Name: Un saggio basato sulle proteine con fluorescenza verde potenziato per studiare la crescita neurite nei neuroni primari (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Impara un saggio basato su EGFP per studiare la crescita dei neuriti nei neuroni corticali embrionali di ratto. Questo metodo migliora l'efficienza di transfezione e consente di identificare bersagli terapeutici per la riparazione neuronale.

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Questo lavoro è stato sostenuto da fondi del Research Grants Council Hong Kong, Health and Medical Research Fund (Hong Kong), del CUHK direct grant scheme, del Fondo di dotazione dello United College e del TUYF Charitable Trust.

Tutte le procedure seguite erano conformi agli standard etici del comitato etico per la sperimentazione animale dell'Università Cinese di Hong Kong.
1. Preparazione di Coverslips
<ol><li>Collocare uno scivolo circolare sterile da 18 mm in ogni pozzetto di una piastra di coltura dei tessuti a 12 pozze.</li>
	<li>In un'incubatrice umidizzata da 37 gradi centigradi per almeno 1 h, rivestire la coverslip con una soluzione poli-D-lisina a 5 g/mL/mL.</li>
	<li>Aspirare la soluzione poli-D-lysina dalla piastra di coltura dei tessuti e risciacquare i copricapi rivestiti una volta con acqua sterile.</li>
</ol>2. Dissezione del neurone embrionale del ratto
<ol><li>Sacrificare un ratto Sprague-Dawley a tempo all'età gestazionale di 18 giorni (E18) per lussazione cervicale o asfissia di CO2. NOT:</</c1> Si prega di controllare le norme locali per il sacrificio di ratti incinte.</li>
	<li>Aprire la cavità addominale del ratto incinta con forbici dissetanti e trasferire l'utero in un piatto Petri di 10 cm.</li>
	<li>Aprire con cura l'utero e il sacco amniotico con piccole forbici dissettive e rimuovere la placenta dall'embrione di ratto utilizzando piccole forbici dissettive. Trasferire l'intero embrione in una parabola Petri di 10 cm con salina tamponata pre-raffreddata con supplemento di glucosio (PBS-glucosio, 10 mM fosfati di sodio, 2,68 mM di cloruro di potassio, 140 mM di cloruro di sodio e 3 g/L di glucosio) utilizzando un paio di piccole pinze.</li>
	<li>Tagliare lungo la sutura sagittale del cranio e aprirlo con attenzione con un paio di piccole forbici dissetanti. Trasferire il cervello embrionale con una piccola spatola piatta in un piatto Petri di 10 cm con PBS-glucosio ghiacciato.</li>
	<li>Separare i due emisferi cerebrali dal cervelletto e dal tronco encefalico utilizzando due pinzette #5 al microscopio di dissezione. NOT:</</c2> Si prega di vedere il riferimento12 per la struttura del cervello del ratto.</li>
	<li>Rimuovere le meningi utilizzando le #5 pinzette.</li>
	<li>Isolare la corteccia dagli emisferi cerebrali con due pinzette di #5 dritte.</li>
	<li>Trasferire la corteccia isolata in PBS-glucosio ghiacciato in un tubo di centrifuga di 15 mL.</li>
</ol>3. Cultura primaria dei neuroni corticali
 NOT:</</c0> Tutte le procedure nei passaggi 3 e 4 vengono eseguite all'interno di un armadietto di biosicurezza di classe II.
