Un metodo per la ricostruzione 3D e l'analisi della realtà virtuale delle cellule gliali e neuronali
September 28th, 2019
La pipeline descritta è progettata per la segmentazione di set di dati di microscopia elettronica più grandi di gigabyte, per estrarre morfologie intere celle. Una volta che le celle sono state ricostruite in 3D, software personalizzato progettato intorno alle esigenze individuali può essere utilizzato per eseguire un'analisi qualitativa e quantitativa direttamente in 3D, utilizzando anche la realtà virtuale per superare vista occlusione.
Le tecniche automatizzate di microscopia elettronica a sezione seriale. Il passaggio di limitazione della velocità nella pipeline che porta alla generazione di modelli biologici tridimensionali di elaborazione delle immagini. Il nostro protocollo fornisce una linea guida passo-passo per produrre una costruzione più densa dei volumi di immagini in pochi giorni.
Combinato con un approccio per le misurazioni quantitative utilizzando modelli tridimensionali. Con questa tecnica, la struttura 3D dei tessuti, diversa dal cervello, può potenzialmente essere analizzata per identificare le menomazioni strutturali tipiche di alcune malattie e per migliorare la strategia diagnostica. La segmentazione è un passo noioso.
Prenditi il tempo necessario per renderlo il più accurato possibile per evitare la correzione di bozze di una segmentazione ccia e dover riavviare l'intero processo. Il design del software a volte non è molto intuitivo. Pertanto, è importante vedere i lavori di inizio sulla segmentazione.
Aprire lo stack di immagini trascinando e rilasciando il file nativo dal microscopio contenente lo stack o acquistare il trascinamento della cartella contenente l'intero stack di immagini nella finestra del software Una volta aperto lo stack passare all'immagine, alle proprietà, per assicurarsi che la dimensione dei voxel sia stata letta dai metadati. Trasforma l'immagine in 8 bit facendo clic sull'immagine, digita e seleziona a 8 bit. Se la pila originale viene acquisita come tessere diverse, applicare le cuciture all'interno di TrakEM2.
Create un nuovo progetto TrakEM2 utilizzando le strutture di segmento di segmento delle funzioni incorporate New, TrakEM2 Using TrakEM2, se necessario. Nel gooey del TrakEM2 fare clic con il pulsante destro del mouse su 'su qualsiasi cosa' sotto la finestra del modello e selezionare aggiungi nuovo elenco di area figlio'Trascina e rilascia qualsiasi elemento'nella cartella, sotto oggetti progetto', e lì apparirebbe un qualsiasi elemento. Trascinare, l'elenco di area'dal modello all'elemento che si trova sotto gli oggetti progetto'Nel riquadro di visualizzazione dello stack di immagini selezionare lo spazio Z' con il cursore.
L'elenco di area verrà visualizzato con il numero ID univoco. Selezionate lo strumento pennello in alto e usate il mouse per segmentare una struttura riempiendola con il suo citosolo sull'intero stack Z. Esportare la massa segmentata, da utilizzare in Ilastik come seme per l'intaglio.
A tal fine, fare clic con il pulsante destro del mouse sull'oggetto elenco di area nell'elenco dello spazio Z o sulla maschera nella porta di visualizzazione e selezionare esporta 'elenco area' come etichette T-I-F. A seconda della risoluzione necessaria per ulteriori ricostruzioni, ridurre le dimensioni dei pixel dello stack di immagini mediante down-sampling. Considerare i requisiti di memoria del software che verrà utilizzato per la segmentazione e la ricostruzione.
Ilastik gestisce pile fino a cinquecento pixel su X-Y. Prendi in considerazione la dimensione minima che gli oggetti appaiono ancora riconoscibili e quindi possono essere segmentati. Usa la dimensione di regolazione dell'immagine Per migliorare il contrasto e aiutare la segmentazione, il filtro maschera non nitida può essere applicato per rendere le membrane più nitide.
