体外重建分离细胞的空间接触模式 秀丽隐杆线虫 胚胎卵裂球与粘附性聚苯乙烯微珠

多细胞组织具有复杂性，本方案以简化的方式重建细胞传导过程。该技术可用于研究细胞传导质子与细胞响应之间的直接关系。本方案利用化学功能化的聚苯乙烯微珠来重建细胞传导质子。

可以通过任何感兴趣的质子切割珠子，以测试其对细胞反应的影响。我们已在小鼠胚胎上使用了该方法。因此，本方案可适用于多种生物体的研究。

由于胚胎在经过高浓度亚氯酸盐处理后较为脆弱，因此在成功分离卵裂球之前需要大量练习。通过视觉演示可更清楚地了解在卵裂球分离过程中应如何操作毛细管。首先，在1.5毫升微量离心管中称取10毫克羧基化修饰的聚苯乙烯微球。

加入一毫升 MES 缓冲液至离心管中进行洗涤。涡旋振荡离心管以混匀磁珠。使用台式离心机在 2000×g 条件下离心 60 秒。

用移液器小心吸去上清液。再用一毫升 MES 缓冲液洗涤磁珠一次。洗涤后，向管中加入一毫升含有 10 毫克 EDAC 的 MES 缓冲液，以活化表面羧基基团。

涡旋混匀管中的珠子。室温下旋转孵育管子15分钟。在2000×g下离心60秒使珠子沉淀。

小心吸取弃去上清液，并用一毫升 PBS 洗涤。涡旋振荡管子以混匀磁珠，再重复 PBS 洗涤一次。从 0.65 毫升罗丹明红-X 储存液中分别制备一倍、10 倍、100 倍和 1000 倍稀释系列，每种稀释度各一毫升。

将20微升珠子移液至每个连续稀释管中。室温下旋转并孵育5分钟。用1毫升PBS洗涤珠子两次。

洗涤后，向各管中加入一毫升 PBS，于四摄氏度保存，最长可保存六周。在用于活体成像的显微镜下观察微珠的荧光强度。用左右手分别握住一支容量为十微升的微毛细管两端。

向微毛细管两端施加拉力，并将毛细管中部置于火焰上加热，以制备两根手工拉制的毛细管。在解剖显微镜下，用镊子修剪手工拉制毛细管的尖端。使两个毛细管尖端开口的大小分别约为C-Elegance胚胎短轴长度的两倍和一倍，用于胚胎转移和卵壳去除。

将拉制好的毛细管连接到口吸管装置上。用移液器吸取45 µL卵盐溶液，滴加到多孔载玻片的一个孔中。将5至10条成年秀丽隐杆线虫（C. elegans）放入该孔中。

为了获得早期的 C. elegans 胚胎，用两根解剖针分别置于 C. elegans 身体左右两侧，将成虫切割成小段。用移液器将 45 微升次氯酸盐溶液加入到邻近含卵盐溶液孔的孔中，并将 45 微升 Shelton 增殖培养基加入接下来的三个孔中。用开口较大的口吸管将单细胞期和早期双细胞期胚胎转移至次氯酸盐溶液中，静置 40 至 55 秒。

用Shelton生长培养基将胚胎转移至接下来的三个孔中进行洗涤，在前两个孔中各停留一到两秒。使用开口较小的手制毛细管，小心地反复吹打胚胎以去除卵壳。

随后，使用手工拉制的毛细管持续吹打，以分离处于二细胞期的胚胎卵裂球。去除卵壳后，应尽量减少上下吹打胚胎的力度，避免胚胎破裂。通过将盖玻片放置在盖玻片支架上，并用胶带固定盖玻片边缘，制备成像腔室。

翻转盖玻片架，用疏水笔在盖玻片上画一个圆圈。在疏水笔所画圆圈内加入谢尔顿生长培养基，并将分离的卵裂球转移至圆圈内的成像室中。接着，使用开口较大的手工拉制毛细管，将少量化学功能化微珠滴加到盖玻片上。

通过向手工拉制的毛细管中吹气来控制微珠的位置，直至微珠附着到分离的卵裂球上。安装盖玻片以避免培养基蒸发，并使用倒置显微镜进行活体成像。在本研究中，用浓度为 0.005 µg/mL 的罗丹明红-X 琥珀酰亚胺酯处理的微珠，在表达 GFP 肌球蛋白-2 和 M-樱桃红组蛋白的转基因品系中产生的荧光信号过弱。

另一方面，用五微克每毫升罗丹明红-X 琥珀酰亚胺酯处理的微珠产生的荧光信号过强。对于该特定转基因品系，罗丹明红-X 琥珀酰亚胺酯的最佳浓度为 0.5 微克每毫升。在活体成像过程中，确定了一个两个中心体呈垂直排列的成像平面。

与此平面成正负90度角的平面即为纺锤体平面。胞质分裂后，纺锤体取向相对于细胞与微珠接触界面的角度显示，两个子细胞均附着于微珠上，且通过两个接触位点的直线被用作接触取向。需要了解胚胎和卵壳如何响应口吸管施加的特定外部作用力。

理论上，任何细胞反应都可以被研究，例如，通过长期培养细胞并与粘附微珠接触，可以研究硫酸盐特异性。该技术已被用于理解依赖接触的细胞分裂方向机制。使用PTF滤膜以防止通过口吸移液管吸入次氯酸盐溶液的蒸气。