Name: Capacità di differenziazione delle cellule progenitrici umane aortica perivascolare adiposo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: Scopri il potenziale di differenziazione delle cellule progenitrici adipose perivascolari umane in adipociti, osteociti e condrociti. Questo metodo consente di studiare la rigenerazione cardiovascolare e le applicazioni in medicina rigenerativa.

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Riconosciamo l'assistenza di ricerca navigazione a Maine Medical Center per assistere l'assicurato nella ricerca del tessuto clinico, istopatologia e istomorfometria Core (supportato da 1P20GM121301, L. Liaw PI) a Maine Medical Center Research Istituto per sezionamento e colorazione. Questo lavoro è stato supportato da NIH concedere HL141149 R01 (Liaw L.).

L'uso di tessuti umani in questo studio è stato valutato e approvato dall'istituzionale Review Board del Maine Medical Center, e tutto il personale ha ricevuto una formazione adeguata prima della sperimentazione.
1. preparati
<ol><li>Rendere dissociazione buffer mediante ricostituzione 50mg privo di animale collagenasi/dispase ho miscela soluzione con 1 mL di soluzione di lavoro 1 mg/mL di nanopure H2O. preparare aggiungendo 49 mL di alto glucosio DMEM contenente 1% w/v BSA per la collagenosi ricostituita / soluzione di dispase. Conservare le aliquote di lavoro di 5 mL a-20 ° C e riscaldare a 37 ° C, utilizzando una prima vasca di acqua da utilizzare.</li>
	<li>Rendere la soluzione antibiotica aggiungendo 1 mL di soluzione antibiotico/antimicotico di 100 x (concentrazione finale è di 200 unità/mL penicillina, 200 unità/mL di streptomicina e 0,5 µ g/mL fungizone) a 49 mL di HBSS e conservare il ghiaccio.</li>
	<li>Preparare la soluzione di gelatina (0,2% w/v) sciogliendo gelatina 200 mg da pelle bovina in 100 mL di nanopure H2O. Autoclave la soluzione per 20 min e conservare a 4 ° C.</li>
	<li>Preparare 500 mL di coltura PVAT: alto glucosio DMEM/F12 con integratore di glutammina, piruvato di sodio e bicarbonato di sodio, completati con 10% FBS e agente antimicrobico 100 µ g/mL (Vedi Tabella materiali).</li>
	<li>Preparare il supporto di induzione adipogenico 50ml: alto glucosio 40,8 mL DMEM, completato con media di 7,5 mL PVAT sviluppo, 500 µ l di 100 x soluzione antibiotico/antimicotico (concentrazione finale è di 100 unità/mL penicillina, 100 unità/mL di streptomicina e fungizone 0,25 µ g/mL), 0,5 mM IBMX (stock di 500 mM in 0.1 M NaOH), desametasone di 1 µM (stock di 1 mM in etanolo), 5 µM rosiglitazone (stock di 5 mM in DMSO), 33 µM biotina (stock di 66 mM in DMSO), insulina di 100 nM (200 Stock in µM in 0,1% di acido acetico) e acido pantotenico 20 µM (stock di 100 mM in H2 O).</li>
	<li>Preparare 50 mL di media di induzione di controllo per il lignaggio adipogenico: 40,8 mL elevati del glucosio DMEM completate con 7,5 mL PVAT crescita media e 500 µ l di penna-strep (stock x 100).</li>
	<li>Preparare il supporto di manutenzione adipogenico 50ml: 41,5 mL elevati del glucosio DMEM completate con 7,5 mL PVAT crescita media dal passaggio 1.3, 500 µ l penna-strep (stock x 100), desametasone 1 µM (stock di 1 mM in EtOH), 33 biotina µM (stock di 66 mM in DMSO), insulina di 100 nM (stock di 200 µM in 0,1% ac Etic acido) e 20 µM l'acido pantotenico (stock di 100 mM in H2O).</li>
	<li>Preparare 500 mL di terreno di crescita per i lignaggi osteogenici e chondrogenic: αMEM alto glucosio supplementato con 10% FBS, glutammina x 1 supplemento (Vedi Tabella materiali) e 5 mL di penna-strep (stock x 100).</li>
	<li>Preparare 50 mL di media di induzione per la linea osteogenica: 50 mL dei media di crescita del midollo osseo MSC completati con 10 nM desametasone e β-glicerofosfato di 10 mM.</li>
	<li>Preparare 50 mL di media di induzione per il lignaggio di chondrogenic: 50 mL dei media di crescita del midollo osseo MSC completati con 100 nM desametasone, 50 µ g/mL sodio ascorbato-2-fosfato e 10 ng/mL TGFβ1. Per le condizioni osteogeniche e condrogenica, i media di crescita basale del midollo osseo MSC servirà come i media non-induzione.</li>
</ol>2. il protocollo 1: Cultura umana PVAT cellule dalla frazione vascolare Stromal
Nota: PVAT è resecato dal sito dell'anastomosi innesto sull'aorta ascendente di anestetizzati pazienti sottoposti a procedure di innesto di bypass coronarico. PVAT aortica è collocato in un 15 mL conica contenente 10 mL ghiaccio freddo alto glucosio DMEM F12 e trasferito dalla sala operatoria al laboratorio entro 2 h di resezione. PVAT aortica è tessuto scartato durante la procedura di esclusione ed è stata giudicata come ricerca di soggetti non umani da comitato di revisione interna di Maine Medical Center.
<ol><li>Questo protocollo è per un pezzo di ~ 500 mg di PVAT umano (circa 3 x 1 x 0,5 cm3). Trasferimento PVAT umano fresco da DMEM a una provetta conica da 50 mL contenente 25 mL di soluzione antibiotica. Incubare con dondolo per 20 min a 4 ° C. Mentre il PVAT è in soluzione antibiotica, scongelare un'aliquota di tampone di dissociazione a 37 ° C.</li>
	<li>Aggiungere 50 µ l di soluzione di antibiotico/antimicotico x 100 a 5 mL di tampone di dissociazione e sterilizzare usando un filtro di siringa 0,22 µm. Aggiungere 1 mL di soluzione di gelatina 1 bene di una piastra a 24 pozzetti. In una cappa a flusso laminare, utilizzare forbici e pinze sterili per trasferire una capsula di Petri sterile PVAT dalla soluzione antibiotica. Aggiungere 1 mL di tampone di dissociazione pre-riscaldato al tessuto e tritare finemente l'intero tessuto in un impasto semiliquido (nessun pezzi più grandi di ~ 2 x 2 mm2) utilizzando pinze sterili e forbici di dissezione.</li>
	<li>Trasferire l'impasto di 1 mL a 4 mL di tampone di dissociazione e incubare la provetta su un fianco in un agitatore orbitale pre-riscaldato 37 ° C a 200 giri/min per 1 h. Dopo 1 h, pezzi di tessuto visibile non sarà presenti, e la soluzione apparirà come una sospensione cellulare nuvoloso.</li>
	<li>Filtrare la soluzione attraverso un colino di cella µm 70 adagiato sulla cima di una provetta conica da 50 mL. Risciacquare il filtro con un ulteriori 10 mL di soluzione antibiotica per acquisire il numero di celle possibili. Non strizzare il filtro.</li>
	<li>Appallottolare le celle per 12 min a 300 x g in una centrifuga di Benna oscillante. Nota: Dopo centrifugazione, il tubo sarà divisi in uno strato grasso di adipociti, un'interfase e una pallina. Il pellet è la frazione vascolare stromal contenente cellule endoteliali, cellule del sistema immunitario, le cellule del sangue e cellule progenitrici.</li>
	<li>Risospendere il pellet in 10 mL di HBSS e centrifugare per 5 minuti a 300 x g. Ripetere questo passaggio per un totale di 2 lavaggi in HBSS. Dopo il lavaggio finale, non lisare cellule rosse del sangue. Ripetuti tentativi con diversi tamponi disponibili sul mercato e tempi di incubazione hanno portato a profonde riduzioni nel collegamento delle cellule progenitrici e vitalità.</li>
	<li>Aspirare la gelatina dalla piastra a 24 pozzetti. Lavare delicatamente il bene 1x con HBSS rimuovere gelatina non associato.</li>
	<li>Risospendere il pellet di stromal frazione vascolare con globuli rossi intatti in 1 mL di crescita media e seme sulla gelatina-rivestito bene. Aggiungere umano FGF2 (risospesi in PBS completati con BSA 0,01% w/v) a una concentrazione finale di 25 ng/mL nel terreno di coltura. Incubare per 24 h a 37 ° C con 5% CO2.</li>
	<li>Il giorno successivo, Rimuovi crescita media e lavaggio pozzetti 5x con HBSS per rimuovere cellule rosse del sangue e le cellule morte. Aggiungere 1 mL di coltura fresca addizionata di 25 ng/mL FGF2.</li>
	<li>Cambiare il supporto ogni 48 h, assicurandosi di completare con 25 ng/mL FGF2 fresco ogni volta.</li>
	<li>
Cellule in genere raggiungere 100% confluenza 7-10 giorni dopo espianto; cellule di passaggio quindi:
	<ol>
<li>Aspirare la crescita media e lavaggio dello strato monomolecolare 2 x in 1 mL HBSS. Aspirare tutti i HBSS dai pozzetti e aggiungere poche gocce di soluzione di dissociazione delle cellule.</li>
		<li>Toccare e mescolare la piastra e incubare a 37 ° C con 5% CO2 per 5 – 7 minuti sollevare le cellule. Aggiungi ~ 1 mL di terreno di coltura fresco alle cellule indipendente e distribuire 500 µ l 2 pozzetti di una piastra a 24 pozzetti, ogni mezzi di sviluppo contenente 500 µ l e 25 ng FGF2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Continuare a espandere le cellule umane PVAT-derivato, come indicato nel passaggio precedente. Ogni passaggio deve essere non maggiore di una divisione di 1:2. Le celle sono attraversate 5 – 7 volte prima di allocare per le analisi di differenziazione.</li>
</ol>3. protocollo 2: Colonie di coltura del midollo osseo umano MSC
Nota: Midollo osseo umano MSC sono isolato come descritto8 e archiviati come passaggio precoce congelato scorte nel congelare media (70% FBS 20% basale DMEM e 10% DMSO) presso ~ 100.000 cellule/mL nel liquido N2.
<ol><li>Rapidamente scongelare una fiala del midollo osseo MSC dal liquido N2 in un bagno di acqua di 37 ° C e la piastra in un pozzetto di una piastra di coltura 6 pozzetti contenenti 3 mL di coltura MSC e incubare per una notte a 37 ° C e 5% CO2.</li>
