Un modello di coltura batch in vitro per stimare gli effetti dei regimi interventistici sul microbiota fecale umano
31 luglio 2019
Questo protocollo descrive un sistema di fermentazione in vitro a coltura batch del microbiota fecale umano, utilizzando l'inulina (un prebiotico ben noto e uno dei modulatori microbiota più studiati) per dimostrare l'uso di questo sistema nella stima degli effetti di interventi sulla composizione del microbiota fecale e sulle attività metaboliche.
Considerando il ruolo emergente del microbioma intestinale in varie malattie umane, diversi modulatori del microbioma intestinale come probiotici, prebiotici, diete e farmaci possono aiutare a migliorare i disturbi della salute associati al microbioma intestinale. Tuttavia, non è disponibile un sistema di screening rapido e conveniente per prevedere gli effetti di tali modulatori del microbioma intestinale, ma questo sistema è abbastanza semplice da prevedere come particolari interventi possono influire sul microbioma intestinale che alla fine può influire sulla salute dell'ospite. Questo protocollo è semplice, conveniente e pratico per i laboratori che studiano i modulatori del microbioma intestinale e i loro effetti sul microbiota e sulla salute dell'ospite.
Il mantenimento di condizioni asettiche e anaerobiche è fondamentale per questo esperimento. Anche l'esemplare fecale deve essere usato di nuovo, immediatamente dopo la raccolta. In caso contrario, se l'esperimento è previsto in un secondo momento, il campione deve essere conservato a meno 80 immediatamente dopo la raccolta, senza alcuna esposizione alla temperatura ambiente e all'aria.
La precisione di movimentazione durante la preparazione e la pipettazione dell'aliquota è importante anche per mantenere precisione e riproducibilità. Ci saranno meno di 12 ore durante il giorno. Possiamo costruire una cultura durante la notte se hanno bisogno dei campioni in 24 ore.
Quindi, seguito dagli acidi grassi a catena corta e dalla determinazione del microbioma. Questo processo sarà dimostrato da due grandi studenti universitari, Shokouh Ahmadi e Rabina Mainali del mio laboratorio. Per preparare i mezzi di fermentazione sotto una cappa aspirante, in una bottiglia di reagente su miscela magnetica, mescolare la soluzione A, la soluzione B, la soluzione minerale traccia, la soluzione vitaminica solubile in acqua, la soluzione di biotina folato, la soluzione di riboflavina, la soluzione di emina, la miscela di acidi grassi a catena corta e la resazurina.
Quindi aggiungere nell'estratto di lievito di bottiglia, carbonato di sodio, cloridrato di cisteina monoidrato e triptasi. Aggiungere 296,1 millilitri di acqua distillata, regolare il pH con un normale cloridrato o idrossido di sodio per assicurarsi che sia intorno a 7,0. Trasferire il becher su una postazione aseptica e utilizzare un filtro sottovuoto con dimensioni dei pori a 0,22 micrometri per filtrare il supporto per la sterilizzazione.
Per preparare una soluzione di diluizione anaerobica da un litro, sciogliere cinque grammi di cloruro di sodio, due grammi di glucosio e 0,3 grammi di cloridrato di cisteina monoidrato nell'acqua ionizzata. Autoclavare la bottiglia del reagente con tappo a 121,1 gradi Celsius per 15 minuti e conservarla all'interno della camera anaerobica. Prima dell'inizio dell'esperimento di fermentazione, conservare per almeno 48 ore tutti i materiali, le soluzioni e gli strumenti necessari per l'esperimento di fermentazione all'interno della camera anaerobica, per garantire che l'ossigeno residuo venga rimosso.
Almeno 24 ore prima dell'esperimento di fermentazione, pesare 300 milligrammi di inulina e trasferirlo in un tubo da 50 millilitri, che viene quindi posto all'interno della camera anaerobica. Aggiungere 26 millilitri di mezzi di fermentazione sterilizzati nel tubo e vortice da mescolare. Consentire l'idratazione della fibra per circa 24 ore.
