Name: Consegna intra-arteriosa di cellule staminali neurali al cervello di ratto e topo: applicazione allischemia cerebrale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 53 s
Description: Scopri la consegna intra-arteriosa di cellule staminali neurali nel cervello di ratto e topo per studiare l'ischemia cerebrale. Questo metodo consente la distribuzione mirata delle cellule e il monitoraggio fino a 30 giorni.

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Questa ricerca è stata supportata da quanto segue: AHA Award 14SDG20480186 per LC, Team di innovazione soggetto della Shanxi University of Chinese Medicine 2019-QN07 per La B , e Kentucky Spinal Cord and Head Injury Research Trust concedere 14-12A per KES e LC.

Tutte le procedure su soggetti animali sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università del Kentucky, e sono state prese cure adeguate per ridurre al minimo lo stress o il dolore associato alla chirurgia.
1. Preparazione del catetere per iniezione e ganci chirurgici
<ol><li>Costruire il catetere di iniezione (Figura 1). Raccogliere i materiali necessari tra cui: MRE010, MRE025, e MRE050 tubing, 20 G, 26 G e 27 G aghi di iniezione (Figura 2A), 600 carta vetrata, supercolla e due componenti 5 minuti epossidica.<ol>
<li>Tagliare 20 G e 26 G aghi a 1 cm dal mozzo dell'ago e lucidare l'estremità su carta vetrata (Figura 2B). Sciacquare gli aghi con 10 mL di acqua a doppia distillazione per pulire l'ago. NOTA: vengono utilizzati due progetti diversi (Figura 1). Il design 1 ha un unico connettore e viene utilizzato per l'iniezione di soluzioni o sospensioni. Design 2 ha connettori di blocco 20 G e 26 G Luer per l'iniezione di cellule (20 G ago) e il lavaggio del volume morto (26 G ago) per garantire la consegna dell'intero volume della soluzione contenente NSC.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Disegno 1: Inserire un catetere MRE010 di lunghezza 3-4 cm in un catetere MRE025 di lunghezza 15 cm e fissarlo con supercolla.<ol>
<li>Collegare l'altra estremità del tubo MRE025 a un segmento di catetere MRE050 e fissarlo con supercolla. Inserire un ago opaco da 20 G nella parte restante del catetere MRE050 e fissarlo con supercolla (Figura 1).</li>
		<li>Rafforzare ulteriormente i siti di connessione con colla epossidica. Questo disegno catetere è ottimale per l'iniezione di reagenti (come soluzioni chimiche o farmacologiche o altri farmaci come le citochine).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Disegno 2: Inserire un catetere MRE010 di lunghezza 3-4 cm in un catetere MRE025 di lunghezza 15 cm e fissarlo con supercolla.<ol>
<li>Collegare l'altra estremità del tubo MRE025 a un segmento di catetere MRE050 e fissarlo con supercolla. Inserire un ago opaco da 20 G nella parte restante del catetere MRE050 e fissarlo con supercolla.</li>
		<li>Inserire un ago opaco da 26 G nel tubo MRE050 vicino alla punta del primo ago, seguendo la direzione del flusso di iniezione, e fissarlo con supercolla (Figura 1 e Figura 2C). Rinforzare entrambi gli aghi e il segmento del tubo MRE050 con resina epossidica chiara (Figura 2C). Questo design consente l'iniezione della soluzione del veicolo attraverso l'ago 2 (26 G) dopo l'iniezione NSC attraverso l'ago 1 (20 G) per lavare il volume morto nel catetere nella circolazione cerebrale, ottenendo un controllo più preciso dei volumi di iniezione.</li>
		<li>Utilizzare un ago da 20 G per l'iniezione NSC al fine di ridurre al minimo i danni alle NSC, che potrebbero influire negativamente sulla vitalità.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dopo la costruzione, lavare i cateteri con 10 mL di acqua a doppia distillazione, seguiti dal 70% di etanolo, quindi immergerli nel 70% di etanolo durante la notte.</li>