	<li>Il giorno successivo, terreni di coltura MSC di aspirare e lavare le cellule 3 x in 2 mL di HBSS. Alla confluenza del 100%, crescita media di aspirare e lavare le cellule 3 x in 2 mL di HBSS. Aggiungere 500 µ l/pozzetto cella distacco soluzione e incubare a 37 ° C e 5% di CO2 per 5 min, toccare la piastra per garantire tutte le celle sono sloggiati e distribuire uniformemente il contenuto 2 pozzetti di una piastra a 6 pozzetti contenente 2 mL MSC crescita media.</li>
	<li>Espandere il midollo osseo umano e MSC PVAT-derivato in parallelo per circa 5 – 7 passaggi o fino a quando una quantità sufficiente per il test è stato raggiunto.</li>
</ol>4. protocollo n. 3: Piastra e indurre adipogenico, osteogenica e lignaggi condrogenica
<ol><li>Numeri di targa appropriato del midollo osseo e PVAT-derivate cellule per pozzetto di una piastra 12-pozzetti e appropriato replica per ogni condizione sperimentale. Per adipogenico e condizioni osteogeniche, ~ 200, 000 – 225.000 cellule/pozzetto sono necessari, per condizioni condrogenica, 150.000 – 175.000 cellule/pozzetto sono necessari. Nota: Abbiamo eseguito un minimo di N = 3 pozzi replicare per controllo e indotto condizioni per ogni stirpe sperimentale per un totale di 2 indipendenti piste (N = 6 ripetizioni in totale).</li>
	<li>Dissociare le cellule da sia la popolazione di cellule progenitrici PVAT umana e la popolazione di MSC del midollo osseo umano utilizzando soluzione di distacco delle cellule e l'incubazione a 37 ° C e 5% CO2 per popolazioni piscina 5 min in fiale conica separato da 15 mL. Girare la fiala giù a 500 x g per 7 min agglomerare le cellule. Risospendere in 1 mL di PBS e utilizzare un emocitometro per stimare il numero di cellulare.</li>
	<li>Le cellule in piatti 12-pozzetti della piastra come indicato al punto 4.1. Fornire piatti separati per condizioni e indotto e indotto non adipogenico, osteogenica, in modo che la condizione di indotto non può essere fissata a un punto precedente del tempo senza interrompere continuando cultura della condizione indotta.</li>
	<li>Aggiungere 1,5 mL di adipogenico e media di induzione osteogenica in ciascun pozzetto della condizione indotta. Aggiungere 1,5 mL di adipogenico e osteogenica non-induzione media in ciascun pozzetto della condizione non-indotta. Iniziare l'incubazione del adipogenico e popolazioni di cellule osteogeniche indotta e indotto non a 37 ° C e 5% CO2.</li>
	<li>Rotazione verso il basso il volume residuo di cellule progenitrici PVAT e midollo osseo umano MSCs per 7 min a 500 x g.</li>
	<li>Determinare il volume necessario per risospendere rimanenti del midollo osseo e cellulari derivate PVAT pellet per ottenere una densità di 100.000 cellule/10 µ l (106 cellule/mL). Risospendere il pellet nel volume calcolato di MSC crescita media per induzione di lignaggio chondrogenic. Spostare delicatamente il volume delle cellule su e giù utilizzando una pipetta per garantire una distribuzione omogenea.</li>
	<li>Dispensare una goccia di 10 µ l della soluzione concentrata di cellule al centro di ciascun pozzetto per formare un micromass di 100.000 cellule. Posizionare 1 mL di sterile H2O nel pozzo adiacente per evitare l'evaporazione. Incubare le colture micromass per 2 ore a 37 ° C e 5% di CO2 per consentire la micromass da aggregare.</li>
	<li>Dopo 2 ore, aggiungere cautamente media di differenziazione condrogenica addizionati con 10 ng/mL TGFβ1 umano a ciascuno dei pozzi stato indotto. Aggiungere con cautela 1,5 mL dei media non-induzione (midollo osseo MSC crescita media) ai pozzetti indotto non condizione. Utilizzare piatti 12-pozzetti separati per le condizioni indotte e indotto non in modo che la condizione indotto non può essere risolto in un momento precedente.</li>
</ol>5. protocollo n. 4: Cultura adipogenico, osteogenica e condrogenica lignaggi per 14 giorni
<ol><li>Le condizioni indotte e indotto non di tutti e tre i stirpi della coltura per 4 giorni a 37 ° C e 5% CO2, rinfrescante media ogni 2 giorni. Il giorno 4, è necessario modificare la condizione di lignaggio adipogenico indotta dal supporto di induzione per mezzi di manutenzione per il resto del saggio.</li>
	<li>Fissare tutte le condizioni di non-indotta in formalina al 10% per 12 h. Dispose di formalina e lavare tutti i fissi pozzetti 2x in PBS per rimuovere ogni traccia di formalina. Conservare piastre in PBS a 4 ° C fino al trattamento.</li>
	<li>Coltura le condizioni indotte per un totale di 14 giorni, rinfrescante media ogni 2 giorni. Aggiungere TGFβ1 fresco a 10 ng/mL concentrazione finale con ogni aggiornamento dei media di induzione condrogenica. Continuare a coltivare il lignaggio adipogenico nei mezzi di manutenzione adipogenico e linea osteogenica induzione media, rinfrescante ogni 2 giorni. Al giorno 14, Difficoltà tutto indotte condizioni per 12 h in formalina al 10% per la colorazione.</li>
	<li>Raschiare o versare il micromass nella condizione condrogenica indotto in una cassetta per l'incorporamento. Disidratare micromass in una serie di bagni di alcool sempre più concentrato per 5 min, cominciando al 70%, quindi 80%, due volte nel 95% e due volte più in alcool assoluto. Posizionare la cassetta in un agente di disalcoolazione e infine incorporare quindi la cassetta in cera di paraffina per sezionamento e colorazione.</li>
</ol>6. protocollo n. 5: Colorazione adipogenico condizione con olio rosso O
<ol><li>Preparare soluzione stock Oil Red O sciogliendo 350mg di Oil Red O in 100 mL di isopropanolo 100%. Mescolare per 2 h con ancoretta e vuoto attraverso un filtro da 0,2 µm. Soluzione madre può essere conservati al buio a temperatura ambiente per 1 anno.</li>
	<li>Preparare Oil Red O soluzione di lavoro mescolando 3 parti di soluzione di riserva a 2 parti diH20 (ad es. 60 mL della soluzione madre a 40ml diH20). La concentrazione finale di Oil Red O della soluzione di lavoro è di 2,1 mg/mL.</li>
	<li>Rimuovere tutto il fluido da pozzi. Lavare ogni bene 2x con 60% isopropanolo, facendo attenzione a rimuovere completamente tutta l'acqua dai lati dei pozzi. Aspirare il 60% isopropanolo e aggiungere rapidamente la soluzione di lavoro Oil Red O senza toccare le pareti dei pozzetti per coprire il fondo. È fondamentale che questo passaggio è fatta rapidamente quindi pozzetti non a secco.</li>
	<li>Una volta aggiunto l'Oil Red O, incubare per 10 minuti a temperatura ambiente con dolce dondolio.</li>
	<li>Rimuovere tutte le Oil Red O e immediatamente aggiungere acqua distillata H2O. Wash con acqua distillata di H2O per 10 m cominciare a rimuovere o non associato olio rosso. Dopo 10 min, aspirare Oil Red O e ripetere la procedura di lavaggio 3 x.</li>
	<li>Una volta che il lavaggio è completo, aggiungere PBS e le celle di immagine. Conservare cellule marcate in PBS a 4 ° C.</li>
</ol>7. protocollo n. 6: Macchiatura osteogenica condizione con rosso alizarina
<ol><li>Rimuovere tutto il liquido da ogni pozzetto. Aggiungere il volume appropriato di soluzione di macchia rosso alizarina 2% ad ogni pozzetto (1,5 mL per pozzetto per un piatto di 12-pozzetti) e inclinare delicatamente il piastra lato a lato fino a quando la soluzione copre completamente il fondo del pozzo.</li>
	<li>Incubare per 15 min a temperatura ambiente. Rimuovere rosso alizarina dai pozzi. Sciacquare delicatamente ogni ben quattro volte con acqua distillata H2O, fare attenzione a non rimuovere i cristalli di calcio. Lasciare per asciugare.</li>
</ol>8. protocollo 7: Colorazione Chondrogenic condizione con Masson tricromica
<ol><li>
Cuocere in forno diapositive in forno secco a 60 ° C per 30 min. sezioni Deparaffinize e idrato di acqua distillata.
	<ol>
<li>Per reidratare, mettere i vetrini in tre 5 min le incubazioni con agenti disalcoolazione, seguiti da 5 min incubazioni in decrescente concentrazioni di alcol come segue: due al 100% (etanolo assoluto), due al 95% di alcol, due a 80%, due al 70% e infine due in acqua distillata H2O. diapositive può rimanere in H2O mentre viene preparato fissativo del Bouin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Posto 40 mL di fissativo del Bouin in un barattolo di plastica coplin microwavable (scoperto). Forno a microonde in alto per portare la temperatura a 55 ° C. Porre il vetrino nella soluzione riscaldata per 20 min; Lasciate riposare sul bancone rivestito. Lavare in acqua corrente per 10 minuti o fino a quando tutto il colore giallo scompare.</li>
	<li>Macchia sezioni in ematossilina di Weigert per 10 min. lavare in acqua corrente per 10 min.</li>
	<li>Macchia di sezioni in soluzione scarlatto Fucsina acida di Beibrich per 10 min lavaggio 3 x 10 min in acqua di rubinetto. Diapositive in soluzione di acido fosfotungstico/fosfomolibdico per 10 min a mordente. Non risciacquare.</li>
	<li>Posizionare le diapositive direttamente nella soluzione dell'anilina blu per 10 minuti risciacquare con due brevi tuffi nell'acqua del rubinetto.</li>
	<li>Mettere i vetrini in soluzione di acido acetico 1% per un minimo di 3 a 5 lavare in acqua di rubinetto per un minimo di 1 posto in etanolo al 95% per 1 min. disidratare come indicato al punto 5.4 e montaggio con resina sintetica.</li>
</ol>

