7841</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>Colonna HILICA</td> corrosiva <td>Grace</td><td> &nbsp; -</td><td>Ascentis Express HILIC (150 mm x 2,1 mm; granulometria 2,7 &mu; m) Colonna</td></tr><tr><td>HILIC Guard</td><td>Colonna Grace</td><td>&nbsp; &nbsp; -</td><td>Vision HT HILIC (7,5 mm x 2,1 mm; 3 &mu; m) Guardia&nbsp; Colonna</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-coniglio coniugato perossidasi di rafano (HRP)</td><td>Sigma</td><td>A6154</td><td>Non congelare/scongelare troppe volte</td></tr><tr><td>Autocampionatore HPLC</td><td>Beckman Coulter</td><td>&nbsp; &nbsp; -</td><td>Sistema Gold 508 Autocampionatore</td></tr><tr><td>Sistema HPLC</td><td>Beckman Coulter</td><td>&nbsp; &nbsp; -</td><td>Sistema Gold 128 Modulo solvente HPLC</td></tr><tr><td>Isopropanolo</td><td>Sigma</td><td>24137</td><td>Solfato di</td></tr><tr><td>kanamicina</td> infiammabile <td>Sigma</td><td>K4000</td><td>Tossico</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td>2 g/L con NaCl, Na2HPO4 e KH2PO4 per rendere PBS</td></tr><tr><td>KH2PO4 </td><td>Sigma</td><td>P9791</td><td>2,4 g/L con NaCl , Na2HPO4 e KCl per realizzare la soluzione PBS</td></tr><tr><td>Loading Buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luminol</td><td>Ge Healthcare</td><td>RPN2232</td><td>Preparare la soluzione utilizzando il kit commerciale ECL Prime Western Blotting System</td></tr><tr><td>Liofilizzatore</td><td>5Pascal</td><td>LIO5P0000DGT</td><td></td></tr><tr><td>Spettrometro di massa</td><td>Bruker -</td><td></td><td>Bruker Esquire 6000; lo spettrometro di massa era dotato di una sorgente ESI e l'analizzatore era una trappola ionica</td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Sigma</td><td>32213</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione bloccante del latte</td><td>Ristora</td><td>&nbsp; &nbsp; -</td><td>3 % in PBS</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S7907</td><td>Utilizzare con NaH2PO4 per produrre il tampone fosfato di sodio</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td>80 g/L con KCl, Na2HPO4 e KH2PO4 per produrre PBS; 10 g/L per rendere il terreno LB (pH 7,5 con NaOH) con estratto di lievito, Triptone e Agar Grado batteriologico</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td>&nbsp; Utilizzare con Na2HPO4 per produrre tampone fosfato di sodio; 14,4 g/L per produrre PBS</td></tr><tr><td>NaOH</td><td></td><td>Sigma S8045</td><td></td></tr><tr><td>Membrana nitrocellulasi</td><td>Ge Healthcare</td><td>10600002</td><td></td></tr><tr><td>Pepsina dalla mucosa gastrica suina</td><td>Sigma</td><td>P7000</td><td></td></tr><tr><td>Substrato perossidasi ECL</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN2235</td><td>Materiale sensibile alla luce</td></tr><tr><td>Pompa Pressa per vuoto</td><td>VWR</td><td>111400000098</td><td></td></tr><tr><td>Reagente A</td><td>Sigma</td><td>B9643</td><td>Utilizzare 50 parti di questo reagente con 1 parte di reagente B per preparare la soluzione di lavoro BCA</td></tr><tr><td>Reagente B</td><td>Sigma</td><td>B9643</td><td>Utilizzare 1 parte di questo reagente con 50 parti di reagente A per preparare la soluzione di lavoro BCA</td></tr><tr><td>Rifampicina</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>R0146</td><td>Tossico - 25 mg/mL stock in DMSO</td></tr><tr><td>SDS (Sodium dodecyl sulfate)</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td>Infiammabile, tossico, corrosivo-10 % di materiale; 3 % per fare tampone di carico con Tris-HCl, glicerolo e 2&ndash; mercaptoetanolo</td></tr><tr><td>Metabisolfito di sodio</td><td>Sigma</td><td>7681-57-4</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di sonicazione</td><td>Soltec</td><td>090.003.0003</td><td>Sonica&reg; 2200 MH; frequenza 40 khz</td></tr><tr><td>Siringa</td><td>Terumo</td><td>&nbsp; &nbsp; -</td><td></td></tr><tr><td>Trasparente fisso 300-&micro; Tubi di vetro con inserto a L</td><td>Thermo Scientific</td><td>11573680</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td>Regolare il pH con 1N HCl per fare il tampone Tris-HCl, usare 1,5M Tris-HCl (pH 6,8) per fare il tampone di carico con SDS, glicerolo e 2&ndash; mercaptoetanolo</td></tr><tr><td>Triptone</td><td>Formedium</td><td>TRP03</td><td>10 g/L per rendere LB medium (pH 7,5 con NaOH) con estratto di lievito, NaCl e Agar Concentratore sottovuoto di grado batteriologico</td></tr><tr><td></td><td>Heto</td><td>3878 F1-3</td><td>Speed-vac System</td></tr><tr><td>Water LC-MS grade</td><td>Sigma</td><td>39253</td><td></td></tr><tr><td>Estratto di lievito</td><td>Sigma</td><td>Y1333</td><td>5 g/L per rendere LB medium (pH 7,5 con NaOH) con Triptone, NaCl e Agar Grado Batteriologico</td></tr></tbody></table>

espressione transiente in barbabietola rossa di un vaccino di biofarmaceutica candidato per il diabete di tipo 1