Utilizzare il processo 'filtri'massa di contrasto'Esporta lo stack di immagini come singole immagini' per un'ulteriore elaborazione nel software di segmentazione, utilizzando il formato file 'salva come'sequenza di immagini' e scegli il formato TIFF'. Nel gooey principale di Ilastik, selezionare il modulo di intaglio. Caricare lo stack di immagini utilizzando aggiungi nuovo' e aggiungere un singolo volume 3D/4D dalla sequenza 'Seleziona intera directory' e scegliere la cartella contenente lo stack di immagini salvato come singoli file'Nella parte inferiore della nuova finestra, dove sono presenti le opzioni per caricare le immagini, assicurarsi di mantenere Z"selezionato.
Per i passaggi seguenti, tutte le operazioni e i pulsanti si trovano sul lato sinistro del gooey del software principale. Nella scheda pre-elaborazione utilizzare le opzioni standard già selezionate. Utilizzare linee luminose 'filtri avanzati' e mantenere la scala del filtro a 1,600.
Questo perimetro può essere modificato in seguito. Al termine della pre-elaborazione, selezionare la pagina successiva nel menu a discesa del modulo di etichettatura. Un oggetto e uno sfondo sono presenti per impostazione predefinita.
Selezionare il seme dell'oggetto facendo clic su di esso e disegnare una linea sopra la struttura di interesse. Quindi, selezionare il seme di sfondo e disegnare una o più linee all'esterno dell'oggetto da ricostruire. Ora, fai clic sul segmento e attendi.
A seconda della potenza del computer e delle dimensioni dello stack, la segmentazione potrebbe richiedere da pochi secondi a ore. Una volta fatto, una maschera semitrasparente che evidenzia la segmentazione dovrebbe apparire sopra la struttura segmentata. Scorrere lo stack per controllare la segmentazione.
La segmentazione potrebbe non essere accurata se non segue la struttura degli interessi o si riversa da essa. Correggere qualsiasi fuoriuscita posizionando un seme di sfondo sulla segmentazione versata. E aggiungere un seme di oggetto sul segmento non ricostruito dell'oggetto di interesse.
La correzione di bozze visiva accurata della segmentazione con Ilastik potrebbe essere noiosa, ma è essenziale assicurarsi che gli oggetti esportati non contengano artefatti. Se la segmentazione non è ancora corretta, provare a modificare con il parametro bias'che aumenterà o diminuirà la quantità di pixel classificati incerti accettati. Il suo valore è 0,95 per impostazione predefinita.
Riducilo per limitare eventuali ricadute o aumenti se la segmentazione è troppo conservativa. Un'altra possibilità è fare clic sulla pre-elaborazione' e modificare le dimensioni del filtro. L'aumento del valore ridurrà al minimo gli effetti simili al rumore di sale e pepe, ma renderà anche le membrane più sfocate e i dettagli più piccoli più difficili da rilevare.
Questo potrebbe limitare lo sversamento. Ripetere tutto il necessario purché tutti gli oggetti desiderati siano stati segmentati. Al termine di un oggetto, passare a segmentare' e fare clic su Salva oggetto corrente'Due nuovi semi appariranno per avviare la segmentazione di un nuovo oggetto.
La superficie astratta misura immediatamente come file O-B-J facendo clic sull'esportazione di tutte le mesh'Per visualizzare i modelli segmentati manualmente in 3D all'interno di TrakEM2, fare clic con il pulsante destro del mouse sull'elenco delle area, quindi selezionare mostra in 3D'Un valore più alto genererà una mesh a risoluzione inferiore. Infine, esportare la mesh 3D come WaveFront O-B-J'scegliendo dal file di menu 'export surfaces'WaveFront'Dopo aver installato il kit di strumenti neuromorfi come descritto nel protocollo di testo, open blender. Importare gli oggetti utilizzando l'importazione batch di neuromorfi facendo clic su importa oggetti 'sotto il menu scena per importare più oggetti contemporaneamente.
Assicurarsi di attivare, utilizzare la mesh di nuovo e l'ombreggiatura liscia. Selezionate l'oggetto di interesse dall'out-liner e modificate la profondità di otturazione della funzione di mesh di nuovo nel menu del modificatore. Lavorare in modo iterativo per ridurre al minimo il numero di vertici ed evitare di perdere dettagli nella risoluzione e nella corretta morfologia.
Quando modificate la profondità dell'ottreo, la mesh sul gooey principale cambierà di conseguenza. Una volta terminato, fare clic su applica per finalizzare il processo. Passare al menu dei neuromorfi sul pannello sinistro e utilizzare le interazioni dello stack di immagini dello strumento sovrapposizione immagini per caricare lo stack di immagini.
