Name: Un saggio di escrescenza Neurite e una valutazione della neurotossicità con neuroni derivati dalla cellula del progenitore neurale umano (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-06T15:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: Scopri un saggio di escrescenza neurite per valutare la neurotossicità di piccole molecole utilizzando neuroni derivati da cellule progenitrici neurali umane. Questo metodo offre elevata rilevanza fisiologica per lo screening farmacologico.

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Tutti gli autori non indicano potenziali conflitti di interesse.

Questo protocollo è uno dei pochi articoli pubblicati che descrivono il test per la lunghezza della neurite al trattamento con composti di prova. Inoltre, descriviamo come utilizzare gli hNPC per un saggio di escrescenza di neurite e una valutazione della neurotossicità. Utilizzando questa valutazione di analisi e neurotossicità della neurite e della neurotossicità sui neuroni derivati dagli hNFC, il potenziale neurogenico di una categoria di composti epigenetici di piccole molecole, inibitori HDAC, nell'indurre la cresc...

La crescita di Neurite è un processo fondamentale per la formazione della rete neuronale e la rigenerazione del nervo1,2. A seguito di un infortunio, la crescita dei neuriti svolge un ruolo chiave nella rigenerazione del sistema nervoso. L'escrescenza di Neurite è anche un elemento importante della segnalazione extracellulare nell'indurre attività rigenerative neuronali per migliorare i risultati per disturbi neurodegenerativi e lesioni neuronali3,4,5,6.
Mantenendo il loro potenziale di differenziazione nella produzione di vari lignaggi neurali, le cellule progenitrici neurali umane (hNMC) potrebbero fornire un sistema modello per gli studi sulla funzione del sistema nervoso centrale (CNS) e sullo sviluppo7,8,9. L'elevato potenziale traslazionale e la rilevanza fisiologica degli hNMC come modello primario di cellule umane offrono un notevole vantaggio negli screening di scoperti di farmaci legati alla crescita neurite. Tuttavia, la manutenzione e il ridimensionamento dei modelli cellulari primari per i test ad alto consumo potrebbero richiedere molto tempo e molta mano doperante10,11,12,13.
Oltre all'applicazione del metodo presentato negli studi sulla neurite outgrowth, la valutazione della neurotossicità è un'altra applicazione che utilizza i neuroni derivati dall'hNPC. Ci sono migliaia di composti chimici commerciali che non vengono esaminati o con un potenziale di neurotossicità poco compreso. Pertanto, esperimenti di screening più affidabili ed efficaci per valutare, distinguere e classificare i composti in base al loro potenziale di provocare neurotossicità dello sviluppo è molto richiesto14. L'aumento della prevalenza e dell'incidenza di disturbi neurologici insieme all'abbondanza di composti non testati nell'ambiente richiede lo sviluppo di esperimenti più affidabili ed efficienti per identificare composti ambientali pericolosi che possono rappresentare la neurotossicità15.
Il metodo presentato qui può essere utilizzato per lo screening per la capacità dei composti di indurre neurite ecrescita e neurotossicità sfruttando i neuroni derivati dalla cellula progenitore neurale umano, un modello cellulare che rappresenta da vicino la biologia umana.

