Name: Indagine sul ruolo trascrizionale di un silenziatore intronico RUNX1 di CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein acuta (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Scopri come utilizzare CRISPR/Cas9 per eliminare il silenziatore intronico di RUNX1 nelle cellule leucemiche OCI-AML3. Questo protocollo di elettroporazione migliora l'efficienza di editing e la vitalità cellulare.

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Gli autori desiderano ringraziare la prof.ssa M.D. Minden (Princess Margaret Cancer Centre, University Health Network, Toronto, Canada) per aver fornito la linea cellulare OCI-AML3. Inoltre, gli autori desiderano ringraziare le utilità di base della genomica e patobiologia del cancro (l'Università Cinese di Hong Kong) per aver fornito le strutture e l'assistenza a sostegno di questa ricerca.

1. Progettazione di crRNA
<ol><li>Progettare due crRNA, uno 5' e l'altro 3' del CRE di destinazione utilizzando uno strumento di progettazione CRISPR basato sul web28,29,30,31. Assicurarsi che un PAM di NGG si trovi immediatamente a valle della sequenza di destinazione per il riconoscimento Cas9. La progettazione dei due crRNA (crRNA-1 e crRNA-2) per la cancellazione del silenziatore RUNX1 18 è illustrata nella Figura 1. NOT:</</c10> Un crRNA contiene in genere un protospaziore di 20 mer che è complementare alla sequenza di destinazione.</li>
	<li>Controllare la presenza di polimorfismi a singolo nucleotide (SNP)/indele nelle sequenze PAM target e adiacenti inserendo le posizioni genomiche delle sequenze nella casella di ricerca di un browser genoma online (ad esempio, NCBI 1000 Genomes o UCSC Genome Browser). NOT:</</c11> Gli SNP/indel comuni hanno una minore frequenza allele di almeno l'1% nella popolazione generale.</li>
	<li>Inviare le sequenze crRNA selezionate per la sintesi con un fornitore commerciale. Inoltre, acquistare il tracrRNA per la formazione duplex di gRNA.</li>
</ol>2. Progettazione di Cancellazione Screening Primers
<ol><li>Progettare una coppia di primer che fiancheggiano l'area di eliminazione desiderata. Assicurarsi che i primer si trovino ad almeno 50 pb dai siti di scissione Cas9 in modo che l'amplificazione PCR sia minimamente influenzata da indele formate nei siti di scissione.</li>
	<li>Assicurarsi che l'amplificatore sia inferiore a 1.200 bp (preferibilmente più piccolo di 600 bp per una migliore risoluzione delle taglie). Inoltre, etichettare uno dei primer con un colorante fluorescente (ad esempio, 6 carboxyfluorescein (6-FAM)) all'estremità 5'per il rilevamento. I primer utilizzati per lo screening dell'eliminazione18 del silenziatore RUNX1 sono illustrati nella Figura 1.</li>
</ol>3. Preparazione di complessi RNP Cas9/gRNA
<ol><li>Risospendere i crRNA e il tracrRNA nel buffer 1x TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,5) a una concentrazione finale di 200 M.</li>
	<li>Per ogni crRNA, mescolare 2,2 gradi di crRNA di 200 M, 2,2 ll di 200 M tracrRNA e 5,6 L di 1 tampone TE (totale 10 ) in un tubo da 0,2 mL per ottenere una concentrazione duplex finale di 44 M.</li>
	<li>Incubare a 95 gradi centigradi per 5 min in un termociclore. Lasciare raffreddare i tubi a temperatura ambiente per la formazione complessa di gRNA.</li>
	<li>Diluire 10,4 litri di 62 M ricombinante di Cas9 nucleasi con 7,6 l di 1x di salina con buffer fosfato (PBS) per ottenere una concentrazione nucleabile finale di 36 M. NOT:</</c0> Questa quantità è sufficiente per la preparazione di due complessi Cas9/gRNA.</li>
	<li>Mescolare i volumi uguali (8,5 z) della nucleasi diluita con ciascuno dei duplex di gRNA ottenuti dal passaggio 3.3.</li>
	<li>Incubare a temperatura ambiente per 20 min per consentire la formazione complessa RNP. Mantenere le miscele sul ghiaccio fino all'elettroporazione.</li>
</ol>4. Elettroporazione dei Complessi RNP nelle cellule OCI-AML3
<ol><li>Coltura OCI-AML3 cellule in RPMI 1640 medio integrato con 10 % di siero bovino fetale inattivato dal calore (FBS), 1x GlutaMAX, 100 unità/mL di penicillina e 100g/mL di streptomicina (in seguito indicato come completo RPMI 1640 medio) a 37 c con 5 % CO2.</li>
	<li>Contare le cellule utilizzando la colorazione blu trypan. Assicurarsi che la vitalità cellulare al momento dell'elettroporazione sia superiore al 90%.</li>
	<li>Centrifuga 2,5 x 106 cellule in un tubo da 1,5 mL a 500 x g per 5 min a temperatura ambiente. Rimuovere il supernatante e lavare le cellule con 1 mL di 1x PBS. Girare giù le cellule di nuovo e rimuovere tutti i supernatali residui.</li>
	<li>Risospendere le cellule in 163 : L di RPMI 1640 medio senza fenolo rosso.  Aggiungete 16,7 l di ogni complesso di RNP (dal punto 3,6) e 3,6 di 100 M Electroporation Enhancer alle celle (volume totale : 200 gradi centigradi). Mescolare delicatamente pipettando. NOT:</</c3> L'Electroporation Enhancer è un DNA vettore per migliorare l'efficienza di editing.</li>
	<li>Trasferire la miscela in una cuvette di elettroporazione di 0,2 cm-gap senza bolle. Eseguire l'elettroporazione con un sistema di elettroporazione (Modalità: esponenziale; Tensione: 150 V; Capacità: 700 F; Resistenza 50 .</li>