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<li>Ashjian, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+human+processed+lipoaspirate+cells+into+early+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of human processed lipoaspirate cells into early neural progenitors.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 111 (6), 1922-1931 (2003).</li>
<li>Trottier, V., Marceau-Fortier, G., Germain, L., Vincent, C., Fradette, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFATS+collection%3A+Using+human+adipose-derived+stem%2Fstromal+cells+for+the+production+of+new+skin+substitutes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">IFATS collection: Using human adipose-derived stem/stromal cells for the production of new skin substitutes.</a> Stem Cells. 26 (10), 2713-2723 (2008).</li>
<li>Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W., Contreras, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+and+Adipogenesis+Induction+of+Adipocyte+Progenitors+from+Perivascular+Adipose+Tissue+Isolated+by+Magnetic+Activated+Cell+Sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), (2017).</li>
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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Cellule progenitrici adipose da depositi differenti variano ampiamente nel fenotipo e differenziazione potenziali9. Coltura progenitori PVAT-derivati da un singolo donatore paziente in simultanea induzione giù tre stirpi differenti, adipogenico, osteogenica e condrogenica, permette un'indagine ben controllata della capacità pluripotenti di questo romanzo popolazione di cellule progenitrici. La metodologia descritta in questo rapporto può essere utilizzata per verificare la capacità di differenziaz...