<ol><li>Apposta la corteccia isolata per gravità a 4 gradi centigradi per 5 min e aspira il PBS-glucosio.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di 0,05% Trypsin-EDTA alla corteccia isolata e mescolare delicatamente toccando e incubare il tessuto in un bagno d'acqua di 37 gradi per 10 min per consentire la digestione enzimatica. Toccare delicatamente il tubo per mescolare ogni 2 min.</li>
	<li>Aggiungere 4 mL di mezzo di manutenzione (ad esempio, Mezzo Neurobasal) alla miscela di tessuto/trypsin. NOT:</</c0> Tutto il mezzo di manutenzione utilizzato in questo protocollo è integrato con Penicillina-Streptomycin e B-27 supplemento13.</li>
	<li>Dissociare delicatamente il tessuto mediante triturazione utilizzando una pipetta da 1 mL.</li>
	<li>Pellet le cellule dissociate per centrifugazione a 200 x g per 5 min. Aspirate il sovratalante.</li>
	<li>Ripetere i passaggi da 3,5 a 3,7 due volte.</li>
	<li>Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di mezzo di manutenzione.</li>
	<li>Aggiungete 10 L dello 0,4% di soluzione Trypan Blue a 10 litri di sospensione cellulare per il conteggio delle cellule vitali con un emocitometro.</li>
	<li>Piastra i neuroni ad una densità di 65,000 /cm2 (cellule vitali) in 1 mL di mezzo di manutenzione per bene in una piastra di 12 pozzetti.</li>
</ol>4. Trasfezione e fissaggio delle celle
<ol><li>A 2 giorni in vitro (DIV2), transfect 0,5 g di costrutto EGFP (pEGFP-C1) ai neuroni insieme con o senza 0,5 g di POI utilizzando 1 :L di reagente di trasfezione (ad esempio, Lipofectamine 2000). Utilizzare le istruzioni del produttore. NOT:</</c0> I costrutti di espressione dei mammiferi sono stati preparati utilizzando un kit di preparazione del plasmide endotossina. Il trattamento con sostanze chimiche/molecole (in questo manoscritto sono stati utilizzati cytochalasin D (Cyto D) e fattore di crescita del nervo (NGF) può essere fatto a 6 h dopo la trasfezione.</li>
	<li>Aspirare il mezzo di coltura 24 h post-trasfezione e lavare le cellule traste una volta con 37 pbS (10 mM fosfati di sodio, 2,68 mM di cloruro di potassio, 140 mM di cloruro di sodio).</li>
	<li>Fissare le cellule con 4% paraformaldeide in PBS per 10 min al buio a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavare le celle fisse tre volte con PBS.</li>
	<li>Aggiungere una quantità minima di supporto di montaggio a fluorescenza su un vetrino di vetro al microscopio. Trasferire con attenzione il coperchio dalla piastra a 12 piani sul supporto di montaggio con il campione rivolto verso il vetrino. NOT:</</c1> Sigillare il bordo della coverslip con smalto se viene utilizzato un mezzo di montaggio acquoso.</li>
</ol>5. Misurazione di Neurite Outgrowth
<ol><li>Utilizzare un obiettivo 40x per catturare immagini utilizzando un microscopio epi-fluorescente.</li>
	<li>Cattura immagini da almeno 40 neuroni intatti con il segnale EGFP per trasfezione.</li>
	<li>Aprire l'immagine catturata nel software ImageJ con il plugin NeuronJ11 per misurare la lunghezza della neurite più lunga, dal corpo cellulare alla punta del cono di crescita, di ogni neurone immagine.</li>
	<li>Analizzare i dati ottenuti con il software per determinare l'effetto delle proteine mirate nella escrescenza di neurite.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse con il contenuto di questo articolo.