	<li>Trasferire le cellule in un flacone di coltura tissutale T-25 contenente 6 mL di totale RPMI 1640 medio e incubare a 37 gradi centigradi con 5 % CO2.</li>
</ol>5. Screening e selezione dei cloni cellulari con eliminazioni biallelic
<ol><li>Diluire le cellule a 5 x 103/mL in totale RPMI 1640 medio un giorno dopo l'elettroporazione. Aggiungere 100 l della sospensione cellulare diluita in ogni pozzo di piastre di coltura dei tessuti 96-pozzo e lasciare che le cellule crescano per 7-14 giorni.</li>
	<li>Estrarre il DNA genomico dalle cellule utilizzando un sistema di purificazione ad alta velocità.</li>
	<li>Aggiungere 100 l di rilegatura della piastra e tampone di lisi ad ogni pozzetto di una piastra di estrazione di 96 pozze. Aggiungere al tampone 5 x 104 celle risospese in 10 - L di 1x PBS e mescolarle con il pipettaggio.</li>
	<li>Incubare a temperatura ambiente per 30 min per consentire il legame del DNA genomico ai pozzi.</li>
	<li>Aspirare la soluzione dai pozzi senza raschiare le superfici del pozzo. Lavare i pozze con 120 l di tampone di lavaggio.</li>
	<li>Asciugare l'aria i pozzi contenenti il DNA legato.</li>
	<li>Preparare 20 l di miscela PCR (2 x L di 10 volte buffer ad alta fedeltà, 0,8 di 50 m MgSO4, 0,4 l di 10 m, 0,4 l di 10 M dNTP, 0,4 l di 10M FAM-etichettato primer (passo 2.2), 0.4 L di 10 M senza etichetta invertire e 0.4 U.M.. NOT:</</c4> Preparare una miscela principale per garantire l'aggiunta di quantità standardizzate di reagenti in ogni campione.</li>
	<li>Aggiungere la miscela PCR ad ogni pozzo della piastra di estrazione ed eseguire le reazioni in un termociclore (Condizioni: 94 gradi iniziali per 2 min, seguite da 35 cicli di 94 gradi centigradi per 15 s, 56 gradi centigradi per 30 s e 68 gradi centigradi per 1 min).</li>
	<li>Stimare la quantità di prodotti misurando le loro concentrazioni in un numero selezionato di campioni utilizzando un fluorometro. Diluire tutti i campioni con nuclease-free H2O a 0,5 ng/L.</li>
	<li>Mescolare 1 ll dei prodotti PCR diluiti con 8,5 ll di formamide deionizzato e 0,5 l di standard di dimensioni coloranti fluorescenti in una piastra da 96 pozze compatibile con l'analizzatore genetico. NOT:</</c6> Preparare un mix master contenente deionized formamide e lo standard di dimensioni.</li>
	<li>Coprire la piastra con una piastra setta e denaturare i campioni a 95 gradi centigradi per 3 min in un termociclore. Non chiudere il coperchio della macchina.</li>
	<li>Eseguire l'elettroforesi gel capillare per separare i prodotti PCR etichettati come descritto in precedenza32.</li>
	<li>Dopo l'elettroforesi, aprire il software di analisi per analizzare i risultati.</li>
	<li>Fare clic su Nuovo progetto e selezionare Microsatellite. Quindi fare clic su OK.</li>
	<li>Fare clic su Aggiungi esempi al progetto e selezionare i file dei risultati (contenere l'estensione fsa). Quindi fare clic su Aggiungi all'elenco per importare i file.</li>
	<li>Nella tabella che mostra i file dei risultati selezionati, scegliete Microsatellite Default nella colonna Metodo di analisi. Inoltre, selezionare lo standard di dimensione utilizzato nella colonna Size Standard. Quindi fai clic sull'icona Analizza, inserisci il nome dell'esperimento e salva l'esperimento.</li>
	<li>Fare clic su Visualizza grafici per visualizzare i risultati e scegliere Analisi frammento nell'impostazione di stampa.</li>
	<li>Scegliere i canali colorati appropriati per l'analisi. Controllare l'icona arancione per visualizzare i frammenti etichettati nello standard di dimensione per valutare la qualità delle chiamate di dimensioni.</li>
	<li>Selezionare l'icona blu per visualizzare i prodotti PCR etichettati. Identificare i picchi che corrispondono ai prodotti wild-type e mutant (cioè, recanti le delezioni previste). Stimare il livello di mutante in ogni campione dividendo l'area sotto il picco mutante per la somma dell'area sotto i picchi di tipo selvatico e mutanti.</li>
	<li>Selezionare più pool di celle con livelli elevati delle eliminazioni previste per ulteriori diluizioni seriali.</li>
	<li>Ripetere l'estrazione del DNA, la PCR fluorescente e i passi capillari dell'elettroforesi. Selezionare cloni cellulari con livelli mutanti >95% che rappresentano le delezioni bialeliche per le analisi successive.</li>
	<li>Verificare l'identità delle eliminazioni nei cloni selezionati mediante la sequenza di Sanger.</li>
</ol>6. Analisi funzionali dell'eliminazione del silenziatore da analisi quantitativa RT-PCR in tempo reale
<ol><li>Estrarre l'RNA totale dai cloni selezionati ed eseguire la sintesi complementare del DNA (cDNA).</li>
	<li>Mescolare 1 g di RNA con 1 o luna di 50 oligo M(dT)20 primer e 1 L di 10 mm di miscela dNTP in un volume totale di 10 .L. Incubare a 65 gradi centigradi per 5 min e poi posizionare sul ghiaccio per almeno 1 min.</li>
	<li>Aggiungere 10 l di mix di sintesi cDNA contenente 2 L di 10x buffer di RT, 4 luna di 25 mM MgCl2, 2 M DTT, 1 L di Inibitore di RNase (40 U/LàL) e 1 l di trascrizione inversa (200 U/L). Incubare a 50 gradi centigradi per 50 min e poi 85 gradi centigradi per 5 min in un termociclista. NOT:</</c2> Preparare un master mix per la trascrizione inversa.</li>
	<li>Raffreddare i campioni sul ghiaccio. Aggiungete 1 -L di RNase H e incubate a 37 gradi centigradi per 20 min. conservate il cDNA a -20 gradi centigradi.</li>