	<li>Prima dell'intervento, rimuovere i cateteri dal 70% di etanolo e sciacquare con 10 mL di PBS sterile, e metterli in una cassetta degli attrezzi chirurgici autoclalate per lo stoccaggio e il trasporto.</li>
	<li>Preparazione dei ganci chirurgici<ol>
<li>Tagliare un albero dell'ago lungo 1,5- 2 cm da un ago da 27 G, e lucidare entrambe le estremità sulla carta vetrata fino a quando opaco. Quindi utilizzare un piccolo morsetto emostatico per piegare l'albero in un gancio ad un'estremità e una forma ad anello all'altra estremità.</li>
		<li>Inserire un catetere MRE025 lungo 10-15 cm attraverso l'anello e fissarlo con un nastro chirurgico chiaro (Figura 2D). Fare altri 2 ganci utilizzando lo stesso metodo.</li>
		<li>Immergere tutti i ganci e i sistemi di catetere nel 70% di etanolo fino all'uso.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Preparazione animale: consegna, alloggio, adattamento dell'ambiente
<ol><li>In questo studio sono stati utilizzati topi maschi e femmine C57BL/6 (10-12 settimane, n.10/punto tempo) e ratti Wistar (10-12 settimane, n.10).</li>
	<li>Ospitali in un vivaio di animali eco- con cibo e acqua al libitum.</li>
	<li>Lasciare che si adattino all'ambiente almeno 1 settimana prima dell'intervento chirurgico all'ictus. NOTA: Un topo e un ratto sono morti a 1 d dopo un intervento chirurgico di ictus e un topo è stato eutanasia a 3 d post-ictus prima dell'iniezione NSC per motivi umani a causa di grave paralisi.</li>
</ol>3. Coltura di cellule staminali neurali di topo e ratto (NSC)
NOTA: le NSC sono state isolate e coltivate in base a un protocollo stabilito20.
<ol><li>Mouse<ol>
<li>Isolare i topi tipo selvatico (WT) e GFP dalla corteccia embrionale E18 da topi C57BL/6 a tempo di gravidanza accoppiati con topi maschi positivi alla GFP (B6 ACTb-EGFP). Per identificare gli embrioni GFP, osservare gli embrioni raccolti al microscopio a fluorescenza utilizzando il canale FITC. Gli embrioni GFP egenerano un segnale di fluorescenza verde, mentre gli embrioni WT mostrano solo una debole auto-fluorescenza (Figura 3A).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ratto<ol>
<li>Isolare le NSC dalla zona subventriculare (SV) dei ratti WT giovani adulti. Etichettarli con DiI appena prima dell'iniezione seguendo le istruzioni del produttore21.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coltura topo o ratto NSC fino a quando non si sviluppano in neurosfere, e li passaggio quando il diametro della sfera raggiunge circa 100 m (Figura 3B). Utilizzare le NSC per l'iniezione tra i passaggi 3 e 5.</li>
	<li>Verificare le loro proprietà delle cellule staminali utilizzando un pannello marcatore di cellule staminali embrionali (Figura 3C).</li>
	<li>Il giorno dell'iniezione, raccogliere sfere NSC e dissociare con la soluzione di distacco cellulare, sospendere in PBS senza calcio e magnesio a una concentrazione di 107 cellule / mL, e mettere sul ghiaccio bagnato fino all'iniezione.</li>
</ol>4. Preparazione chirurgica
<ol><li>Prima dell'intervento chirurgico, segnare un punto sulla sutura MCAO commerciale con una penna pennarello d'argento a 9 mm (per il mouse) o 15 mm (per il ratto) dalla punta per il riferimento in-surgery di lunghezza di inserimento. Autoclave gli strumenti chirurgici (forbici, pinze) e gli strumenti prima di ogni intervento chirurgico, e il calore li sterilizzano in uno sterilizzatore di perline di vetro tra le operazioni.</li>
	<li>Indurre l'anestesia negli animali con 5% isoflurane per inalazione e mantenere l'anestesia con 1-2% isoflurane. Valutare la profondità dell'anestesia attraverso l'osservazione delle condizioni generali (modello di respirazione, movimento del baffo e postura spontanea di correzione del corpo), riflesso corneale e risposta al pizzico dei piedi.</li>