<table><tbody><tr><td>Vetrini a camera di vetro a 4 pozzetti</td><td>Sigma</td><td>PEZGS0816</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>R37117</td><td></td></tr><tr><td>Gibco</td><td>antibiotico-antimicotico</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Anti-&beta;-Tubulina III</td><td>Thermo</td><td>MA1-118X</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Thermo</td><td></td><td></td>17504001</tr><tr><td>B27 - meno vitamina A</td><td>Thermo</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>PeproTech</td><td>450-02</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A8531</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo</td><td>Promega</td><td>G7572</td><td></td></tr><tr><td>CoolCell</td><td>Corning</td><td>432000</td><td>Contenitori per il congelamento delle celle che garantiscono una velocità controllata standardizzata -1&#176; C/minuto di congelamento cellulare in un -80&#176; C congelatore</td></tr><tr><td>CryoStor CS10</td><td>StemCell Technologies</td><td>7930</td><td>Terreno di crioconservazione contenente il 10% di DMSO</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>34869-100ML</td><td></td></tr><tr><td></td><td>EGF Gibco</td><td>PHG0311</td><td></td></tr><tr><td>FGF</td><td>Gibco</td><td>PHG6015</td><td></td></tr><tr><td>Formaldeide</td><td>Thermo</td><td>FB002</td><td></td></tr><tr><td>GDNF</td><td>PeproTech</td><td>450-10</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>integratore di L-alanil-L-glutammina</td></tr><tr><td>Siero di capra</td><td>Thermo</td><td>50062Z</td><td></td></tr><tr><td>Eparina</td><td>Calbiochem</td><td>375095</td><td></td></tr><tr><td>Laminina</td><td>Sigma</td><td>L2020-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Acido L-ascorbico</td><td>Sigma</td><td>A92902-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-lisina</td><td>Sigma</td><td>L5501</td><td></td></tr><tr><td>MEM aminoacidi non essenziali</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>mFreSR</td><td>StemCell Technologies</td><td>5854</td><td>Terreno di crioconservazione senza siero progettato per la crioconservazione di cellule staminali embrionali umane e pluripotenti indotte</td></tr><tr><td>N2</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>71376</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 384-Well Polistirene Bianco Micropiastre</td><td>Thermo</td><td>164610</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo</td><td>10010-049</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lisina</td><td>Sigma</td><td>P5899-5MG</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Thermo</td><td>P10144</td><td></td></tr><tr><td>Acido retinoico</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>Sodio azide</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Accutase</td><td>Gibco</td><td>A1110501</td><td>Reagente di dissociazione cellulare contenente enzimi proteolitici e collagenolitici</td></tr><tr><td>Sinaptofisina</td><td>Thermo</td><td>MA5-14532</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Sigma</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr></tbody></table>

un saggio di escrescenza neurite e una valutazione della neurotossicità con neuroni derivati dalla cellula del progenitore neurale umano

A Neurite Outgrowth Assay and Neurotoxicity Assessment with Human Neural Progenitor Cell-Derived Neurons

Neurite analisi di escrescenza e la valutazione della neurotossicità sono due studi principali che possono essere eseguiti utilizzando il metodo presentato qui. Questo protocollo fornisce un'analisi affidabile della morfologia neuronale insieme alle misurazioni quantitative delle modifiche sulla lunghezza dei neuriti e sulla localizzazione delle proteine sinaptiche e sull'abbondanza al trattamento con piccoli composti molecolari. Oltre all'applicazione del metodo presentato negli studi sulla neurite outgrowth, la valutazione della neurotossicità può essere eseguita per valutare, distinguere e classificare i composti chimici commerciali in base al loro potenziale effetto di neurotossicità dello sviluppo.
Anche se le linee cellulari sono oggi ampiamente utilizzate nei saggi di screening composto nelle neuroscienze, spesso differiscono geneticamente e fenotipicamente dalla loro origine tissutale. Le cellule primarie, d'altra parte, mantengono importanti marcatori e funzioni osservate in vivo. Pertanto, a causa del potenziale di traduzione e rilevanza fisiologica che queste cellule potrebbero offrire analisi di crescita neurite e la valutazione della neurotossicità possono notevolmente beneficiare dell'utilizzo di cellule progenitrici neurali umane (hNPC) come modello cellulare umano primario.
Il metodo presentato qui può essere utilizzato per lo screening per la capacità dei composti di indurre la crescita di neurite e neurotossicità sfruttando i neuroni derivati dalla cellula progenitore neurale umano, un modello cellulare che rappresenta da vicino la biologia umana."

Il protocollo presentato nel manoscritto è stato utilizzato con successo in due articoli pubblicati di recente22,23. La figura 3 mostra l'uso di neuroni derivati da hNPC nell'esaminare l'effetto degli inibitori HDAC come composti epigenetici sull'estensione dei neuriti come marcatore per la escrescenza dei neuriti e la successiva capacità neurogenica dei composti molecolari di piccole dimensioni.
Inoltre, ...

Il protocollo presentato descrive un metodo per un saggio di escrescenza neurite e la valutazione della neurotossicità di piccoli composti molecolari.

Un saggio di escrescenza Neurite e una valutazione della neurotossicità con neuroni derivati dalla cellula del progenitore neurale umano

Neurite outgrowth assay and neurotoxicity assessment are two major studies that can be performed using the presented method herein. This protocol provides ...