Il tessuto adiposo è una ricca fonte di multi-potente cellule staminali mesenchimali (MSC) in grado di differenziarsi in osteogenica, adipogenico e condrogenica lignaggi1. Questo tessuto si espande attraverso l'ipertrofia dei adipocytes maturi e de novo differenziazione delle MSC residente ai adipocytes. Tessuto adiposo perivascolare (PVAT) circonda i vasi sanguigni e regola la funzione vascolare2,3. Espansione di PVAT indotta da obesità aggrava patologie cardiovascolari. Mentre il potenziale multipotente di MSC da depositi adiposi sottocutanei umani sono stati ben studiato4,5, nessuno studio hanno espiantati e valutate la capacità di differenziazione delle cellule progenitrici PVAT-derivati umani, probabile causa di l'invasività degli appalti. Così, l'obiettivo di questo lavoro è fornire una metodologia per explant e propagare cellule progenitrici da umano PVAT aortica da pazienti con malattie cardiovascolari e per testare la loro propensione a differenziare a osteogenica, condrogenica e adipogenico lignaggi. La nostra fonte di PVAT è dal sito dell'anastomosi dell'innesto del bypass su aorta di pazienti obesi sottoposti a chirurgia dell'innesto di bypass coronarico ascendente. PVAT appena isolato è enzimaticamente-dissociata e la frazione vascolare stromal è isolata e propagata in vitro, che ci permette di testare per la prima volta la capacità di differenziazione delle cellule progenitrici PVAT-derivati umani.
Utilizzando primaria coltura umana PVAT stromal frazione vascolare, abbiamo testato tre saggi progettati per indurre le cellule staminali/progenitrici a differenziarsi verso adipogenico, osteogenica, o condrogenica lignaggi. Il nostro studio precedente identificato una popolazione di CD73 +, CD105 + e cellule PDGFRa + (CD140a) che robustamente possono differenziare in adipociti6, anche se non è stata testata loro multipotenza. PVAT regola direttamente il tono e l'infiammazione vascolare7. La spiegazione razionale per testare il potenziale di differenziazione di questa popolazione cellulare romanzo è cominciare a comprendere l'influenza specializzato di PVAT sulla funzione vascolare e meccanismi di espansione di PVAT durante l'obesità. Questa metodologia migliora la nostra comprensione delle funzioni di cellule progenitrici derivate del tessuto adiposo e ci permette di identificare e confrontare le somiglianze e le differenze delle cellule progenitrici da fonti differenti del tessuto. Costruiamo su approcci stabiliti e convalidati per isolare e differenziare MSC verso diversi lignaggi e ottimizzare le procedure per massimizzare la vitalità delle cellule progenitrici PVAT-derivati umani. Queste tecniche hanno vaste applicazioni nei settori di sviluppo del tessuto adiposo e ricerca delle cellule staminali e progenitrici.