Assicurati di immettere le dimensioni fisiche dello stack di immagini per X, Y e Z e selezionare il percorso della pila facendo clic sulle fonti Z.X e Y sono piani ortogonali. Sono facoltativi e verranno caricati solo se l'utente inserisce il percorso valido. Quindi, selezionare una mesh sulla porta di visualizzazione facendo clic con il pulsante destro del mouse su di essa.
Immettere la modalità di modifica premendo tabulazione, selezionare uno o più vertici utilizzando il clic con il pulsante destro del mouse e infine fare clic su Mostra immagine al vertice. Uno o più piani tagliati con la micrografia appariranno sovrapposti alla rete. Selezionate il piano di taglio facendo clic con il pulsante destro del mouse su di esso.
Quindi premere il controllo Y e scorrere il modello 3D utilizzando lo scorrimento del mouse. Questo può essere utilizzato anche come metodo di correzione di bozze. Qui è mostrata la segmentazione e la ricostruzione utilizzando TrakEM2 e Ilastik.
Il gooey TrakEM2 viene visualizzato con oggetti segmentati manualmente in rosso. La maschera esportata può quindi essere utilizzata come input per la segmentazione semi-automatizzata. Da Ilastik, le maschere possono essere ulteriormente esportate in TrakEM2 per la correzione manuale.
Le maschere possono essere esportate come mesh triangolari 3D per rivelare strutture ricostruite. In questo esempio, quattro neuroni, astrociti, microglia e periciti sono stati ricostruiti usando questo processo. Viene mostrata un'analisi 3D delle morfologie ricostruite utilizzando strumenti personalizzati.
Ecco un volume di immagini isotrope da un set di dati di microscopia elettronica a scansione di fascio ionico focalizzato. Una fitta ricostruzione di questi dati rivela gli assoni, il processo astrocitico e i dendriti. Questa micrografia mostra esempi di obiettivi di quantificazione come sinapsi e granuli di glicogeno astrocitico.
La maschera di quella micrografia mostra la distribuzione dei granuli di glicogeno attorno alle sinapsi. Ecco un'illustrazione grafica dell'input e dell'output della visualizzazione grafica del modello di assorbimento del lattato derivato dal glicogeno o GLAM'Qui, un utente viene mostrato mentre indossa una realtà virtuale o un auricolare V-R mentre lavora alla ricostruzione densa da un set di dati di microscopia elettronica a scansione di fascio ionico focalizzato. Da un sottoinsieme di neuriti, si può osservare una scena V-R immersiva.
Il laser verde punta a un picco GLAM'. è di primaria importanza in quanto determina la dimensione corretta degli oggetti 3D esportati e ne determina le misure riflette le dimensioni effettive. Il concetto di imaging a sezione seriale, segmentazione dell'imaging e costruzione 3D è piuttosto vecchio.
Scoprire l'accelerazione tecnica sta portando a progressi nelle colectomies nella revisione dei libri di testo di anatomia. Sebbene il metodo sia stato sviluppato per la ricerca cerebrale in microscopia elettronica, può essere generalizzato a qualsiasi tecnica di microscopia che genera dati Inoltre, qualsiasi tipo di tecnica di imaging 3D può beneficiare di tali tecniche di segmentazione e costruzione dell'imaging. Comprese le scansioni C-T e M-R-I.
Panoramica
Questo studio presenta una pipeline progettata per segmentare grandi set di dati di microscopia elettronica per ricostruire morfologie cellulari complete in 3D. Un software personalizzato permette un'analisi qualitativa e quantitativa sfruttando la realtà virtuale per migliorare la visualizzazione e affrontare problemi di occlusione.
Componenti principali dello studio
Area della scienza
- Neuroscienze
- Microscopia elettronica
- Ricostruzione 3D
Contesto
- Vengono utilizzate tecniche di microscopia elettronica in sezione seriale automatizzate.
- La pipeline mira a ridurre il tempo necessario per la generazione di modelli 3D biologici.
- La segmentazione è critica, poiché le imprecisioni possono portare a un'ampia ripresa del lavoro.