Come detto prima, PC12 e i suoi subclone sono ampiamente impiegati per studiare l'estensione neurite perché hanno un'eccellente efficienza di trasfezione2,3. Al contrario, i neuroni primari hanno un basso tasso di trasfezione, che è un grande ostacolo per studiare i regolatori di escrescenza neurite per trasfezione7. Qui, descriviamo un protocollo conveniente per quantificare la crescita dei neuriti nei neuroni primari. Nonostante la bassa...

Neuriti, compresi sia assoni che dendriti, sono le proiezioni dei neuroni coinvolti nella creazione delle reti neurali. La crescita dinamica dei neuriti è essenziale per il neurosviluppo. Tuttavia, i meccanismi normativi sottostanti rimangono poco chiari. In particolare, il danno neurite è spesso osservato in varie malattie neurodegenerative e dopo lesioni cerebrali1. Pertanto, lo studio dei ruoli delle molecole putative in vari percorsi normativi di escrescenza neurite migliorerebbe la nostra comprensione del processo. Inoltre, può rivelare nuovi bersagli terapeutici per vari disturbi neurologici. Le linee cellulari neuronali sono modelli preziosi per studiare i processi neuronali tra cui l'escrescenza di neurite in quanto sono facili da manipolare e trasfect2,3. Tuttavia, deriva genetica è stata segnalata per verificarsi in alcune linee cellulari comunemente utilizzate, che potrebbero portare a variazioni nelle loro risposte fisiologiche4. Inoltre, è stata mostrata un'espressione differenziale di proteina tra le linee cellulari neuronali e i neuroni primari. Per esempio, PC12, una linea cellulare neuronale derivata dalla ghiandola surrenale del ratto che è ampiamente utilizzata per studiare la crescita neurite2,3, non esprime i recettori NMDA5. Inoltre, è stato proposto che la ridotta reattività della linea neuroblastoma del topo neuro-2a alle neurotossine rispetto ai neuroni primari è dovuta alla mancanza di espressione di alcuni recettori della membrana e canali ionici6. Pertanto, i neuroni primari sono un modello più desiderabile e rappresentativo per lo studio della escrescenza di neurite. Tuttavia, l'uso di neuroni primari è ostacolato dalla loro bassa efficienza di trasfezione7.
Qui, descriviamo un metodo che comporta la co-trasfezione della proteina di interesse (POI) e EGFP ai neuroni corticali del ratto primario. L'EGFP agisce come marcatore morfologico per l'identificazione di neuroni trasfettati con successo e permette la misurazione dei neuriti. Abbiamo convalidato questo metodo utilizzando composti/molecole che sono stati segnalati per modulare la crescita dei neurite. Inoltre, FE65, una proteina adattatrice neuronale che ha dimostrato di stimolare la crescita neurite, è stata utilizzata per illustrare questo approccio8,9. Questo protocollo prevede (1) l'isolamento dei neuroni corticali primari dagli embrioni del giorno embrionale 18 (E18) sugli embrioni di ratto, (2) la co-trasfezione dei neuroni con EGFP e poi (FE65 in questo studio) e (3) l'imaging e l'analisi dei neuroni utilizzando l'elaborazione delle immagini software ImageJ con il plugin NeuronJ10,11.

<table><tbody><tr><td>#5 pinzette</td><td>Regine</td><td>5-COB</td><td></td></tr><tr><td>18 mm Circle Cover Slips</td><td>Thermo Scientific</td><td>CB00180RA</td><td>Sterilizzare prima dell'uso</td></tr><tr><td>Integratore B27</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Citocalasina D</td><td>Invitrogen</td><td>PHZ1063</td><td>Disciolta in DMSO</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil Solfossido</td><td>Forbici da dissezione Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>, 10 cm</td><td>World Precision Instruments</td><td>14393</td><td></td></tr><tr><td>Forbici da dissezione, 12,5 cm</td><td>World Precision Instruments</td><td>15922</td><td></td></tr><tr><td>Maxi kit di plasmidi EndoFree</td><td>QIAGEN</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>Terreno di montaggio a fluorescenza</td><td>Dako</td><td>S302380</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Trasfezione Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>NGF 2.5S Proteina nativa di topo</td><td>Gibco</td><td>13257019</td><td></td></tr><tr><td>Nugent Utility Forceppe, 10 mm, punta dritta</td><td>World Precision Instruments</td><td>504489</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>pEGFP-C1</td><td>Clontech</td><td>#6084-1</td><td></td></tr><tr><td>pCI FE65</td><td></td><td></td><td>Si prega di consultare i codici 8 e 15</td></tr><tr><td>compresse PBS</td><td>Gibco</td><td>18912014</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-lisina bromidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>Spatola</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4147</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,05%), fenolo soluzione blu</td><td>di tripano 25300062</td><td></td><td></td>Gibco rosso</tr><tr><td>, 0,4%</td> <td>di 15250061</td><td></td> <td>Gibco</td></tr></tbody></table>

un saggio basato sulle proteine con fluorescenza verde potenziato per studiare la crescita neurite nei neuroni primari

An Enhanced Green Fluorescence Protein-based Assay for Studying Neurite Outgrowth in Primary Neurons

