Un approccio semplice per eseguire misurazioni TEER utilizzando un Amperemetro Volt-Amperemeter self-made con frequenza di uscita programmabile
5 ottobre 2019
Qui, dimostriamo come impostare un mitemetro a volt poco costoso con frequenza di uscita programmabile che può essere utilizzato con elettrodi bacchette disponibili in commercio per misurazioni transepiteliali/endoteliali di resistenza elettrica.
La misurazione dell'impedenza elettrica transepiteliale è stata utilizzata dagli anni '80 per determinare la confluenza e la funzione barriera dei monostrati epiteliali nella coltura cellulare. La tecnica sottostante è un rilevamento a quattro terminali che utilizza diverse coppie di elettrodi che trasportano corrente e rilevamento della tensione per effettuare misurazioni più accurate. Esistono diversi dispositivi disponibili in commercio per misurare l'impedenza transepiteliale, ma nonostante la facilità d'uso e l'elevata affidabilità, ci sono anche alcuni svantaggi come la frequenza di uscita non traducibile e la loro costosità.
Pertanto, rappresentiamo come costruire un volt-ametro economico e programmabile. All'inizio, vogliamo mostrare come funziona la misurazione TEER con dispositivi disponibili in commercio. Per fare ciò, avevamo coltivato uno strato cellulare di cellule del papilloma epiteliale del plesso coroideo sui filtri Transwell con una dimensione dei pori di tre micrometri.
Questa impostazione è stata descritta da Schroten et al. Ora, un elettrodo a bacchetta è collegato a un volt-ammetro epiteliale.
Il dispositivo è acceso e impostato per misurare la resistenza. L'elettrodo viene sterilizzato in 80% di etanolo e successivamente equilibrato in un mezzo appropriato. L'impedenza da misurare servirà come valore di riferimento al fine di valutare l'affidabilità del volt-amperometro che verrà assemblato in seguito.
In questo esempio, registriamo un'impedenza di 680 ohm. Iniziamo con l'assemblaggio di un volt-ametro a basso budget con frequenza di uscita programmabile. Prima di tutto, avrai bisogno di un caricabatterie USB standard e di una prolunga USB come alimentatore a corrente diretta a cinque volt.
Un microcontroller a 8 bit su una scheda di sviluppo USB verrà quindi utilizzato per generare una corrente ad onda quadra. Quattro cavi con tappi di banana sono collegati a due multimetri standard per misurare tensione e corrente. Assicurarsi che i multimetri siano in grado di misurare la corrente in una gamma di alcuni microampere con TrueRMS.
Un connettore RJ14 femmina si trova sui cavi telefonici standard. Assicurati solo che il connettore abbia sei pin di cui almeno i quattro interni sono cablati. Infine, avrai bisogno di alcune attrezzature standard, come i nostri cavi, un terminale di lucentezza, un resistore da 120 kilohm e alcuni strumenti come spogliarelliste isolanti, uno strumento di crimpatura, ferrules a filo e ferro da saldare.
Il dispositivo viene assemblato esattamente come illustrato nel diagramma di layout. All'inizio, l'estensione USB è collegata al microcontroller. Durante il normale funzionamento, è alimentato da un caricabatterie USB DC a cinque volt, che può essere facilmente collegato a un personal computer per la programmazione.
Due cavi vengono spogliati e crimpati con ferrules di estremità del filo su un lato. L'altro lato viene saldato direttamente per fissare zero e due del microcontrollore o per saldare le anse, che a loro volta vengono ritagliate sui rispettivi perni. Successivamente, i cavi di erogazione dell'alimentazione sono collegati a un terminale di lucentezza.
Il primo multimetro sarà utilizzato per misurare la corrente ed è collegato in serie con resistore da 120 kilohm e elettrodi a bacchetta che passano la corrente. Questa disposizione garantisce che la corrente di uscita sia limitata, quindi la misurazione non avrà alcun impatto sulla vitalità cellulare. I quattro conduttori della prolunga del telefono vengono smontati e crimpati alle ferrules come mostrato in precedenza.
Una volta preparato il cavo, dovrai testare la continuità di conduttori e perni. Nel nostro esempio, il perno da tre a sei è collegato al conduttore bianco, marrone, verde e giallo. Ora i pin cinque e sei, che sono verdi e gialli, sono collegati al terminale della lucentezza per applicare tensione alla coppia di elettrodi esterni.