	<li>Progetta primer e sonde TaqMan che riconoscono specificamente le singole varianti di trascrizione generate da promotori alternativi. NOT:</</c3> Sono disponibili in commercio set di primer/sonde specifici della trascrizione.</li>
	<li>Clona frammenti di DNA contenenti le sequenze specifiche di trascrizione nel DNA plasmico. Preparare una serie di diluizione di 10 volte (da 106 a 10 copie) dei plasmidi ricombinanti come curve standard per la quantificazione della trascrizione.</li>
	<li>Preparare 20 l di miscela PCR (0,5 l di modello di DNA, 1 l una di 20 x test sonda/primer TaqMan pre-progettato e 10 l di 2x TaqMan PCR Master Mix) per ogni campione (sia cDNA che plasmid standards). Misurare ogni campione in triplice copia. NOT:</</c5> Preparare un master mix per la PCR in tempo reale.</li>
	<li>Eseguire le reazioni in una macchina PCR in tempo reale (Condizioni: 50 gradi iniziali per 2 min e 95 gradi centigradi per 10 min, seguite da 40 cicli di 94 gradi centigradi per 15 s e 60 gradi per 1 min).</li>
	<li>Dopo l'amplificazione, fare clic sull'icona Analizza nel software per analizzare i dati. Controllare la pendenza e il coefficiente di correlazione delle curve standard per valutare l'efficienza e la linearità delle reazioni. Assicurarsi che le pendenze siano comprese tra -3,1 e -3,6 e che i coefficienti di correlazione siano maggiori di 0,99.</li>
	<li>Normalizzare il numero di copia delle trascrizioni target in ogni campione con un gene di pulizia (ad esempio, GAPDH).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il sistema CRISPR/Cas9 è stato utilizzato in una vasta gamma di applicazioni di editing del genoma come il knockout genico e gli studi a caso35,36, regolazione trascrizionale37,38, ingegneria genetica di vari organismi modello39,40,41,42,43,44 e terapia genica45,46. Qui, dimostriamo l'uso di CRISPR/Cas9 per studiare le conseguenze funzionali dell'eliminazione di un silenziatore intronico sul gene RUNX1. La consegna dei componenti CRISPR nel nostro approccio non si basava sul DNA plasmide, sulla clonazione di gRNA o virus, ma sull'elettroporazione dei complessi Preassemblati Cas9/gRNA RNP. È stato dimostrato che l'uso di DNA esogeno può essere associato all'integrazione indesiderabile di sequenze vettoriali estranee nel genoma dell'ospite, a una maggiore tossicità e bassa efficienza25,47,48, mentre i metodi di trasduzione dei virus richiedono molto tempo. Inoltre, l'espressione prolungata di Cas9 dal DNA plasmide può aumentare gli effetti fuori bersaglio48. Al contrario, l'approccio diretto di consegna basata su RNP è stato stabilito come metodo preferito in quanto è veloce e diretto con una migliore efficienza di modifica, selettività e redditività delle cellule. Infatti, una varietà di metodi come lipofezione49,50, elettroporazione25,51, nanoparticelle52, peptidi penetranti nelle cellule53, iTOP54 e TRIAMF 55 sono stati sviluppati per l'efficiente consegna CRISPR/Cas9 in diversi tipi di cellule, così come specie animali e vegetali24,25,26,56,57 , 58 (di base) , 59 (di cinità) , 60 del sistema , 61 o , 62 del sistema , 63.Poiché le sequenze di DNA non codificanti sono punti caldi di variazioni genetiche64, controllare la presenza di SNP/indel comuni nelle sequenze PAM target e vicine è particolarmente rilevante quando si progetta gRNA che si rivolge a normative Elementi.
Un collo di bottiglia nell'editing del genoma CRISPR/Cas9 prevede lo screening dei cloni mutanti desiderati in un gran numero di campioni. Abbiamo impiegato la PCR fluorescente accoppiata con l'elettroforesi capillare del gel per lo screening, poiché la mutazione bersaglio è una piccola eliminazione genomica di circa 300 bp. Questo metodo è rapido e sensibile e può essere eseguito in modo ad alta velocità effettiva. Inoltre, questo metodo consente una stima accurata dei livelli mutanti e delle dimensioni di delezione contemporaneamente. Inoltre, è supportata l'analisi multiplex di frammenti di PCR etichettati con diversi coloranti fluorescenti. Abbiamo usato regolarmente questa tecnica per genottare piccoli inserimenti/ eliminazioni nei neoplasmi mieloidi65,66. Nella nostra esperienza, siamo in grado di rilevare costantemente dimensioni dei frammenti che differiscono di 4 bp con alta precisione e carico mutante fino al 3 %. Tuttavia, va notato che questo metodo ha un limite di dimensione del frammento di 1.200 bp, e quindi non è adatto per lo screening di eliminazioni di grandi dimensioni. Inoltre, non è possibile rilevare sostituzioni di base (con conseguente dimensione dei frammenti invariata) e potenziali eventi fuori bersaglio in altre regioni genomiche. Per quest'ultimo, il costoso sequenziamento dell'intero genoma è necessario per profilare in modo completo i cambiamenti globali indesiderati nei cloni bersaglio. Per adottare il nostro attuale approccio per lo studio di grandi sequenze normative non codificanti (>1,000 bp), è possibile eseguire un'analisi dettagliata della cancellazione e della mutagenesi dei siti di legame dei fattori di trascrizione putativa utilizzando analisi dei geni dei reporter in vitro in anticipo per delineare la regione funzionale minima per la modifica CRISPR/Cas918.