L'escrescenza di Neurite è un evento fondamentale nella formazione dei circuiti neurali durante lo sviluppo del sistema nervoso. Gravi danni ai neuriti e disfunzioni sinaptiche si verificano in varie malattie neurodegenerative e degenerazione legata all'età. Lo studio dei meccanismi che regolano l'escrescenza neurite non solo getterebbe luce preziosa sui processi di sviluppo cerebrale, ma anche su tali disturbi neurologici. A causa della bassa efficienza di trasfezione, è attualmente difficile studiare l'effetto di una proteina specifica sulla escrescenza di neurite nei neuroni dei mammiferi primari. Qui, descriviamo un metodo semplice per lo studio dell'escrescenza neurite dalla co-trasfezione dei neuroni corticali del ratto primario con EGFP e una proteina di interesse (POI). Questo metodo consente l'identificazione dei neuroni trafettati POI attraverso il segnale EGFP, e quindi l'effetto del POI sulla crescita di neurite può essere determinato con precisione. Questo saggio basato su EGFP fornisce un approccio conveniente per lo studio dei percorsi che regolano la crescita neurite.

Per testare questa metodologia, abbiamo usato Cyto D e il fattore di crescita del nervo NGF, che hanno dimostrato di inibire e stimolare rispettivamente la crescita di neurite14,15,16. La lunghezza neurite dei neuroni trasincati con EGFP è stata misurata dopo il trattamento con Cyto D o NGF. L'efficienza di trasfezione di EGFP ai neuroni è stata del 2,7% (1.068 neuroni contati). Come mostrato nel...

In questa relazione, descriviamo un semplice protocollo per studiare la escrescenza di neurite nei neuroni corticali embrionali del ratto co-traducendo con EGFP e la proteina di interesse.

Un saggio basato sulle proteine con fluorescenza verde potenziato per studiare la crescita neurite nei neuroni primari

Neurite outgrowth is a fundamental event in the formation of the neural circuits during nervous system development. Severe neurite damage and synaptic ...

La bassa efficienza di trasfezione è un grosso ostacolo per determinare come le proteine riattivono la crescita della neurite nei neuroni primari. Il nostro protocollo supera questo problema co-trasfezione di EGFP per identificare con successo le cellule trasfette. L'alto tasso di co-trasfezione di EGFP e le proteine di interesse garantiscono l'accuratezza del saggio.E di conseguenza, ora è necessaria la colorazione dell'immunofluorescenza. Poiché la crescita della neurite si verifica durante la rigenerazione neurale, questo metodo può essere applicato all'identificazione di nuovi obiettivi per ripristinare la rete neuronale danneggiata in traumi cerebrali o malattie neurodegenerative. Prima di iniziare la procedura, posizionare una coverlip circolare sterile di 18 millimetri in ogni pozzo di una piastra di coltura tissutale di 12 polietilene e rivestire ogni coverlip con cinque microgrammi per millimetro di soluzione di Poli-D-Lysine in un incubatore umidificato di 37 gradi Celsius per almeno un'ora.Al termine dell'incubazione, aspirare la soluzione di poli-D-lisina e sciacquare i copriparsi con acqua sterile. Il giorno 18 embrionale, posizionare l'utero raccolto da un ratto Sprag

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Biologia dello sviluppo

L'imaging cellulare Live è di particolare utilità quando si studiano le dinamiche del traffico di organelli. Qui si descrive un protocollo per l'imaging dal vivo di denso-core vescicole in neuroni coltivati ​​con grande campo microscopia a fluorescenza. Questo protocollo è flessibile e può essere adattato a organelli altra immagine come i mitocondri, endosomi e perossisomi.

Immagini dal vivo di Dense-core Vescicole nella Primaria neuroni coltivati ​​ippocampale

Questo articolo descrive un nuovo protocollo e reagenti impostare progettato per la misura sensibile degli effetti neurotossici di composti e trattamenti sulla co-culture di neuroni e astrociti utilizzando l'analisi ad alto contenuto. Risultati dimostrano che l'analisi ad alto contenuto rappresenta una tecnologia entusiasmante romanzo per la valutazione neurotossicità.