Infine, dovrai collegare il secondo multimetro, che verrà utilizzato per misurare la caduta di tensione transepiteliale, ai pin tre e quattro, cioè, nel nostro esempio, al conduttore bianco e marrone. Abbiamo deciso di montare l'installazione in un telaio in plastica economico. Prima del primo utilizzo, il microcontrollore deve essere programmato.
Il codice sorgente è scritto in C+e può essere caricato da un USB. In breve, aggiungi zero in una modalità di uscita centrale. Quando è acceso, il ciclo di funzione inizierà ad alternarsi come pin tra terra e più cinque volt con un ritardo variabile.
Nel nostro esempio, abbiamo usato un tempo teorico di semi-oscillazione di 40 millisecondi. Vediamo come i risultati della misurazione si confrontano con i valori di riferimento che avevamo ottenuto in precedenza. L'elettrodo della bacchetta viene riposizionato nel volt-ametro recentemente assemblato.
Il dispositivo viene acceso in tre passaggi. Cioè, collegando un caricabatterie USB, cambiando il multimetro sinistro alla misurazione della tensione CA e passando il secondo multimetro al microampere. Attenzione, che la corrente alternata deve essere selezionata esplicitamente.
In questo esempio, la caduta potenziale attraverso il sistema di filtri Transwell viene misurata come circa 25 millivolt, mentre registriamo una corrente di 37,1 microampere. Secondo la legge di Ohm, l'impedenza elettrica può essere facilmente calcolata a 674 ohm, che è molto vicino al valore di riferimento di 680. Abbiamo dimostrato che i valori di misurazione sono affidabili su un intervallo da zero a 1,8 kiloohm.
Pertanto, il volt-ametro descritto può essere utilizzato sia per esperimenti iniziali che per ulteriori studi. Tuttavia, se i risultati devono essere pubblicati, potresti sempre voler supportare i tuoi dati, misurando il flusso di molecole attraverso il rispettivo strato cellulare.
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Panoramica
Questo studio presenta un metodo economico per misurare l'impedenza elettrica transepiteliale mediante un volt-amperometro programmabile progettato per essere utilizzato con elettrodi a forma di bacchette. L'approccio migliora l'accessibilità delle misurazioni di resistenza nei monociti epiteliali, fondamentali per valutare la funzione di barriera nella coltura cellulare.
Componenti Chiave dello Studio
Area di Ricerca
- Biologia cellulare
- Misurazioni di impedenza elettrica
- Valutazione della funzione di barriera
Sfondo
- La misurazione dell'impedenza elettrica transepiteliale è stata utilizzata fin dagli anni '80 per valutare i monociti epiteliali.
- I dispositivi standard per questa misurazione possono essere costosi e potrebbero non offrire frequenze di uscita adattabili.
- Questo studio presenta un'alternativa economica che mantiene precisione e affidabilità.
Metodi Utilizzati
- Assemblaggio di un voltamperometro utilizzando componenti elettronici standard.
- Cultura di cellule di papilloma epiteliale del plesso coroideo su filtri Transwell come sistema modello.
- Implementazione della misurazione a quattro terminali per migliorare l'accuratezza delle misure.
Risultati principali
- Il voltamperometro assemblato ha fornito letture di impedenza affidabili, con valori misurati che corrispondono strettamente ai valori di riferimento.
- Le misurazioni dell'impedenza elettrica hanno mostrato un intervallo di affidabilità compreso tra 0 e 1,8 kiloohm.
- I risultati delle misurazioni hanno confermato l'utilità del dispositivo sia per esperimenti iniziali che per ulteriori studi.
Conclusioni
- Questo studio dimostra una soluzione realizzabile ed economica per effettuare misurazioni della resistenza elettrica in colture cellulari.
- I risultati sono significativi per il progresso delle tecniche nella ricerca biologica e nella valutazione delle proprietà degli strati cellulari.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale Esecutiva
Soluzioni economiche e programmabili per la misurazione del TEER consentono una valutazione scalabile della funzione della barriera epiteliale, sostenendo la validazione precoce dei bersagli e la riduzione dei rischi meccanicistici nella scoperta di farmaci. Fornendo dati quantitativi affidabili sull'impedenza, questo approccio aumenta la sicurezza predittiva nei modelli preclinici delle barriere ematoencefalica, emato-rachidiana, gastrointestinale e polmonare. Il metodo supporta il triage del portafoglio riducendo l'incertezza biologica nei flussi di lavoro di identificazione dei composti promettenti.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione dell'Obiettivo
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante la valutazione quantitativa dell'integrità della barriera in modelli cellulari pertinenti alla malattia.