Poiché molti geni contengono più di un promotore3,4, è importante essere consapevoli dell'esistenza di promotori alternativi nel locus genico bersaglio in quanto la manipolazione degli elementi regolatori può influenzare i promotori in modo differenziale. Pertanto, le varianti di trascrizione derivate da diversi promotori devono essere misurate individualmente per valutare eventuali risposte specifiche del promotore. L'uso di saggi basati su probe TaqMan è preferito rispetto a SYBR Green a causa di una migliore specificità e riproducibilità. Se è disponibile il sistema PCR digitale più avanzato, la quantificazione della trascrizione può essere eseguita in modo più preciso senza la necessità di una costruzione standard della curva.
Una considerazione importante nell'esecuzione di esperimenti CRISPR/Cas9 nelle linee cellulari tumorali è la ploidia e il numero di copia del gene bersaglio nelle cellule utilizzate come praticamente tutte le linee cellulari tumorali che ospitano alterazioni genetiche comprese le variazioni strutturali e del numero di copie. Nel nostro caso, OCI-AML3 ha un cariotipo iperdiploide con 45-50 cromosomi. Inoltre, la linea cellulare è stato trovato per portare un normale numero di copia RUNX1 come rivelato dalla Cancer Cell Line Encyclopedia67 e fluorescenza in studi di ibridazione situ18. Quando si mira un gene con guadagno del numero di copie, potrebbe essere necessario ottimizzare il metodo di consegna per fornire livelli sufficienti dei componenti CRISPR per l'editing. Inoltre, potrebbe essere necessario vagliare altri cloni per identificare i knockout completi. È importante sottolineare che il targeting a regioni genomiche amplificate, in particolare quelle causate da riarrangiamenti strutturali, può innescare risposte antiproliferanti indipendenti dal gene nelle cellule tumorali, portando a risultati falsi positivi nel gene studi funzionali68,69,70. A questo proposito, per verificare i risultati del CRISPR dovrebbero essere adottati approcci alternativi come l'interferenza dell'RNA (RNAi) al knockdown e/o alla sovraespressione cDNA. Inoltre, più linee cellulari dovrebbero essere utilizzate per evitare interpretazioni errate degli effetti di editing CRISPR specifici della linea cellulare ma indipendenti dal gene.
Il sistema CRISPR/Cas9 ha rivoluzionato la ricerca di base e traslazionale fornendo un mezzo semplice ed efficiente per l'editing del genoma. Qui dimostriamo la facilità di utilizzo di CRISPR/Cas9 per interrompere un silenziatore intronico per studi trascrizionali in una linea cellulare del cancro. Questa tecnica consente lo studio delle CRE a livello di DNA e offre l'opportunità di esaminare le funzioni cre nel contesto endogeno piuttosto che i geni reporter eterologi tradizionali. Recentemente, è stato identificato anche un sistema di editing dell'RNA basato su CRISPR71 e può servire da nuovo strumento per studiare le CRE prendendo di mira l'RNA trascritto dagli elementi regolatori. Combinandosi con tecniche di cattura della conformazione cromosomica, CRISPR/Cas9 aiuterà certamente a decifrare il coinvolgimento delle CRE nell'organizzazione alterata del genoma e nell'espressione genica legata a vari problemi di salute.

Gli elementi Cis-regulatory (CRE) sono sequenze di DNA non codificanti che contengono siti di legame per regolatori trascrizionali per controllare l'espressione genica1,2. Questi elementi sono in genere lunghi da 100 a 1.000 coppie di base (bp). Promotori e potenziatori sono i due tipi di CRE più caratterizzati. I promotori sono presenti in prossimità dei siti di partenza della trascrizione e costituiscono l'unità di base della trascrizione. Molti geni hanno più di un promotore e il loro uso alternativo contribuisce alla diversità del trascrittoma e alla specificità dei tessuti3,4. D'altra parte, gli stimolatori attivano la trascrizione e possono essere localizzati a monte, a valle o all'interno di introni dei geni bersaglio. Gli esaltatori possono agire da lontano (su una megabase) e indipendentemente dall'orientamento1,2. I CRE includono anche silenziatori e isolanti5,6. Il primo agisce in modo opposto agli stimolatori per inibire l'espressione genica legandosi ai repressori trascrizionali, mentre il secondo divide il genoma in domini topologicamente discreti per isolare geni da altri CRE dai domini vicini. Questi elementi agiscono in concerto l'uno con l'altro attraverso interazioni di cromatina a breve e/o a lungo raggio e sono organizzati in centri normativi per dirigere una corretta espressione genica patiotemporale. I recenti progressi nelle tecniche di sequenziamento ad alto valore di produzione hanno accelerato l'identificazione e l'annotazione funzionale di molte CRE che hanno notevolmente facilitato la nostra comprensione delle reti trascrizionali che dettano il gene specifico del lignaggio espressione in diversi tipi di cellule e tessuti7,8,9,10,11,12.