	<li>Posare le supine degli animali su un pad riscaldante e preparare il sito chirurgico sull'animale tagliando e strofinando con soluzione betadina seguita dal 70% di etanolo. Proteggere gli occhi dell'animale dall'essiccazione applicando unguento oftalmologico (ad esempio, unguento lacrimale artificiale) durante l'intervento chirurgico.</li>
	<li>Chiedi ai chirurghi di pulirsi accuratamente le mani con uno scrub batteriocida e di indossare una maschera, guanti sterili e un camice da laboratorio pulito.</li>
</ol>5. Chirurgia dell'ictus dell'occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAO)
NOTA: Gli interventi chirurgici per indurre ictus ischemico in un emisfero di topo o ratto sono simili in quanto una sutura viene introdotta nell'arteria carotide interna (ICA) al flusso sanguigno occlude (Figura 4)17,18,1919,22. Tuttavia, l'arteria selezionata per l'inserimento della sutura varia in base allo spazio operativo disponibile per la successiva iniezione di cellule staminali. Il ratto ha ampio spazio nel segmento dell'arteria carotide esterna (ECA) per consentire due interventi chirurgici sequenziali separati (corsa e iniezione NSC), ma il mouse non lo fa, richiede un approccio alternativo. I cambiamenti del flusso sanguigno cerebrale indotti dall'ictus, le dimensioni dell'infarto cerebrale e i deficit neurologici sono stati segnalati come nei rapporti precedenti degli autori17,18,19.
<ol><li>Per indurre ictus ischemico, iniziare sia gli interventi chirurgici di topi che ratti con un'incisione mediana sull'area cervicale e l'isolamento dell'arteria carotide comune sinistra (CCA), ECA e ICA (Figura 4). Prestare attenzione a non allungare, sposto o spremere il nervo CCA o vago. Poiché la selezione di arterie e passaggi chirurgici sono diversi in seguito, la chirurgia MCAO sul topo e sul ratto sarà descritta separatamente.</li>
	<li>Chirurgia MCAO su mouse (Figura 4A)<ol>
<li>Posizionare tre suture di nylon 6-0 intrecciate sotto la CCA (Figura 4A, passo 1), e fare un nodo chirurgico stretto per occludere il vaso il più lontano possibile dalla biforcazione utilizzando la stringa prossimale (Figura 4A, passo 2). Tagliare le estremità della sutura.</li>
		<li>Effettuare uno slipknot sul lato distale di CCA (attenzione: non stringere eccessivamente come verrà rilasciato nel passaggio 6) e uno slipnodo sciolto tra i due nodi serrati (Figura 4A, passo 2).</li>
		<li>Tagliare una piccola incisione (1/4 - 1/3 della circonferenza) vicino al nodo prossimale sulla CCA con microscisorri(Figura 4A, passo 3), e inserire con attenzione la sutura di nylon solido 7-0 rivestita in gomma siliconica commerciale(Figura 4A, passo 4). Fissare questa sutura con la corda centrale, stringendo sufficientemente (Figura 4A, passo 5) per garantire nessuna perdita di sangue dall'incisione e nessun movimento del filamento di nylon rivestito in gomma silicone dal backflow da ICA, pur consentendo l'avanzamento della sutura verso la Corte con una leggera spinta da parte delle pinzette.</li>
		<li>Rilasciare il nodo superiore (distale)(Figura 4A,passaggio 6) e far avanzare la sutura di nylon nell'ICA fino a quando la sua punta non passa la biforcazione per 9 mm (utilizzando il pennarello d'argento sulla sutura come riferimento). Stringere i due nodi superiori per fissare la sutura e prevenire il riflusso del sangue.</li>
		<li>Ritirare il filamento 1 h più tardi (Figura 4A, passaggio 7) e sigaro il CCA utilizzando il nodo centrale per evitare il sanguinamento (Figura 4A, passaggi 5-7 in ordine inverso, risultati finali come illustrato nel passaggio 8). Rilasciare il nodo superiore. Chiudere la ferita con sutura chirurgica 4-0.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Chirurgia MCAO su ratto (Figura 4B)<ol>