- Valore operativo: Supporta la validazione funzionale del bersaglio correlando perturbazioni genetiche o farmacologiche con modifiche misurabili nella resistenza transepiteliale.
- Valore predittivo: Facilita la riduzione del rischio meccanicistico fornendo letture di impedenza riproducibili e programmabili in frequenza che riflettono la formazione delle giunzioni strette e lo stato di salute del monostrato.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Fornisce output standardizzati e quantitativi per valutare gli effetti dei composti sulla funzione di barriera in formati compatibili con l'analisi ad alto rendimento.
- Valore operativo: Permette la riproducibilità del saggio grazie alla frequenza programmabile dell'output e al rilevamento a quattro terminali, riducendo al minimo la variabilità delle misurazioni tra le diverse prove.
- Scalabilità: Consente il riutilizzo della piattaforma su diverse linee cellulari e formati Transwell grazie a un design hardware economico e personalizzabile.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità Translazionale: Collega le fasi di scoperta e preclinica fornendo metriche di barriera pertinenti alla malattia, predittive della permeabilità in vivo e dell'integrità del tessuto.
- Avanzamento Basato sul Rischio: Supporta decisioni di avanzamento o interruzione identificando precocemente nel processo i composti che alterano la funzione di barriera.
- Allineamento con Biomarcatori: Permette di correlare le variazioni del TEER con biomarcatori traslazionali dello stato di salute dell'epitelio e della modulazione delle giunzioni strette.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dalla validazione iniziale della proteina bersaglio fino all'identificazione del composto attivo e alla valutazione delle barriere precliniche, consentendo un avanzamento basato su dati funzionali relativi all'integrità epiteliale.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi biologici collegando interventi genetici o farmacologici a modifiche misurabili nell'impedenza epiteliale.
- Screening: Offre prontezza del saggio e output quantitativi di impedenza che permettono un confronto affidabile tra condizioni sperimentali all'interno di librerie di composti.
- Analisi: Fornisce misurazioni precise della resistenza (intervallo 0–1,8 kΩ) e segnali programmabili in frequenza che supportano il confronto statistico e la normalizzazione dei dati.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica modellando sistemi di barriera umani (ad esempio, barriera emato-encefalica) mediante linee cellulari validate.
- Riutilizzo aziendale: Rappresenta una capacità riutilizzabile e a basso costo per la valutazione della funzione di barriera in diversi progetti e aree terapeutiche.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità meccanicistica nei meccanismi legati alle barriere.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione e riproducibilità grazie al controllo programmabile della frequenza e all'architettura a quattro terminali.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale permettendo l'assemblaggio interno di sistemi TEER affidabili, riducendo la dipendenza da dispositivi commerciali costosi.
- Impatto sul portafoglio: Orienta la priorizzazione corretta rispetto al rischio identificando precocemente le criticità che alterano la barriera, riducendo i rischi di fallimento in fasi avanzate.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze di base nell'elettronica per il montaggio, inclusa la saldatura, la crimpatura e il test di continuità di cavi e connettori personalizzati.
- Presuppone l'accesso a una scheda di sviluppo USB, a un microcontrollore a 8 bit, a multimetri standard con capacità TrueRMS in microampere e a una resistenza da 120 kΩ per la limitazione della corrente.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro riguardo alla preparazione degli elettrodi, all'equilibrazione del mezzo e ai tempi di misurazione, al fine di garantire risultati riproducibili.
- Richiede l'adattamento delle tecniche di posizionamento e stabilizzazione degli elettrodi a forma di bacchette quando si applica a dimensioni diverse dei pori dei dispositivi Transwell o a spessori diversi del monostrato cellulare.
- Limitato a misurazioni di impedenza nell'intervallo 0–1,8 kΩ; sistemi con resistenza più elevata potrebbero richiedere modifiche alla resistenza limitatrice di corrente o al guadagno dell'amplificatore.