Il giorno dell'esperimento di fermentazione, preparare l'inoculo fecale. In primo luogo, pesare cinque grammi di campione fecale fresco in un tubo conico da 50 millilitri. Aggiungere la soluzione di diluizione anaerobica al tubo per raggiungere un volume finale di 50 millilitri.
Vortice per 15 minuti, o fino a completa omogeneizzazione. Mantenere i tubi inoculati a 37 gradi Celsius all'interno della camera anaerobica e invertire delicatamente una volta ogni ora per rimescolare le fibre e l'inoculo. Dopo tre, sei, nove o 24 ore, eslevare la quantità corretta di mezzi fermentati e centrifugare i campioni a 14.000 volte g per 10 minuti a quattro gradi Celsius.
Congelare immediatamente il supernatante e il pellet in azoto liquido, quindi dopo il congelamento a scatto, conservare il supernatante per l'analisi degli acidi grassi a catena corta e il pellet per l'analisi del microbioma, a meno 80 gradi Celsius. Questo protocollo è usato per dimostrare l'effetto di uno specifico prebiotico. Le feci di soggetti umani sani, dopo il trattamento con inulina, hanno mostrato un pH relativamente stabile per nove ore, mentre sono diminuite drasticamente dopo 24 ore.
L'inoculazione dell'inulina ha aumentato significativamente i livelli di acidi grassi a catena corta e il lattato nel campione fecale trattato con inulina viene confrontato con la coltura di microbiota fecale non trattata. L'analisi delle coordinate principali mostra diverse composizioni di microbiota rispetto alle misure UniFrac ponderate e non ponderate della diversità beta tra campioni trattati con inulina e non trattati. Indici di diversità alfa rispetto alla diversità filogenetica attraverso l'intero albero PD, ricchezza delle specie, unità tassonomiche operative, evenienza delle specie, nonché abbondanza relativa di phyla e generi principali, presentano tutti diverse firme microbiota intestinali tra campioni trattati inulina e non trattati.
Il cladogramma tassonomico, derivato dall'analisi lineare delle dimensioni degli effetti discriminanti delle sequenze 16S, rappresenta il taxa differenziale abbondante tra diversi gruppi di campioni. Seguire attentamente tutti i passaggi. La cosa più importante è mantenere condizioni asettiche e anaerobiche rigorose.
Il supernatante e dall'esperimento possono essere utilizzati per trattare i cambiamenti di livello degli acidi grassi a catena corta a seguito della fermentazione a base di fibre. Inoltre, il pellet può essere utilizzato per analizzare i cambiamenti nella composizione del microbioma intestinale. Alcune sostanze chimiche utilizzate per realizzare i mezzi di coltura sono potenzialmente pericolose.
Si prega di il foglio MSDS e prendere precauzioni di conseguenza.
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Panoramica
Questo protocollo descrive un sistema di fermentazione in coltura batch in vitro del microbiota fecale umano, che utilizza inulina per valutare gli effetti di specifici interventi sulla composizione del microbiota fecale e sulle sue attività metaboliche.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Ricerca sul microbioma
- Salute intestinale
- Effetti dei prebiotici
Sfondo
- Il microbioma intestinale svolge un ruolo fondamentale nella salute umana.
- Modulatori come i prebiotici possono influenzare la microbiota intestinale.
- I sistemi di screening attuali per gli effetti sul microbioma intestinale sono limitati.
- Questo protocollo offre una soluzione pratica per i laboratori.
Scopo dello studio
- Sviluppare un sistema di screening semplice ed economico.
- Prevedere l'impatto degli interventi sul microbiota intestinale.
- Migliorare la comprensione del ruolo del microbiota nella salute dell'ospite.
Metodi Utilizzati
- Sistema di fermentazione in coltura batch in vitro.