Transient Expression in Red Beet of a Biopharmaceutical Candidate Vaccine for Type-1 Diabetes

L'agricoltura molecolare vegetale è l'uso delle piante per produrre molecole di interesse. In questa prospettiva, piante possono essere utilizzati sia come bioreattori per la produzione e la successiva purificazione del prodotto finale e per la consegna orale diretta delle proteine eterologhe quando utilizzo di specie vegetali commestibili. In questo lavoro, vi presentiamo lo sviluppo di un candidato vaccino orale contro il diabete di tipo 1 (T1D) nei sistemi di pianta commestibile utilizzando la tecnologia di pianta decostruito basati sul virus del DNA ricombinante, consegnata con infiltrazione vuoto. I nostri risultati indicano che una barbabietola rossa è un host adatto per l'espressione transitoria di un autoantigen derivato umano associato al T1D, considerato un candidato promettente come un vaccino di T1D. Foglie producendo il autoantigen accuratamente sono stati caratterizzati per la loro resistenza alla digestione gastrica, per la presenza di carica batterica residua e per il loro profilo metabolico secondario, dando una panoramica del processo produttivo per l'uso potenziale di piante per la consegna orale diretta di una proteina eterologa. La nostra analisi ha mostrato quasi completa degradazione del vaccino candidato liofilizzato orale seguendo una digestione gastrica simulata, suggerendo che è necessaria una strategia di incapsulamento nella fabbricazione del vaccino GAD pianta-derivati.

In questo lavoro, il flusso di lavoro per lo sviluppo di un vaccino orale nei tessuti vegetali commestibili è presentato. Il focus di questo lavoro è l'espressione di una proteina dell'obiettivo in una specie di pianta commestibile host e la caratterizzazione del potenziale vaccino orale.
Il primo passo ha coinvolto la valutazione dell'idoneità della tecnologia di espressione basata su virus della centrale per la produzione di p...

Qui, presentiamo un protocollo per la produzione di un candidato vaccino orale contro il diabete di tipo 1 in una pianta commestibile.

Espressione transiente in barbabietola rossa di un vaccino di biofarmaceutica candidato per il diabete di tipo 1

Plant molecular farming is the use of plants to produce molecules of interest. In this perspective, plants may be used both as bioreactors for the ...

Tra le diverse strategie per la produzione di proteine ricombinanti nelle piante, l'espressione VERS a base vegetale decostruita fornisce prestazioni superiori, portando a rese elevate in un lasso di tempo relativamente breve. La replicazione di questa tecnologia per la produzione di un vaccino orale ha un grande potenziale per diventare un'alternativa ai vaccini convenzionali nel prossimo futuro. Le foglie di barbabietola rossa liofilizzate trasformate transitoriamente accumulano una quantità di antigeni fotografici adatti all'induzione della tolleranza orale nella prevenzione del diabete di tipo uno.Questo protocollo sperimentale potrebbe essere esteso a molte specie commestibili diverse dopo una valutazione caso per caso dell'accumulo di proteine ricombinanti. A manifestare la procedura saranno Edoardo Bertini, Mattia Santoni, Anna Cuccurullo e Roberta Zampieri. Per iniziare questa procedura, coltivare barbabietole rosse e piante di spinaci in una camera di crescita come delineato nel protocollo di testo.Dopo la germinazione dei semi, fertilizzare le piante due volte a settimana con una soluzione di fertilizzante disponibile in commercio a una concentrazione di un grammo per lit

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Questo protocollo descrive un metodo semplice e minimamente invasivo per il trapianto e l'imaging delle cellule NIT-1 in topi immunodeficienti diabetici non obesi (NOD) gravi sfidati con splenociti purificati da topi NOD spontaneamente diabetici.

Monitoraggio bioluminescente della sopravvivenza del trapianto in un modello di trasferimento adottivo del diabete autoimmune nei topi

Questo protocollo delinea una procedura dettagliata per la generazione di cellule T del recettore chimerico dell'antigene (CAR) transitorio utilizzando mRNA non integrato per l'immunoterapia del cancro e fornisce metodi affidabili per valutare le cellule CAR-T e la loro funzione citotossica.

Un approccio non virale per generare cellule T transitorie del recettore dell'antigene chimerico utilizzando l'mRNA per l'immunoterapia del cancro

Scopri come produrre un vaccino orale candidato per il diabete di tipo 1 mediante espressione transiente in barbabietola rossa. Questo metodo sfrutta un sistema vegetale per ottenere alte rese di proteine ricombinanti.

Espressione transiente in barbabietola rossa di un vaccino di biofarmaceutica candidato per il diabete di tipo 1

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