用于长期无细胞基因表达传导的多层微流体平台

利用无细胞基因表达系统，对合成基因网络进行原型设计得到了极大的改进。我们的协议描述了多层微流体流反应器的制造过程，并表明这种装置可用于GP的长期无细胞表达。无细胞蛋白表达与微流体流反应器相结合，为合成生物器件的设计提供了快速原型平台。

整个设置用途广泛，可适用于任何需要高控制水平的生化或化学反应的传导。确保无细胞反应溶液的稳定性至关重要，而且难以实现。请务必专注于提供足够的冷却，并利用本协议中指定的管道。

制造和准备实验平台需要连接许多单独的组件，如果没有视觉辅助，这个过程可能很难遵循。首先，按照随附的文本协议来制造微流体装置，并设置气动控制和流量压力调节，用于控制对该器件至关重要的阀门。要设置离片冷却，首先将 PTFE 管的长度盘绕到 Peltier 元件的冷面上，然后用胶带固定线圈。

确保 PTFE 油管的一端连接到流层压力控制系统的储液罐，另一端从 Peltier 表面伸出不超过一厘米。接下来，将 5 到 10 厘米长的 PEEK 油管插入 PTFE 油管的突出端。将足够量的热化合物涂抹在Peltier元件的热面上，并将其放在水块的冷板上。

确保油管、Peltier 元件和冷却块一直直接接触。接下来，使用串行总线连接器将 Peltier 元件连接到温度控制器，以便调节提供给 Peltier 的电压。然后，安全地将热敏电阻放在 Peltier 表面上，并将其输出连接到温度控制器。

打开水冷却器后，调整提供给 Peltier 的电压，直到温度稳定在 4 摄氏度。对于微流体装置的每个控制通道，可切割一米长的标准管的长度。在一端，插入 23 仪表的销，一个半英寸 Luer 存根，另一端插入不锈钢连接销。

将 Luer 存根连接到一个公 Luer 3/32 英寸带状尼龙连接器，并将连接器的刺插入聚氨酯管的长度。然后将聚氨酯管直接插入其中一个电磁阀中。接下来，将一个 23 仪表半英寸 Luer 存根连接到注射器上，并将其插入一个 3 到 4 厘米长的标准管中。

将管子的开端放入超纯水储液罐中，并加注超纯水。对微流体装置的每个控制通道进行编号，如下所示。对于通道四至 29，找到相应的管子，并将金属销插入连接到注射器的管子的开端。

然后将水注入控制通道管，直到一半的长度被填满。接下来，断开管子与注射器的连接，将不锈钢连接器销插入微流体装置的相应孔中。对所有控制通道重复此步骤。

现在，使用控制接口打开所有电磁阀。这将对控制通道管内的液体加压，迫使其进入微流体装置，并关闭设备内所有基于膜的阀门。对于每个未冷却的试剂，可切割一米长的标准管，将储液罐出口连接到微流体装置入口。

采取管的一端，并将其插入储液罐，确保油管到达储液罐底部。应拧紧储油管出口，以便实现密封密封。然后，将不锈钢连接销插入管的开端。

接下来，将 23 仪表半英寸 Luer 存根连接到一毫升注射器的端。向 Luer 存根添加一小段标准油管。将管端放入所需的试剂溶液中，然后用试剂填充注射器。

然后将不锈钢连接器销插入连接到注射器的聚氨酯管中，然后用试剂填充管材。当使用小反应量时，试剂不会进入储液罐，管本身将充当储液罐。完成后，断开注射器，并将连接器销插入微流体装置的一个流层入口孔中。

然后使用压力调节器软件对每个储液罐施加压力，以强制将试剂插入微流体装置。确保水冷却器和 Peltier 元件在 Peltier 的表面温度设置为 4 摄氏度时已打开。将冷却装置安装到尽可能靠近微流体装置的附近，以最大限度地减少 Peltier 和设备入口之间的不冷却体积。

然后将一毫升注射器连接到 23 表半英寸 Luer 存根，其端端有一条短长度的标准管。在要冷却的试剂中绘制以填充注射器。接下来，通过连接管将 PEEK 管连接到注射器，并持续向注射器施加压力，迫使注射器通过 PEEK 管进入 PTFE 管。

最后断开PEEK管与注射器的连接，将其直接插入微流体装置的流通道入口。施加压力时，冷却的试剂将被强制进入微流体装置。确保微流体装置在显微镜舞台上安全，并连接所有控制和流动层管，并关闭培养箱上的任何开口。

接下来，将孵化器的环境温度设置为 29 摄氏度。然后确保冷却系统已打开，并在开始实验之前设置为 4 摄氏度。检查施加在流量通道压力调节器上的压力是否设置为 800 毫巴，并使用软件将每个流量通道的输出压力设置为 20 至 100 毫巴之间。

检查施加在控制通道电磁阀上的压力是通道 1 到 8 的一个 bar，通道 9 到 29 的三条。接下来，通过给通道29加压，同时通过3和15到28对控制通道进行减压，关闭设备的出口。然后有选择地减压多路复用器的控制通道，使单个选定的试剂流入设备。

使用显微镜监测空气的去除，然后确保所有试剂正确流动，而不会产生气泡。使用提供的软件包，设置与校准过程相关的数据字段，如随附的文本协议中所述。随后，通过执行校准协议，确定在单个流入步骤中从每个反应器中置换的流体体积。

按照控制软件提供的步骤完成校准实验的分析，并确定微流体器件中每个环反应器的刷新率。最后，在虚拟控制接口中为所需的实验设置所需的值。按下控制界面中执行实验按钮，启动实验方案。

在校准实验中，反应器中充满荧光团，其强度在每次稀释后记录。每个稀释的荧光强度降低，显示为设定数量的流入步长而置换的反应堆环的体积。此卷表示刷新比率。

每个稀释步骤的平均刷新率和标准偏差以红色显示。八个反应堆中的七个表现出非常相似的行为，但是一个反应堆在第七次稀释周期后表现出波动。这突出表明，每个反应堆都需要独特的刷新比率。

此处显示的长时间的体外记录和翻译反应每 14.6 分钟有 30% 的反应堆体积被置换。微流体装置的两个反应器，用作空白。所有其他反应器包括75%的体外转录和转化反应溶液和25%的超纯水或2.5纳米摩尔线性DNA模板编码，用于表达deGFP蛋白。

在添加DNA的所有四个反应器中，都有清晰的脱氧核糖核酸表达。一个反应器显示较低的荧光信号。这可能是由于流量差异导致进入反应堆的DNA减少或由于反应器尺寸的变化。

14小时后，含有DNA的反应堆信号突然增加。这是由进入微流体装置流层的气泡引起的。恢复流量后，实验将回到先前的荧光强度。

无细胞反应解决方案会随着时间的推移而退化，除非它们经过充分冷却，否则使本协议中描述的冷却过程变得至关重要。由于平台的多功能性，可以精确且可控地进行各种生化和化学反应。微流体流反应器的应用加速了双基因电路原型设计的连续构建测试周期。