Dato il ruolo fondamentale delle CRE nella regolazione della trascrizione, le loro alterazioni possono portare all'espressione genica aberrante. È stato dimostrato che i CRE sono spesso interrotti da cambiamenti genetici ed epigenetici in diversi tipi di tumori umani, contribuendo così all'inizio del tumore, alla progressione e all'aggressività13,14. Inoltre, i fattori cre-binding sono spesso mutati e/o male espressi in vari tipi di cancro, evidenziando ulteriormente il significato della deregolamentazione CRE nell'oncogenesi15. Le CRE possono anche essere colpite da aberrazioni strutturali, come esemplificato da frequenti riarrangiamenti cromosomici dell'avanzata genetica immunoglobulina pesante (IgH) che si traducono in un'attivazione anomala degli oncogeni vicini nei linfomi a cellule B16. Nella leucemia mieloide acuta (AML), il riposizionamento di un singolo potenziatore mediante cromosoma 3q riarrangia il 3q provoca la downregolazione GATA2 concomitante e l'attivazione di EVI1, che può essere potenzialmente presa di mira dall'inibizione di BET delle funzioni di potenziatore 17.Recentemente, abbiamo caratterizzato una nuova traslocazione cromosomica che comporta la perturbazione di un silenziatore intronico RUNX1 che potrebbe contribuire alla progressione di AML in un paziente pediatrico18. Pertanto, la decifrazione del genoma del cancro non codificante offre vie fruttuose per chiarire la patogenesi della malattia, la scoperta di biomarcatori e gli interventi terapeutici, che in ultima analisi migliorano gli esiti dei pazienti.
Il percorso nuclease CRISPR/Cas9, originariamente identificato come sistema immunitario adattivo nelle cellule procariotiche, è stato sfruttato come mezzo rapido ed economico per l'editing genomico site-specific in cellule viventi e organismi19,20 ,21,22. Il sistema CRISPR/Cas9 coinvolge due componenti principali: la gRNA e la nuogene Cas9 derivata da Streptococcus,derivata da Stre9. Il gRNA contiene una sequenza specifica chiamata protospacer che riconosce la regione di destinazione e dirige Cas9 per l'editing. Il gRNA è composto da due parti: CRISPR RNA (crRNA), tipicamente una sequenza nucleotide di 20 mer complementare al DNA bersaglio, e un crRNA a riattivazione trans (tracrRNA), che funge da scaffold di legame per la nucleato. Un motivo adiacente al protospaziale (PAM) (5'-NGG) immediatamente adiacente al sito di destinazione è necessario per la scissione di Cas9 e il sito di scissione si trova a 3 nucleotidi a monte del PAM. con un plasmide che codifica Cas9 e il gRNA clonato23. Tuttavia, questo approccio è impegnativo per le cellule ematopoietiche, che sono spesso difficili da trasfecare e richiedono lunghi metodi di trasduzione basati su virus. Un approccio alternativo è la somministrazione cellulare diretta di complessi RNP Cas9/gRNA preassemblati24. Un metodo comune per la somministrazione di RNP è l'elettroporazione, che genera pori temporanei nella membrana cellulare, consentendo così l'ingresso dei complessi RNP nelle cellule25,26. I vantaggi di questo approccio includono la facilità d'uso, la riduzione degli effetti fuori target e la stabilità dei complessi RNP. Qui, descriviamo un protocollo di utilizzo del metodo di consegna RNP per studiare il ruolo trascrizionale di un silenziatore intronico RUNX1 nella linea cellulare leucemia OCI-AML318, che è stata stabilita dal sangue periferico di un paziente AML diagnosticato il sottotipo M4 franco-americano-britannico27. Il protocollo include la progettazione del crRNA, la preparazione di complessi RNP, l'elettroporazione, lo screening e la successiva caratterizzazione dei cloni desiderati.

<table><tbody><tr><td>cuvetta per elettroporazione con gap di 0,2 cm</td><td>Bio-Rad</td><td>1652086</td><td></td></tr><tr><td>tampone 1&times;TE, pH 7,5</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>11-01-02-02</td><td></td></tr><tr><td>Miscela dNTP da 10 mM</td><td>Analizzatore genetico Thermo Fisher Scientific 18427013</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3500 Primer diretto</td><td></td><td></td> per PCR fluorescente marcato con 6 4405673 <td></td>Fisher Fisher Scientific</tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Nessuno 7300</td><td></td></tr><tr><td>Sistema PCR in tempo reale</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Nessuno Sistema</td><td></td></tr><tr><td>7300 Software SDS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Nessuno</td><td>Versione 1.3.1</td></tr><tr><td>Bio-Rad Gene Pulser Xcell Kit</td> di purificazione diretta del gDNA <td>Bio-Rad</td><td>1652660</td><td></td></tr><tr><td>ChargeSwitch, 96 pozzetti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>CS11205</td><td></td></tr><tr><td>crRNA-1</td><td>Tecnologie integrate del DNA</td><td>Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA</td><td>Componenti del complesso Cas9/gRNA</td></tr><tr><td>crRNA-2</td><td>Tecnologie integrate del DNA</td><td>Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA</td><td>Componenti del complesso Cas9/gRNA</td></tr><tr><td>Formammide deionizzata</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4311320</td><td></td></tr><tr><td>Electroporation Enhancer</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>1075915</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270098</td><td></td></tr><tr><td>Fluorimetro</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32857</td><td></td></tr><tr><td>GeneMapper Software 5</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4475073</td><td></td></tr><tr><td>GeneScan 600 LIZ Size Standard</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4408399</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>PBS, soluzione 10x, pH 7,4</td><td>Affymetrix</td><td>75889</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina e streptomicina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Taq DNA Polimerasi High