<table><tbody><tr><td>Miscela di collagenasi/dispasi senza animali</td><td>Millipore-Sigma</td><td>SCR139</td><td>50mg</td></tr><tr><td>Alcian Blue</td><td>NewComerSupply</td><td>1003A</td><td>1% Soluzione acquosa pH 2,5</td></tr><tr><td>Alizarina Red</td><td>Amresco</td><td>9436-25G</td><td></td></tr><tr><td>alpha-MEM</td><td>ThermoFisher</td><td>12561056</td><td></td></tr><tr><td>Anilina Blue</td><td>NewComerSupply</td><td>10073C</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotico/antimicotico</td><td>ThermoFisher</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Acido scarlatto di Beibrich fucsina</td><td>Millipore-Sigma</td><td>A3908-25G</td><td></td></tr><tr><td>b-glicerofosfato</td><td>Millipore-Sigma</td><td>G9422-10G</td><td></td></tr><tr><td>Biebrich Scarlatto</td><td>EKI</td><td>2248-25G</td><td></td></tr><tr><td>Biotina</td><td>Millipore-Sigma</td><td>B4501-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Fissativo di Bouin</td><td>NewComerSupply</td><td>1020A</td><td></td></tr><tr><td>Bovino albumina sierica</td><td>Calbiochem</td><td>12659</td><td>conservata a 4 gradi Soluzione</td></tr><tr><td>di distacco di cellule</td> C <td>Accutase</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>Filtro a campana (70 mm)</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Desametasone</td><td>Millipore-Sigma</td><td>D4902-100MG</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td>4,5 g/L di glucosio, L-glut e piruvato</td></tr><tr><td>DMEM/F12 medio</td><td>ThermoFisher</td><td>10565-042</td><td>alto glucosio, glutamax, sodio bicarbinato</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Millipore-Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Atlanta Biologicals&nbsp;</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>FGF2</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Formalina</td><td>NewComerSupply</td><td>1090</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina, pelle bovina</td><td>Millipore-Sigma</td><td>G9391-500G</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>ThermoFisher</td><td>35050061</td><td>integratore di glutammina</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Lonza</td><td>10-547F</td><td></td></tr><tr><td>IBMX</td><td>Millipore-Sigma</td><td>I5879-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di insulina</td><td>Millipore-Sigma</td><td>I9278-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Olio rosso O</td><td>Millipore-Sigma</td><td>O0625-100G</td><td></td></tr><tr><td>Acido pantotenico</td><td>Millipore-Sigma</td><td>P5155-100G</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di penicillina-streptomicina</td><td>ThermoFisher</td><td>15240062</td><td>100ml</td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di acido fosfotungstico/fosfolibdico</td><td>Millipore-Sigma</td><td>P4006-100G/221856-100G</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>Invivogen</td><td>ant-pm-1</td><td>Reagente antimicrobico per terreni di coltura.</td></tr><tr><td>Rosiglitazone</td><td>Millipore-Sigma</td><td>R2408-10MG</td><td></td></tr><tr><td>TGFb1</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td></td></tr><tr><td>Ematossilina di Weigert</td><td>EKI</td><td>4880-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

capacità di differenziazione delle cellule progenitrici umane aortica perivascolare adiposo