<li>Posizionare due suture di nylon intrecciate 6-0 sotto la Corte dei conti (Figura 4B, passaggio 1) e fare un nodo stretto all'estremità distale per quanto possibile(Figura 4B, punto 2).</li>
		<li>Posizionare i recipienti sull'ICA e sul CCA per occludono il flusso sanguigno arterioso(Figura 4B, punto 3). Uno slipknot può essere utilizzato come alternativa per una clip di nave.</li>
		<li>Fare una piccola incisione sulla Corte dei conti con microscissors (Figura 4B, passaggi 3-4), inserire un filamento commerciale in gomma siliconica rivestito 6-0 in nylon(Figura 4B, passaggio 5) e fissare correttamente con uno slipknot sulla Corte.</li>
		<li>Rilasciare la clip della nave sull'ICA, far avanzare il filamento nell'ICA fino a quando il marcatore d'argento (15 mm) raggiunge la biforcazione (Figura 4B, passaggio 6), quindi fissare la sutura con il nodo 2nd sulla Corte dei conti (Figura 4B, passaggio 6).</li>
		<li>Dopo 1 h di ischemia, ritirare questo filamento e sigaro l'incisione per prevenire il sanguinamento (Figura 4B, passaggio 7), rimuovere la clip del vaso dalla CCA (risultato finale come nel passaggio 8), e chiudere la ferita con sutura chirurgica 4-0.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Recupero
<ol><li>Dopo l'intervento chirurgico all'ictus, posizionare gli animali su un pad di riscaldamento fino a quando non riacquistano completamente coscienza.</li>
	<li>Fornire analgesia tramite iniezione sottocutanea. Riporta gli animali alle loro gabbie di casa con accesso all'acqua e al cibo al libitum.</li>
</ol>7. Iniezione intra-arteriale
<ol><li>Lavare l'intero catetere con il 70% di etanolo e immergerlo durante la notte fino all'uso. Subito prima dell'iniezione, collegare la serratura Luer dell'ago con una siringa sterile e lavare l'intero lato lumen del sistema catetere con 10 mL di PBS sterile.</li>
	<li>Intervallo di tempo e preparazione per l'iniezione NSC NOTA: Sulla base dell'esperienza e dei rapporti di altri team di ricerca, i tempi per l'iniezione di NSC sono cruciali per la sopravvivenza sia dei soggetti che delle NSC esogene. Nel nostro studio pilota, l'iniezione di NSC nei primi tempi (entro i primi 6 h dopo la riperfusione) ha portato a una maggiore mortalità. Così, abbiamo testato i punti temporali di iniezione successiva e determinato l'intervallo di tempo tra 2 d (48 h) a 3 d (72 h) dopo l'ictus è sicuro e tollerabile per gli animali, ed è efficiente nel raggiungere la distribuzione intraarenschicilica delle NSC. I risultati presentati qui sono da animali ricevuti iniezione NSC a 3 d dopo infortunio.<ol>
<li>Impostare la velocità di iniezione della pompa della siringa a 20 gradi l/min per i topi e 50 l/min per i ratti. Una velocità eccessiva o la durata dell'iniezione può causare un sovraccarico di volume sistemico, a cui i topi sono più vulnerabili dei ratti.</li>
		<li>In breve, a 3 d dopo un intervento chirurgico di ictus, anestesizzare gli animali con isoflurane e deporli supina su un pad di riscaldamento.</li>
		<li>Riaprire la ferita cervicale ed esporre nuovamente la Corte dei conti, l'ICA e la CCA (Figura 5, passaggio 1). Come negli interventi chirurgici di ictus, determinare il percorso di iniezione in base alla specie. Utilizzare la CCA per l'iniezione NSC nel mouse, e la ECA per il ratto23.</li>
	</ol></li>
	<li>Iniezione intra-arteriosa attraverso la CCA nel topo<ol>
<li>Mettere due suture di nylon intrecciate 6-0 sotto la CCA. Creare un slipnodo sciolto con ciascuno di essi tra la biforcazione e i nodi inferiori della precedente operazione chirurgica dell'ictus (Figura 5, passo 2).</li>