Un neuronale e astrociti Co-Cultura Assay per l&#39;analisi dei contenuti elevati di neurotossicità

FRAP è stato utilizzato per quantificare la mobilità di Green Fluorescence Protein (GFP)-tagged proteine ​​in cellule in coltura. Abbiamo esaminato le frazioni mobile / immobile della GFP, analizzando la percentuale di recupero di fluorescenza dopo photobleaching. In questo studio, FRAP è stato effettuato a dorso di neuroni dell'ippocampo.

Recupero della fluorescenza dopo photobleaching (FRAP) di fluorescenza proteine ​​Tagged in spine dendritiche di colture di neuroni ippocampali

In questo video, descriviamo un metodo basato sulla luminescenza per valutare la neurotossicità dei composti di piccole molecole che promuovono la crescita dei neuriti sulla vitalità dei neuroni derivati da hNPC. Il test misura il livello intracellulare di ATP, un indicatore della vitalità cellulare, per valutare la neurotossicità dopo il trattamento con il composto in esame.

Saggio basato sulla luminescenza per valutare la neurotossicità dei composti in esame sui neuroni

In questo video, dimostriamo un test di immunofluorescenza basato su EGFP per identificare l'efficacia delle proteine bersaglio sulla crescita neuritica dei neuroni corticali primari. I neuroni primari vengono trasfettati con una proteina fluorescente, EGFP, e una proteina bersaglio, quindi viene eseguito un test immunologico per studiare l'effetto della proteina bersaglio sulla crescita dei neuriti.

Saggio di immunofluorescenza per valutare l'effetto delle proteine bersaglio sulla crescita dei neuriti

Morfogenesi neuronale e la migrazione sono eventi cruciali alla base un corretto sviluppo del cervello. Qui, descriviamo i metodi per manipolare geneticamente colture di neuroni granulari del cervelletto e del cervelletto in via di sviluppo per la valutazione della morfologia e delle caratteristiche migratorie dei neuroni.

Manipolazione genetica delle cerebellare granuli neuroni<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em&gt; Per studiare neuronale Morfologia e migrazione

Descriviamo un test ottico per vescicole sinaptiche (SV) riciclaggio in colture di neuroni. Combinando questo protocollo con doppia transfezione di esprimere un marcatore presinaptica e la proteina di interesse ci permette di individuare siti presinaptici, loro delle vescicole sinaptiche capacità di riciclaggio e di determinare il ruolo della proteina di interesse.

Un test ottico per riciclo delle vescicole sinaptiche in colture di neuroni che Overexpressing proteine presinaptiche

Il protocollo presentato descrive un metodo per un saggio di escrescenza neurite e la valutazione della neurotossicità di piccoli composti molecolari.

Un saggio di escrescenza Neurite e una valutazione della neurotossicità con neuroni derivati dalla cellula del progenitore neurale umano

Sono descritti due metodi correlati per visualizzare gli eventi subcellulari necessari per la trasmissione sinaptica. Questi protocolli consentono il monitoraggio in tempo reale della dinamica dell'afflusso di calcio presinaptico e della fusione della membrana delle vescicole sinaptiche utilizzando l'imaging a cellule vive di neuroni in coltura in vitro .

Misurazione fluorescente in tempo reale delle funzioni sinaptiche in modelli di sclerosi laterale amiotrofica

Utilizzando topi fluorescenti transgenici, vengono descritti protocolli dettagliati per valutare il trasporto assonale in vivo di endosomi e mitocondri di segnalazione all'interno di assoni motori e sensoriali del nervo sciatico intatto in animali vivi.

Espansione del toolkit per l'imaging in vivo del trasporto assonale

Impara un saggio basato su EGFP per studiare la crescita dei neuriti nei neuroni corticali embrionali di ratto. Questo metodo migliora l'efficienza di transfezione e consente di identificare bersagli terapeutici per la riparazione neuronale.

Un saggio basato sulle proteine con fluorescenza verde potenziato per studiare la crescita neurite nei neuroni primari

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