Differentiation Capacity of Human Aortic Perivascular Adipose Progenitor Cells

Il tessuto adiposo è una ricca fonte di multi-potente cellule staminali mesenchimali (MSC) in grado di differenziarsi in osteogenica, adipogenico e condrogenica lignaggi. Adipogenico differenziazione delle cellule progenitrici è un meccanismo importante che guida l'espansione del tessuto adiposo e disfunzione in risposta all'obesità. Capire i cambiamenti al tessuto adiposo perivascolare (PVAT) così è clinicamente rilevanti nella malattia metabolica. Tuttavia, gli studi precedenti sono stati prevalentemente eseguiti in altri animali e il mouse modelli. Questo protocollo utilizza campioni a PVAT toracici umani raccolti da pazienti sottoposti a chirurgia dell'innesto di bypass coronarico. Tessuto adiposo dall'aorta ascendente è stato raccolte e utilizzato per espianto della frazione vascolare stromal. Abbiamo precedentemente confermato la presenza di cellule progenitrici adipose in PVAT umano con la capacità di differenziarsi in contenenti lipidi adipociti. In questo studio, abbiamo analizzato ulteriormente il potenziale di differenziazione delle cellule dalla frazione vascolare stromal, presumibilmente contenente cellule progenitrici multi-potente. Abbiamo confrontato le cellule derivate da PVAT al midollo osseo umano MSC per differenziazione in adipogenico, osteogenica e condrogenica lignaggi. Dopo 14 giorni di differenziazione, macchie specifiche sono state utilizzate per rilevare l'accumulo di lipidi negli adipociti (O olio rosso), i depositi calcificanti in cellule osteogeniche (Alizarin Red.), o di glicosaminoglicani e di collagene nelle cellule condrogenica (Trichrome di Masson). Mentre midollo osseo MSC differenziate in modo efficiente in tutti e tre i stirpi, cellule derivate da PVAT avevano adipogenico e condrogenica potenziale, ma mancava il potenziale osteogenico robusto.

Isolamento della frazione stromale vascolare da PVAT umano
Figura 1A Mostra un disegno schematico della regione anatomica dove il PVAT sovrastante l'aorta ascendente è stata ottenuta. Precedentemente abbiamo descritto le popolazioni di pazienti sottoposti a bypass coronarico da cui questi campioni erano derivate6. Figura 1B Mostr...

L'obiettivo del presente protocollo è quello di testare la capacità di cellule progenitrici derivate dal tessuto adiposo umano perivascolare di differenziarsi in stirpi multipli delle cellule. La differenziazione è stata confrontata alle cellule staminali mesenchimali derivate dal midollo osseo umano, che è noto per differenziare in adipociti, Osteocita e lignaggi di condrociti.

Capacità di differenziazione delle cellule progenitrici umane aortica perivascolare adiposo

Adipose tissue is a rich source of multi-potent mesenchymal stem cells (MSC) capable of differentiating into osteogenic, adipogenic, and chondrogenic ...