		<li>Stringere il nodo superiore e quindi fare una piccola incisione sopra il nodo inferiore (Figura 5, passo 3). Inserire un catetere MRE010 tramite l'incisione (Figura 5, passaggio 4) e proteggere con il nodo centrale senza bloccare il flusso di iniezione (Figura 5, passaggio 5). Il riflusso del sangue deve essere visibile nel catetere quando si rilascia il nodo superiore e si regola la posizione del catetere.</li>
		<li>Posizionare una clip della nave sulla Corte dei conti, iniettare 1 x 106 GFP-NSC attraverso questo catetere a 20 l/min per 5 min con una pompa di siringa, seguita da uno sciacquone con 50-100 gradi di PBS alla stessa velocità.</li>
		<li>Dopo l'iniezione, legate il CCA sopra l'incisione con il nodo superiore dello slittamento e ritirate il catetere MRE010 (Figura 5, passo 6). Stringere e tagliare il nodo centrale e il nodo superiore. Rimuovere la clip della nave dalla Corte dei conti. Fare riferimento all'immagine finale nella Figura 5, passaggio 7.</li>
		<li>Chiudere la ferita con sutura chirurgica 4-0.</li>
		<li>Dopo aver fornito un adeguato recupero su un cuscinetto di riscaldamento e un'iniezione analgesica sottocutanea, riportare gli animali nella loro gabbia di casa.</li>
	</ol></li>
	<li>Iniezione intra-arteriosa attraverso la Corte dei conti nel ratto<ol>
<li>Occludono temporaneamente la Corte dei conti e il CCA con le clip delle navi (Figura 5, passo 2).</li>
		<li>Fare una piccola incisione sul lato prossimale di ECA (Figura 5, passaggio 3), inserire il catetere MRE010 e fissare con un nodo (Figura 5, passo 4).</li>
		<li>Rimuovere entrambe le clip del recipiente, iniettare 5 x 106 NSC in 100 L di PBS a 50 gradi centigradi/min per 2 min, seguito da un filo con 50-100 L di PBS (Figura 5, punto 5) alla stessa velocità, utilizzando una pompa di siringa motorizzata.</li>
		<li>Dopo l'iniezione, occludere la CCA e la ECA con le clip delle navi e legarla sul lato prossimale del secondo dopo il ritiro del catetere diiniezione( Figura 5 , passo 6).</li>
		<li>Rimuovere le due clip della nave (Figura 5, passo 7) e chiudere la ferita con sutura chirurgica 4-0.</li>
		<li>Dopo aver fornito un adeguato recupero su un cuscinetto di riscaldamento e un'iniezione analgesica sottocutanea, riportare gli animali nella loro gabbia di casa.</li>
	</ol></li>
	<li>Saggio istologico<ol>
<li>Raccogliere cervelli da topi e ratti che hanno ricevuto ictus ischemico seguito da iniezione di NSC o soluzione veicolo dopo eutanasia e perfusione intracardiaca con 4% paraformaldeide a 1 d (topo e ratto), 7 d (topo) e 30 d (topo) dopo l'iniezione. Ognuno di questi quattro gruppi era composto da 5 NSC e 5 animali iniettati da veicoli.</li>
		<li>Fissare i cervelli durante la notte e criopreserve in 30% saccarosio per 3 d.</li>
		<li>Incorporare i cervelli nello OCT, tagliare con spessore di 40 m ed esaminare la distribuzione delle NSC dopo l'immunostaining con marcatori specifici delle cellule, tra cui proteine acidiche fibrillari gliali (GFAP, astrociti), Tuj1 (neuroni maturi) e doppiacortina (DCX, neuroni immaturi). NOTA: a causa della mancanza di un ceppo di ratto che esprime GFP, abbiamo utilizzato DiI, un'etichetta fluorescente transitoria, per le NSC per ratti, che consente solo un'osservazione relativamente breve. Quindi, la distribuzione NSC è stata esaminata solo a 1 d dopo ictus nei ratti.</li>
	</ol></li>
</ol>

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La terapia con cellule staminali per le malattie neurologiche è ancora in una fase esplorativa precoce. Un problema importante è che non esiste un metodo stabilito per la consegna sufficiente di SC o NSC nel cervello.