Fidelity</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11304029</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>Ricombinante S. pyogenes Nucleasi Cas9</td> DNA <td>integrato</td><td>Tecnologie 1081058</td><td>Componenti del complesso Cas9/gRNA</td></tr><tr><td>Terreno RPMI 1640</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31800-022</td><td></td></tr><tr><td>Terreno RPMI 1640 senza rosso fenolo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11835030</td><td></td></tr><tr><td>Saggi di espressione genica RUNX1a TaqMan</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4331182</td><td>Hs04186042_m1</td></tr><tr><td>RUNX1b/c TaqMan saggi di espressione genica</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4331182</td><td>Hs00231079_m1</td></tr><tr><td>RUNX1c TaqMan saggi di espressione genica</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4331182</td><td>Hs01021966_m1</td></tr><tr><td>SuperScript III First-Strand Synthesis System</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18080051</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4304437</td><td></td></tr><tr><td>tracrRNA</td><td>Tecnologie integrate del DNA</td><td>1072533</td><td>Componenti del complesso Cas9/gRNA</td></tr><tr><td>Reagente TRIzol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Primer inverso per PCR non marcato</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Nessuno</td><td></td></tr></tbody></table>

indagine sul ruolo trascrizionale di un silenziatore intronico runx1 di crispr/cas9 ribonucleoprotein acuta

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

La maggior parte del genoma umano (98%) è costituito da sequenze non codificanti. Gli elementi Cis-regulatory (CRE) sono sequenze di DNA non codificanti che contengono siti di legame per regolatori trascrizionali per modulare l'espressione genica. Le alterazioni delle CRE sono state implicate in varie malattie, tra cui il cancro. Mentre i promotori e gli stimolatori sono stati i CRE primari per lo studio della regolazione genica, si sa molto poco sul ruolo del silenziatore, che è un altro tipo di CRE che media la repressione genica. Originariamente identificato come un sistema di immunità adattivo nei procarioti, CRISPR/Cas9 è stato sfruttato per essere un potente strumento per l'editing del genoma eucatrale. Qui, presentiamo l'uso di questa tecnica per eliminare un silenziatore intronico nel gene umano RUNX1 e studiare gli impatti sull'espressione genica nelle cellule leucemiche OCI-AML3. Il nostro approccio si basa sulla consegna mediata dall'elettroporazione di due complessi RNLnucleoprotein a rna (gRNA) Cas9/guide (GRNA) preassemblati per creare due rotture a doppio filamento (DSB) che fiancheggiano il silenziatore. Le eliminazioni possono essere facilmente sottoposte a screening mediante l'analisi dei frammenti. Le analisi di espressione di diversi mRNA trascritti da promotori alternativi aiutano a valutare gli effetti dipendenti dal promotore. Questa strategia può essere utilizzata per studiare altre CRE ed è particolarmente adatta per le cellule ematopoietiche, che sono spesso difficili da trasfecare con metodi a base di plasmide. L'uso di una strategia plasmide e priva di virus consente valutazioni semplici e rapide delle funzioni di regolazione genica.

Lo scopo di questo esperimento è quello di eliminare un silenziatore intronico nel gene RUNX1 ed esaminare gli impatti sulla trascrizione RUNX1 nelle cellule OCI-AML3. Il silenziatore è stato identificato da un approccio molecolare combinatorio e ha trovato un elemento centrale di 209 bp18. Per consentire una valutazione più accurata di questo elemento centrale nel controllo dell'espressione RUNX1, i crRNA (crRNA-1 e crRNA-2) sono stati progettati per indirizzare vicino a questa regione18 (Figura 1). I siti di scissione Cas9 previsti portati da crRNA-1 e crRNA-2 erano rispettivamente 29 bp e 35 bp dall'elemento centrale (Figura 1). Va notato che mentre i siti PAM dei due crRNA risiedono su fili opposti, dSB si verificheranno indipendentemente dalla posizione della sequenza PAM. Pertanto, si prevede che l'introduzione concomitante di due complessi Cas9/gRNA RNP guidati da crRNA-1 e crRNA-2 assorbano l'elemento silenziatore dal locus RUNX1.
Per esaminare le eliminazioni desiderate in un gran numero di campioni, è stato utilizzato un formato di 96 pozzetto di kit di estrazione genomica del DNA per la purificazione ad alta produttività. Inoltre, il DNA legato ai pozzetti delle piastre di estrazione può essere sottoposto ad amplificazione diretta, riducendo così al minimo gli errori o la contaminazione dovuti al trasferimento ripetuto del campione. I primer utilizzati per lo screening delle eliminazioni18 sono mostrati nella Figura 1. La dimensione prevista del prodotto PCR wild-tipo è di circa 500 bp. Dal momento che la prevista cancellazione si estende 273 bp, il prodotto mutante dovrebbe essere di circa 230 bp. Questa gamma di dimensioni consente un'analisi semplice e rapida dei frammenti mediante elettroforesi in gel capillare. Un totale di 160 piscine cellulari iniziali sono stati esaminati e 14 sono stati trovati per trasportare le eliminazioni previste con livelli mutanti di almeno 70%. Sono state quindi selezionate cinque piscine per ulteriori diluizioni seriali per identificare i cloni recanti delezioni bialleliche. Gli elettroferigrammi rappresentativi dei cloni cellulari con diversi livelli di prodotti mutanti sono illustrati nella Figura 2A. L'identità delle eliminazioni è stata verificata da Sanger sequenziamento (Figura 2B). Come previsto, gli indelformati formati da end join non omologamente riparazione di DSB33 sono stati osservati nei siti di scissione previsti nei cloni di cancellazione. Questi hanno portato all'amplificazione di prodotti mutanti di varie dimensioni, che potrebbero essere rilevati anche dall'elettroforesi capillare (Figura 2A).