Il tessuto adiposo perivascolare circonda i vasi sanguigni e regola la fisiologia cardiovascolare. Questo protocollo viene utilizzato per rispondere a domande chiave relative alla funzione dei progenitori di adiposi umani nel microambiente vascolare. Le cellule progenitrici adipose variano a seconda della loro posizione anatomica.Mostriamo che una popolazione di progenitori multipotenti può essere derivata con successo dal tessuto adiposo perivascolare da pazienti con malattie cardiovascolari. A dimostrare la procedura sarà Spencer Scott, uno studente di medicina del mio laboratorio. Ottenere un pezzo da 500 milligrammi di tessuto adiposo periposo umano periposo o PVAT dalla sala operatoria come descritto nel protocollo di testo.Trasferire il PVAT umano fresco da DMEM a un tubo conico da 50 millilitri contenente 25 millilitri di soluzione antibiotica. Incubare con dondolo per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Mentre il PVAT è in soluzione antibiotica, scongelare un'aliquota di tampone di dissociazione a 37 gradi Celsius.Aggiungere 50 microlitri di soluzione antibiotico/antimicotica 100x a cinque millilitri di tampone di dissociazione e sterilizzare utilizzando un filtro siringa da 0,22 micron. Aggiungere un millilitro di soluzione di gelatina a un pozzo di un piatto da 24 pozzetto. In una cappa a flusso laminare, utilizzare pinza sterile e forbici per trasferire PVAT dalla soluzione antibiotica a una piastra di Petri sterile.Aggiungere un millilitro di tampone di dissociazione pre-riscaldato al tessuto. Tritare finemente l'intero tessuto in un liquame usando forcelle sterili e forbici di dissezione. Trasferire il liquame da un millilitro a quattro millilitri di tampone di dissociazione.Incubare il tubo su un lato in uno shaker orbitale pre-riscaldato di 37 gradi Celsius a 200 giri/min per un'ora. Dopo un'ora, non dovrebbero essere presenti pezzi di tessuto visibili e la soluzione apparirà come una sospensione cellulare torbide. Filtrare la soluzione attraverso un filtro a celle da 70 micron impostato in cima a un tubo conico da 50 millilitri.Risciacquare il colino con altri 10 millilitri di soluzione antibiotica per catturare il maggior numero possibile di cellule. Non spremere il colino. Ora pellet le cellule per 12 minuti a 300 volte g in una centrifuga a secchio oscillante.Dopo la centrifugazione, il tubo verrà separato in uno strato superiore grasso di adipociti, un'interfase e un pellet. Il pellet è la frazione vascolare stromale contenente cellule endoteliali, cellule immunitarie, cellule del sangue e cellule progenitrici. Resuspend il pellet in 10 millilitri di HBSS e centrifuga per cinque minuti a 300 volte g.Ripetere questo passaggio per un totale di due lavaggi in HBSS. Ora aspira la gelatina da un piatto da 24 po '. Lavare delicatamente il pozzo una volta con HBSS per rimuovere la gelatina non vincolata.Rimossare il pellet di frazione vascolare stromale con globuli rossi intatti in un millilitro di mezzo di crescita e seminare sul pozzo rivestito di gelatina. Quindi aggiungere FGF2 umano a una concentrazione finale di 25 nanogrammi per millilitro nel mezzo di coltura. Incubare per 24 ore a 37 gradi Celsius con il 5%CO2.Dopo aver fatto crescere le cellule per 24 ore, rimuovere il mezzo di crescita e lavare le cellule cinque volte con HBSS. Questo passaggio di lavaggio rimuove i globuli rossi e i globuli morti. Quindi aggiungere un millilitro di mezzi di crescita freschi integrati con 25 nanogrammi per millilitro FGF2 ad ogni pozzo.Cambia il supporto ogni 48 ore assicurandoti di integrare con 25 nanogrammi per millilitro FGF2 fresco ogni volta. Le cellule di passaggio una volta raggiunta la confluenza del 100% da sette a 10 giorni dopo l'espianto. Per fare ciò, aspirare i mezzi di crescita e lavare il monostrato due volte con un MILLILITRO HBSS.Aspirare tutti gli HBSS dai pozzi e aggiungere alcune gocce di soluzione di dissociazione cellulare. Toccare e ruotare la piastra più volte e incubare a 37 gradi Celsius con 5%CO2 per cinque o sette minuti per sollevare le cellule. Quindi aggiungere circa un millilitro di mezzo di coltura fresco alle cellule staccate.Distribuire 500 microlitri delle cellule staccate a due pozzi di una piastra da 24 porcili ciascuno contenente 500 microlitri di mezzi di crescita e 25 nanogrammi FGF2. Inoltre, coltura del midollo osseo umano Cellule Staminali Mesenchimali o colonie MSC come descritto nel protocollo di testo. Placcare il numero appropriato di midollo osseo e cellule derivate da PVAT per pozzo di una piastra di 12 po '.Per condizioni adipogeniche e osteogeniche, placcare circa 200.000-225.000 cellule per pozzo. Mentre per le condizioni condrogeniche, piastra da 150.000 a 175.000 cellule per pozzo. Quindi dissociare le cellule sia dalla popolazione umana di cellule progenitrici PVAT che dalla popolazione msc del midollo osseo umano aggiungendo la soluzione di distacco cellulare.Incubare le cellule nella soluzione di distacco a 37 gradi Celsius e 5%CO2 per cinque minuti. Tirare le popolazioni in fiale coniche separate da 15 millilitri. Ruotare i flaconcini a 500 volte g per sette minuti per pellettare le cellule.Quindi rimescolare le cellule in un millilitro di PBS e utilizzare un emocitometro per stimare il numero di cellule. Placcare le celle in 12 piatti bene come prima. Fornire piatti separati per le condizioni adipogeniche e osteogeniche indotte e non indotte.E aggiungere 1,5 millilitri di mezzi di conduzione adipogenica e osteogenica ad ogni pozzo della condizione indotta. Quindi aggiungere 1,5 millilitri di mezzi adipogenici e osteogenici di non induzione ad ogni pozzo della condizione non indotta. Iniziare l'incubazione delle popolazioni cellulari indotte e non indotte adipogeniche e osteogeniche a 37 gradi Celsius e 5%CO2.Spin down il volume rimanente di cellule progenitrici PVAT umane e MBC del midollo osseo umano per sette minuti a 500 volte g. Determinare il volume necessario per rimescolare il midollo osseo rimanente e i pellet cellulari derivati dal PVAT per ottenere una densità di 100.000 cellule per 10 microlitri. Quindi rimospendare i pellet nel volume calcolato dei mezzi di crescita MSC per l'induzione del lignaggio condrogenico.Spostare delicatamente il volume delle celle su e giù utilizzando una pipetta per garantire una distribuzione omogenea. Ora pipettare una goccia da 10 microliter della soluzione cellulare concentrata al centro di ogni pozzo per formare una micro massa di 100.000 cellule. Posizionare un millilitro di acqua sterile nel pozzo adiacente per evitare l'evaporazione.Incubare le micro colture di massa per due ore a 37 gradi Celsius e 5%CO2 per consentire alla micro massa di aggregarsi. Dopo due ore, aggiungere attentamente i mezzi di differenziazione condrogenica con picco con 10 nanogrammi per millilitro umano TGF-beta-uno a ciascuno dei pozzi di condizione indotti. Ora aggiungere con cura 1,5 millilitri del supporto di non induzione ai pozzi di condizione non indotti.Raschiare o versare la micro massa nella condizione condrogenica indotta in una cassetta per disidratare, incorporare e macchiare il campione come descritto nel protocollo di testo. Studi di differenziazione adipogenica sono stati eseguiti in parallelo con le cellule progenitrici derivate dal midollo osseo umano MSC e dal PVAT. Nella condizione non indotta, non è evidente alcun accumulo lipidico.Questo è in contrasto con la condizione indotta mostrata dopo la colorazione di lipidi neutri con Oil Red O.Mentre il grado di differenziazione nelle cellule derivate dal PVAT aortico umano è più robusto, entrambe le fonti cellulari umane hanno mostrato la capacità di differenziare per il lignaggio adipogenico. Il protocollo di differenziazione osteogenica è stato utilizzato per i CBC derivati dal midollo osseo umano e per le cellule derivate dal PVAT. Le cellule non indotte non macchiavano con Alizarin Red.Dopo il protocollo di differenziazione osteogenica, gli MSC umani svilupparono noduli calcificati che macchiavano di Rosso Alizarina mentre le cellule PVAT aortiche umane non lo facevano. Le cellule derivate sia dai CCC del midollo osseo umano che dal PVAT umano mostravano caratteristiche della differenziazione condrogenica con abbondante accumulo di collagene nella micro massa. La micro massa è formata da CBC del midollo osseo umano e le cellule derivate dal PVAT aortico hanno anche mostrato un abbondante accumulo di glicosaminoglicani come indicato dalla colorazione blu alciana.Morfologicamente, strutture simili alle lacune sono state rilevate con cellule sedute in cavità circondate da deposizione di collagene. È fondamentale tritare finemente il tessuto adiposo periposo perivasculare prima della dissociazione enzimatica e garantire che siano placcate adeguate densità cellulari per ogni saggio di differenziazione del lignaggio. Seguendo questa procedura, la PCR quantitativa combinata con la western blot e la citometria di flusso dovrebbe essere utilizzata per caratterizzare marcatori specifici del lignaggio di progenitori differenziati da fonti di adiposo periposo e midollo osseo.Con questa tecnica, possiamo iniziare a capire i meccanismi che regolano l'espansione e la disfunzione del tessuto adiposo perivascolare durante l'obesità e le implicazioni che le cellule progenitrici hanno sulla funzione vascolare e sulle malattie cardiovascolari.