- L'uso di software personalizzato può migliorare le capacità di analisi.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un protocollo semplificato per la ricostruzione di volumi di immagini dense.
- Consentire valutazioni qualitative e quantitative in 3D.
- Analizzare strutture 3D di vari tessuti per rilevare compromissioni legate a malattie.
Metodi utilizzati
- Lo studio impiega la microscopia elettronica per creare set di dati volumetrici.
- I metodi si concentrano sulla segmentazione accurata delle strutture cellulari in grandi stack di immagini utilizzando diversi strumenti software.
- I passaggi di elaborazione delle immagini includono la preparazione dello stack di immagini, la segmentazione e l'esportazione degli oggetti per la visualizzazione 3D.
- Le fasi critiche includono la garanzia dell'accuratezza delle dimensioni dei voxel, l'applicazione di filtri e la revisione manuale delle segmentazioni.
Principali risultati
- La pipeline automatizzata ricostruisce con successo modelli 3D accurati da grandi set di dati.
- I metodi di segmentazione hanno dimostrato robustezza nel gestire strutture complesse.
- La revisione visiva è essenziale per garantire l'affidabilità degli oggetti ricostruiti.
- L'approccio ha potenziali applicazioni nella diagnosi di compromissioni strutturali in vari tessuti.
Conclusioni
- Questo studio fornisce una metodologia fondamentale per segmentare accuratamente grandi dati di microscopia elettronica.
- La pipeline delineata migliora l'efficienza nell'analisi di strutture biologiche complesse, che può migliorare le strategie diagnostiche.
- Le implicazioni includono il miglioramento della nostra comprensione della struttura tissutale in contesti di salute e malattia.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Accurate 3D reconstruction of cellular ultrastructure enables mechanistic de-risking in target validation by resolving ambiguities in morphology-function relationships. This approach supports predictive confidence in early discovery by providing quantitative structural readouts that inform hypothesis testing and pathway clarification. Integration of virtual reality analysis enhances reproducibility and cross-functional collaboration in preclinical model evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through detailed visualization of glial and neuronal ultrastructure.
- Operational Value: Reduces mechanistic ambiguity by clarifying complex morphologies that may be misinterpreted in 2D.
- Strategic Value: Supports predictive confidence and portfolio triage by identifying structural impairments indicative of disease mechanisms.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by generating dense, accurate 3D models of tissue architecture.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through quantitative measurements derived from reconstructed structures.
- Strategic Value: Enhances screening readiness and platform reuse by enabling reliable compound evaluation in disease-relevant systems.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance through analysis of structural impairments in axons, dendrites, and astrocytic processes.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation by linking 3D morphology to functional hypotheses like the glycogen-derived lactate absorption model (GLAM).
- Strategic Value: Addresses risk-adjusted advancement decisions by enabling visualization of synaptic targets and glycogen granule distribution for biomarker alignment.
Pipeline & Workflow Integration
The method positions itself within the discovery continuum from Early Discovery to Lead Identification and Preclinical work, supporting hypothesis testing, pathway clarification, and biological de-risking through quantitative 3D structural analysis.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing and pathway clarification by revealing ultrastructural patterns unresolved in 2D imaging.
- Screening: Describes assay readiness and reproducibility through quantitative outputs such as synapse and glycogen granule quantification.
- Analytics: Highlights measurements and readouts that help teams compare conditions, including structural impairments typical of certain diseases.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity and biomarker alignment via visualization of disease-related structural changes in neural and glial cells.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability rather than a single-use technique, applicable across microscopy techniques including CT and MRI.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, and reduction of mechanistic ambiguity in glial and neuronal morphology.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of 3D model generation from electron microscopy datasets.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early structural de-risking.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative 3D morphology analysis.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in electron microscopy, image segmentation, and 3D visualization software such as TrakEM2, Ilastik, and Blender.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs include high-resolution EM imaging systems and computational resources for processing large image stacks.
- Cross-team standardization requirements for segmentation protocols and proofreading to ensure consistency across users and sites.
- Adaptation considerations across model systems, as the method can be generalized to any microscopy technique generating 3D data.
- Practical limitations include the tedious nature of segmentation and the need for accurate voxel size calibration to avoid measurement artifacts.