Il gene RUNX1 contiene due promotori, vale a dire il P1 distale e il P2 prossimale, che sono separati da un grande intron che ospita l'elemento silenziatore34. Questi promotori hanno prodotto tre principali trascrizioni di mRNA: RUNX1c di P1 e RUNX1a e RUNX1b di P234. La sequenza nucleotide di RUNX1c e RUNX1b sono identiche tranne che la prima ha un unico N-terminus, da cui è possibile progettato uno specifico saggio di espressione genica TaqMan (Figura 3A). Per misurare RUNX1b, è stato utilizzato un saggio TaqMan che riconosce sia RUNX1b che RUNX1c (Figura 3A). I livelli RUNX1b sono stati quindi determinati sottraendo RUNX1b/RUNX1c totali da RUNX1c. RUNX1a è un isoforme nettamente più breve a causa dello splicing alternativo e un test TaqMan specifico è disponibile per questa variante (Figura 3A). Così, l'attività dei promotori P1 e P2 può essere determinata individualmente. La RT-PCR quantitativa in tempo reale ha mostrato che l'eliminazione dell'elemento silenziatore ha regolato significativamente i livelli di espressione delle trascrizioni derivate da P1 e P2 (Figura 3B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60130/60130fig1.jpg"> Figura 1 : Strategia per eliminare il silenziatore intronico RUNX1. Il silenziatore (scatola rossa) si trova nel primo intron del gene RUNX1 che separa i due promotori P1 e P2 (vengono mostrate le coordinate hg19). Due crRNA (crRNA-1 e crRNA-2) sono stati progettati per introdurre i DSB che fiancheggiano l'elemento silenziatore. I siti di scissione Cas9 previsti sono indicati da linee rosse verticali e i siti PAM (NGG) sono viola. I due primer utilizzati per lo screening delle delezioni sono rappresentati da frecce aperte. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60130/60130fig1large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60130/60130fig2.jpg"> Figura 2 : identificazione dei cloni di cancellazione. (A) Elettroferigrammi rappresentativi di cloni cellulari che mostrano diversi livelli di prodotti mutanti PCR (MUT). La dimensione dei prodotti mutanti varia tra i cloni a causa di indels formati nei siti di scissione. WT - di tipo selvaggio. (B) Verifica delle cancellazioni da cloni rappresentativi da parte del sequenziamento di Sanger. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60130/60130fig2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60130/60130fig3.jpg"> Figura 3 : conseguenze funzionali dell'eliminazione del silenziatore. (A) Vengono visualizzati i tre principali isoformi RUNX1 (RUNX1a, RUNX1b e RUNX1c). Queste varianti contengono lo stesso dominio di legame DNA Runt, ma diverso N- (arancione) o C-terminus (blu). La posizione delle coppie sonda/primer TaqMan è indicata da linee rosse. I numeri indicano i residui di amminoacidi. (B) Analisi quantitativa RT-PCR in tempo reale delle trascrizioni di RUNX1 P1 e P2 in colture cellulari con (DEL) o senza (WT) le eliminazioni bialletali18. GAPDH è stato utilizzato per la normalizzazione. Indicano P &lt; 0,05 e P &lt; 0,01, rispettivamente dal test Mann-Whitney. Questa cifra è stata modificata da Cheng etal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60130/60130fig3large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

La somministrazione diretta di complessi preassemblati di ribonucleoproteina di RNA Cas9/guide è un mezzo veloce ed efficiente per l'editing del genoma nelle cellule ematopoietiche. Qui, utilizziamo questo approccio per eliminare un silenziatore intronico RUNX1 ed esaminare le risposte trascrizionali nelle cellule leucemiche OCI-AML3.

Indagine sul ruolo trascrizionale di un silenziatore intronico RUNX1 di CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein acuta

The bulk of the human genome (~98%) is comprised of non-coding sequences. Cis-regulatory elements (CREs) are non-coding DNA sequences that contain binding ...

Elementi regolatori cis come promotori e potenziatori sono determinanti chiave dell'espressione genica. Gli approcci tradizionali per studiare questi elementi sono laboriosi e spesso comportano l'uso di geni reporter eterologi. Qui dimostriamo l'uso di CRISPR per esaminare il ruolo trascrizionale di un silenziatore intronico RUNX1 nella linea cellulare della leucemia.Il protocollo è semplice da eseguire e consente valutazioni veloci delle funzioni di regolazione genica nel contesto genico endogeno. Le cellule ematopoietiche sono spesso difficili da trasfetto con metodi a base di plasmide. In questo protocollo, usiamo l'elettroporazione per fornire Cas9 preassemblato, RNA guida, complessi nelle cellule.I vantaggi di questo approccio includono l'uso di una migliore efficienza di modifica e vitalità delle celle, nonché la riduzione degli effetti fuori bersaglio. Inoltre, l'uso successivo dell'analisi dei frammenti consente uno screening semplice e veloce dei cloni mutanti desiderati da una grande quantità di campioni. A dimostrare la procedura sarà Yuk-Lin Yung, tecnico del mio laboratorio.Inizia progettando due RNA CRISPR, uno da cinque primi e l'altro tre primi dell'elemento regolatore cis target, o CRE. Assicurarsi che un PAM di NGG si trovi immediatamente a valle della sequenza di destinazione per il riconoscimento Cas9. Per formare il complesso del gRNA, combinare l'RNA CRISPR e l'RNA tracciante nel buffer TE secondo le direzioni manoscritte, per una concentrazione finale duplex di 44 micromolare.Incubare la miscela a 95 gradi celsius per cinque minuti e lasciare raffreddare a temperatura ambiente. Diluire la nucleasi Cas9 ricombinante con PBS per una concentrazione finale di nucleasi di 36 micromolare. Quindi mescolare un volume uguale della nucleasi diluita con ciascuno dei duplex gRNA e incubarli per 20 minuti a temperatura ambiente per consentire al complesso RNP di formarsi.Centrifuga 2,5 milioni di cellule in un tubo da 1,5 millilitri a 500 volte g per cinque minuti. Quindi scartare il supernatante e sospendere di nuovo le cellule in 163 microlitri di mezzo RPMI 1640 senza rosso fenolo. Aggiungere 16,7 microlitri del complesso RNP e 3,6 microlitri di 100 esaltatori di elettroporazione micromolare alle celle e trasferire la miscela in una cuvetta di elettroporazione a gap di 0,2 centimetri, facendo attenzione a non introdurre bolle.Elettroporare le cellule e trasferirle in un pallone da coltura tissutale T-25 contenente 6 millilitri di mezzo RPMI 1640 completo. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Un giorno dopo l'elettroporazione, diluire le cellule a 5000 cellule per millilitro in un mezzo RPMI 1640 completo.E aggiungere 100 microlitri della sospensione cellulare in ogni pozzo di una piastra di coltura tissutale da 96 porri. Coltura delle cellule per sette o 14 giorni, quindi estrarre dna genomico utilizzando un sistema di purificazione ad alta produttività. Aggiungere 100 microlitri di legatura a piastre e tampone di lisi a ciascun pozzo di una piastra di estrazione a 96 pozzi, seguita da 50.000 celle ri-sospese in 10 microlitri di PBS.Mescolare il contenuto del pozzo pipettando su e giù. Incubare la piastra a temperatura ambiente per 30 minuti per consentire al DNA genomico di legarsi ai pozzi. Quindi aspirare con cura la soluzione dai pozzi e lavarli con 120 microlitri di tampone di lavaggio.Asciugare all'aria la piastra. Aggiungere 20 microlitri di mix PCR a ciascun pozzo ed eseguire PCR secondo le indicazioni manoscritte. Una volta completata l'amplificazione, stimare la quantità del prodotto misurando la concentrazione di un numero selezionato di campioni con un fluorometro.Diluire tutti i campioni a 0,5 nanogrammi per microlitro con acqua priva di nucleasi. Mescolare un microlitro del prodotto PCR diluito con 8,5 microlitri di formamide deionizzata e 0,5 microlitri di dimensioni fluorescenti etichettate coloranti standard in una piattaforma da 96 pozzetti compatibile con l'analizzatore genetico. Coprire la piastra con un setto di piastre e denaturare i campioni a 95 gradi Celsius per tre minuti in un termociclo.Eseguire l'elettroforesi capillare per separare i prodotti PCR etichettati e analizzare i risultati sul software di analisi. Controllare l'icona arancione per visualizzare i frammenti etichettati e lo standard di dimensione per valutare la qualità delle chiamate di dimensioni. Quindi, controlla l'icona blu per visualizzare i prodotti PCR etichettati.Identificare i picchi corrispondenti ai prodotti di tipo selvaggio e mutante e stimare il livello mutante in ogni campione dividendo l'area sotto il picco mutante per la somma dell'area sotto i picchi di tipo selvaggio e mutante. Selezionare più pool di celle con livelli elevati delle eliminazioni previste per ulteriori diluizioni seriali. Ripetere i passaggi di estrazione del DNA, PCR fluorescente ed elettroforesi capillare e selezionare cloni con livelli mutanti superiori al 95% per l'analisi successiva.Estrarre l'RNA totale dai cloni selezionati ed eseguire la sintesi gratuita del DNA. Mescolare l'RNA con un primer poli-T e dNTP secondo le indicazioni manoscritte e incubare a 65 gradi Celsius per cinque minuti. Quindi, posizionare la reazione sul ghiaccio per almeno un minuto.Aggiungere dieci microlitri di mix di sintesi cDNA alla reazione. Quindi incubare il campione a 50 gradi Celsius per 50 minuti e 85 gradi Celsius per cinque minuti in un termociclo. Dopo la sintesi del cDNA, trattare i campioni con un microlitro di RNasi H e incubarli a 37 gradi Celsius per 20 minuti.Progetta primer e sonde TaqMan specificamente per la varianza della trascrizione individuale generata da promotori alternativi e clona i frammenti di DNA contenenti le specifiche sequenze di trascrizione nel DNA plasmide. Fai una serie di diluizione dieci volte dei plasmidi ricombinanti come curve standard per la quantificazione della trascrizione. Preparare 20 microlitri di mix PCR per ogni campione ed eseguire la PCR in tempo reale secondo le indicazioni manoscritte.Analizzare i risultati e normalizzare il numero di copie delle trascrizioni di destinazione in ogni campione con un gene di pulizia. Questo protocollo è stato utilizzato con successo per eliminare il silenziatore intronico RUNX1 e la cancellazione è stata confermata con elettroforesi a gel capillare. Le dimensioni previste dei prodotti PCR di tipo selvaggio e mutante sono rispettivamente di circa 500 coppie di basi e 230 coppie di basi.Le dimensioni dei prodotti mutanti possono variare tra i cloni a causa degli indeli formati nei siti di scissione. Il sequenziamento di Sanger è stato utilizzato per confermare l'identità delle eliminazioni. Il gene RUNX1 contiene due promotori, P1 e P2 che hanno prodotto tre trascrizioni principali di mRNA:RUNX1c di P1, e RUNX1a e RUNX1b di P2. La PCR quantitativa in tempo reale può essere utilizzata per determinare in che modo l'eliminazione dell'elemento silenziatore influisce sull'espressione di queste trascrizioni.Un buon design degli RNA CRISPR è importante per la sua valutazione dell'esperimento. Assicurarsi che l'RNA CRSIPR sia strettamente collegato all'area di eliminazione prevista. Inoltre, assicurarsi che una sequenza PAM si trovi a valle della sequenza di destinazione per il riconoscimento Cas9.Oltre a studiare i CRE, questa strategia può essere utilizzata per studi sulla posizione genica e funge da alternativa all'interferenza dell'RNA per esaminare le funzioni geniche. Combinando con le tecniche di cattura della conformazione cromosomica, CRISPR aiuterà certamente a decifrare i coinvolgimento dei CRE nell'organizzazione del genoma alterato e nell'espressione genica legata a vari problemi di salute come il cancro.

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