Il protocollo presentato che descrive il test di crescita della neurite che è altamente rilevante per la biologia umana e la valutazione della neurotossicità di una piccola molecola composti. L'elevato potenziale trasandato e la rilevanza fisiologica delle cellule progenitrici neurali umane come modello primario di cellule umane offrono un notevole vantaggio nello screening della scoperta di farmaci correlato alla crescita della neurite e nella valutazione della neurotossicità. Utilizzando il protocollo presentato, le cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo e i neuroni derivati dalle cellule staminali embrionali umane possono anche essere utilizzati come fonti cellulari alternative per il test di crescita della neurite e la valutazione della neurotossicità.Inizia raccogliendo i media con neurosfere galleggianti e trasferendoli in un tubo conico da 50 millilitri. Centrifugare il tubo da 300 a 400 volte g per tre minuti. Quindi aspirare con cura il supernatante.e rimospendare le sfere in 500 microlitri di reagente di dissociazione cellulare scongelato. Incubare le sfere a 37 gradi Celsius per cinque-15 minuti. Quindi aggiungere da cinque a 10 millilitri di mezzi di coltura p

a-neurite-outgrowth-assay-neurotoxicity-assessment-with-human-neural

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Biologia dello sviluppo

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Un neuronale e astrociti Co-Cultura Assay per l&#39;analisi dei contenuti elevati di neurotossicità

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È fondamentale in neurobiologia e neurovirologia avere un sistema in vitro affidabile e replicabile che funga da modello traslazionale per ciò che avviene in vivo nei neuroni umani. Questo protocollo descrive come coltivare e differenziare le cellule di neuroblastoma umano SH-SY5Y in neuroni vitali per l'uso in applicazioni in vitro.

La differenziazione del SH-SY5Y neuroblastoma umano linea cellulare

Le cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSCs) sono considerate un potente strumento per la screening di droga e chimica e per lo sviluppo di nuovi modelli in vitro per la sperimentazione di tossicità, compresa la neurotossicità. Qui viene descritto un protocollo dettagliato per la differenziazione di hiPSC in neuroni e glia.

Protocollo per la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti indotte dall&#39;uomo in culture miste di neuroni e glia per la sperimentazione della neurotossicità

Neurodevelopmental processi come proliferazione, migrazione e neuriti sono spesso perturbati in malattie neuropsichiatriche. Così, vi presentiamo protocolli per in modo rapido e riproducibile valutare questi processi neurodevelopmental in umano iPSC-derivati NPC. Questi protocolli permettono anche di valutare gli effetti di fattori di crescita e di terapeutica sullo sviluppo di NPC.

Rilevamento rapido dei fenotipi di Neurodevelopmental in cellule precursori neurali umane (NPC)

Questo protocollo descrive una procedura dettagliata per la resuspending e la coltura di neuroni derivati da cellule staminali umane che in precedenza erano differenziati dai progenitori neurali in vitro per più settimane. La procedura facilita i saggi basati sull'imaging di neuriti, sinapsi e marcatori neuronali che esprimono tardivamente in un formato compatibile con la microscopia leggera e lo screening ad alto contenuto.

Replatazione post-differenziazione dei neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti umane per lo screening ad alto contenuto di neuritogenesi e maturazione delle sinapsi

In questa relazione, descriviamo un semplice protocollo per studiare la escrescenza di neurite nei neuroni corticali embrionali del ratto co-traducendo con EGFP e la proteina di interesse.

Un saggio basato sulle proteine con fluorescenza verde potenziato per studiare la crescita neurite nei neuroni primari

Scopri un saggio di escrescenza neurite per valutare la neurotossicità di piccole molecole utilizzando neuroni derivati da cellule progenitrici neurali umane. Questo metodo offre elevata rilevanza fisiologica per lo screening farmacologico.

Un saggio di escrescenza Neurite e una valutazione della neurotossicità con neuroni derivati dalla cellula del progenitore neurale umano (Video) | JoVE Journal

Un saggio di escrescenza Neurite e una valutazione della neurotossicità con neuroni derivati dalla cellula del progenitore neurale umano

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