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Biologia

Le cellule staminali perivascolari (PSC) sono una nuova classe di cellule staminali per la rigenerazione tissutale scheletrico simili alle cellule staminali mesenchimali (MSC). CSP possono essere isolati mediante FACS (fluorescenza selezione cellulare attivata) da tessuto adiposo prelevati durante le normali procedure di liposuzione, poi combinato con un osteoinduttiva impalcatura per ottenere la formazione...

L&#39;uso di cellule staminali per la rigenerazione ossea perivascolari

L'eterogeneità trascrizionale all'interno delle cellule stromali umane di derivazione adiposa può essere definita a livello di singola cellula utilizzando marcatori di superficie cellulare e geni osteogenici.  Descriviamo un protocollo che utilizza la citometria a flusso per l'isolamento di sottopopolazioni cellulari con aumentato potenziale osteogenico, che può essere utilizzato per migliorare la ricostruzione scheletrica craniofacciale.

Isolamento e arricchimento di Human derivate da tessuto adiposo cellule stromali di Osteogenesi avanzata

Gli adipociti maturi possono rappresentare un'abbondante fonte di cellule staminali attraverso la dedifferenziazione, che porta a una popolazione omogenea di cellule simili a fibroblasti. La digestione della collagenasi viene utilizzata per isolare gli adipociti maturi dal grasso umano. L'obiettivo del nostro protocollo è quello di ottenere cellule adipose multipotenti e dedifferenziate da adipociti maturi umani.

Generazione di cellule staminali adiposo umano attraverso dedifferenziazione di adipociti maturi in Culture soffitto

Questo protocollo descrive l'isolamento di cellule staminali di derivazione adiposa di maiale (pADSC) da tessuti adiposi sottocutanei con esame della multipotenza. I pADSC multipotenti vengono utilizzati per delineare i processi di differenziazione degli adipociti e studiare la transdifferenziazione in più linee cellulari di mesenchima mesodermico o ulteriori linee di ectoderma ed endoderma per studi rigenerativi.

Isolamento e differenziazione delle cellule staminali derivate da tessuto adiposo sottocutaneo da Suini tessuti adiposi

tessuto cardiaco umano alberga popolazioni di cellule precursore perivascolari multipotenti che possono essere adatti per la rigenerazione del miocardio. La tecnica qui descritta permette l'isolamento e la purificazione simultanea di due popolazioni di cellule stromali multipotenti associati con i vasi sanguigni nativi, cioè CD146 + CD34 - periciti e CD34 + CD146 - cellule avventiziale, dal miocardio umano.

Isolamento di perivascolare Multipotent precursori delle cellule popolazioni dal cardiache umane Tissue

Qui riportiamo un metodo per l'isolamento delle popolazioni di cellule progenitrici di Adipocyte (APC) da tessuto adiposo perivascolare (PVAT) utilizzando la selezione delle cellule magnetiche (MCS). Questo metodo consente un aumento dell'isolamento di APC per grammo di tessuto adiposo se confrontato con la selezione delle cellule attivate con fluorescenza (FACS).

L&#39;espansione e l&#39;adipogenesi dell&#39;induzione di progenitori adipociti da tessuto adiposo perivascolare isolati da cellule magnetiche attivate

La differenziazione degli adipociti bianchi e beige da progenitori vascolari del tessuto adiposo porta il potenziale di miglioramento metabolico nell'obesità. Descriviamo i protocolli per CD34 + CD31 + isolamento di cellule endoteliali da grasso umano e per una successiva in vitro espansione e differenziazione in adipociti bianchi e beige. Diverse applicazioni a valle sono discussi.

Isolamento, espansione e adipogenico induzione di CD34 + CD31 + cellule endoteliali dal tessuto adiposo umano omentale e sottocutaneo

Vi presentiamo un protocollo per l'isolamento, la coltura e l'induzione adipogenica delle cellule staminali derivate dalla cresta neurale derivate da cellule staminali derivate da adiposo (NCADSC) dal tessuto adiposo periaortico del Wnt-1Cre Topi Rosa26RFP/z. Le NCADSC possono essere una fonte facilmente accessibile di ADSC per la modellazione dell'adipogenesi o della lipogenesi in vitro.

Isolamento, cultura e induzione adipogenica di cellule staminali adipose originali adipose-derivate da cellule staminali periaortiche

Presentiamo un metodo semplice per isolare le cellule progenitrici adipose altamente vitali dalle pastiglie di grasso epididimale del topo utilizzando lo smistamento delle cellule attivato a fluorescenza.

Preparazione di cellule progenitrici adipose dai tessuti adiposi epididimali del topo

Il protocollo consente la generazione di una popolazione di adipociti puri da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC). L'acido retinoico viene utilizzato per differenziare le iPSC in cellule staminali mesenchimali (MSC) utilizzate per la produzione di adipociti. Quindi, viene utilizzato un approccio di selezione basato sulla colorazione rossa del Nilo per ottenere adipociti puri.

Robusta differenziazione delle iPSC umane in una popolazione pura di adipociti per studiare i disturbi associati agli adipociti

Qui, descriviamo l'isolamento, la coltura e l'induzione adipogenica di preadipociti derivati dalla frazione vascolare stromale dal tessuto adiposo periaortico di topo, consentendo lo studio della funzione del tessuto adiposo perivascolare e della sua relazione con le cellule vascolari.

Isolamento, coltura e induzione adipogenica di preadipociti derivati dalla frazione vascolare stromale dal tessuto adiposo periaortico di topo

Scopri il potenziale di differenziazione delle cellule progenitrici adipose perivascolari umane in adipociti, osteociti e condrociti. Questo metodo consente di studiare la rigenerazione cardiovascolare e le applicazioni in medicina rigenerativa.

Capacità di differenziazione delle cellule progenitrici umane aortica perivascolare adiposo

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