- Utilizzo di campioni fecali freschi o conservazione adeguata a -80 °C.
- Mantenimento di condizioni asettiche e anaerobiche.
- Valutazione della composizione del microbiota e delle attività metaboliche.
Risultati principali
- Il sistema prevede efficacemente gli effetti di interventi specifici.
- Ha dimostrato cambiamenti nella composizione del microbiota fecale.
- Ha evidenziato le attività metaboliche influenzate dall'inulina.
- Ha fornito informazioni sulla modulazione del microbioma intestinale.
Conclusioni
- Questo protocollo rappresenta uno strumento prezioso per la ricerca sul microbioma.
- Permette la valutazione di interventi volti al miglioramento della salute intestinale.
- Supporta ulteriori studi sulle interazioni tra microbiota e salute dell'ospite.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Contenuto
Modelli ad alto rendimento di colture in batch in vitro per il microbiota fecale umano consentono uno screening rapido e scalabile di modulatori del microbioma, senza ricorrere a studi su animali o esseri umani. Questo approccio facilita la riduzione precoce dei rischi associati a interventi sperimentali, fornendo dati quantitativi e riproducibili sulla composizione del microbiota e sui suoi prodotti metabolici. L'integrazione di tali modelli nei percorsi di scoperta accelera la valutazione di prebiotici, probiotici e composti dietetici per portafogli dedicati alla salute intestinale.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette l'interrogazione funzionale di modulatori del microbioma su comunità microbiche di origine umana.
- Supporta la riduzione del rischio biologico quantificando i cambiamenti nella diversità del microbiota e nell'attività metabolica.
- Facilita una previsione affidabile nella selezione di interventi promettenti da sviluppare ulteriormente.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce un sistema standardizzato e riproducibile per valutare gli effetti di interventi sulla composizione della microbiota.
- Genera output quantitativi come livelli di pH, lattato e acidi grassi a catena corta per analisi comparative.
- Consente lo screening su larga scala di più composti o regimi in flussi di lavoro paralleli.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea i risultati ottenuti in vitro a firme del microbioma pertinenti alla malattia per garantire continuità traslazionale.
- Permette un avanzamento dei candidati aggiustato per il rischio, basato su letture meccanicistiche e metaboliche.
- Supporta la scoperta di biomarcatori collegando i cambiamenti indotti dall'intervento a output misurabili.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo modello di coltura batch in vitro si colloca all'interfaccia tra la fase iniziale di scoperta e l'identificazione dei composti promettenti, fornendo dati utilizzabili prima degli studi preclinici in vivo.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sulla modulazione del microbioma e sugli effetti sulle vie metaboliche.
- Screening: Fornisce letture quantitative e riproducibili per il confronto tra interventi.
- Analisi: Consente l'analisi statistica della composizione del microbiota e dei cambiamenti metabolici.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati ottenuti in vitro alla validazione preclinica, quando supportati da dati sul metabolismo e sulla diversità.
- Riutilizzo aziendale: Offre una piattaforma riutilizzabile per la valutazione continua di diversi candidati mirati al microbioma.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella scoperta mirata al microbioma.
- Valore operativo: Standardizza i flussi di lavoro e migliora la riproducibilità tra diverse campagne di screening.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione e l'allocazione del capitale fornendo dati tempestivi e utilizzabili.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione adeguata ai rischi dei modulatori del microbioma per il loro sviluppo.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in microbiologia anaerobica e tecnica asettica.
- Richiede l'accesso a camere anaerobiche e piattaforme analitiche per il profilo dei metaboliti e del microbioma.
- Necessita di una rigorosa standardizzazione tra i team per la gestione dei campioni e l'analisi dei dati.
- Potrebbe essere necessaria un'adattamento per diverse fonti di donatori o tipi di intervento.
- I potenziali rischi derivanti dai reagenti chimici richiedono il rispetto delle norme di sicurezza.