Anche se sC/NSC esogeni possono essere rilevati nel cervello dopo per via endovenosa (IV), intraperitoneale (IP) o iniezione intraarenchymal/intracerebrale, ogni approccio di consegna ha drawbacks. Si stima che la popolazione rilevabile all'interno del cervello sia molto bassa co...

La terapia con cellule staminali (SC) ha un enorme potenziale come trattamento per malattie neurologiche, tra cui ictus, trauma cranico e demenza1,2,3,4,5,6. Tuttavia, un metodo efficiente per fornire SC esogeni al cervello malato rimane problematico2,6,7,8,9,10,11,12,13.6 Le SC consegnate attraverso percorsi di consegna periferici, tra cui l'iniezione endovevenosa (IV) o intraperitoneale (IP), sono soggette a filtraggio del primo passaggio nella microcircolazione, soprattutto nei polmoni, nel fegato, nella milza e nel muscolo8,9,13,14, aumentando le probabilità di accumulo di cellule in aree non bersaglio. Il metodo invasivo di iniezione intracerebrale si traduce in danni ai tessuti cerebrali localizzati e una distribuzione molto limitata di SC vicino al sito di iniezione2,6,8,14,15,16. Recentemente abbiamo stabilito un metodo di iniezione intra-arterioso basato su catetere per fornire SC neurali esogeni (NSC), che è descritto qui applicato in un modello di roditore di ictus ischemico focale. Induciamo una lesione transiente (1 h) ischemia-reperfusione in un emisfero utilizzando un filamento rivestito in gomma di silicone per occludere l'arteria cerebrale centrale sinistra (MCA) nel topo o ratto17,18,19. In questo modello abbiamo osservato in modo riproducibile circa il 75-85% di depressione del flusso sanguigno cerebrale (CBF) nell'emisfero ipsilaterale con Laser Doppler o Laser speckle imaging17,19, producendo deficit neurologici coerenti17,18,19.
Per risparmiare tempo, il video è impostato per giocare a velocità normale e procedure chirurgiche di routine come la preparazione della pelle e la chiusura della ferita con sutura e l'uso e la configurazione della pompa siringa motorizzata non sono presentati. Il metodo di somministrazione intra-arteriale delle NSC è dimostrato nel contesto del modello di occlusione dell'arteria cerebrale centrale (MCAO) di ictus sperimentale nei roditori. Pertanto, includiamo la procedura di ictus ischemico transitorio al fine di dimostrare in seguito come il secondo intervento chirurgico, l'iniezione intra-arteriale, viene eseguita utilizzando il sito chirurgico precedente sullo stesso animale. La fattibilità della distribuzione intra-arteriale di NSC nei modelli di corsa dei roditori è dimostrata valutando la distribuzione e la sopravvivenza delle NSC esogene. L'efficacia della terapia NSC per attenuare la patologia cerebrale e la disfunzione neurologica sarà riportata separatamente.

<table><tbody><tr><td>20 g di ago</td><td>Becton & Dickinson</td><td>BD PrecisionGlide 305175</td><td>preparazione del catetere per iniezione</td></tr> ago <tr><td>da 26 G</td><td>Becton & Dickinson</td><td>BD PrecisionGlide 305111</td><td>preparazione del catetere per iniezione</td></tr> ago <tr><td>da 27 G</td><td>Becton & Dickinson</td><td>BD PrecisionGlide 305136</td><td>preparazione del catetere per iniezione</td></tr><tr><td>sutura 4-0 NFS-2 con ago</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>56905</td><td></td></tr><tr><td>chirurgia 6-0 sutura in nylon</td><td>Teleflex/Braintree Scientific</td><td>104-s</td><td>chirurgia</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7922</td> lama <td>per soluzione di distacco cellulare</td></tr><tr><td></td><td>Bard-Parker</td><td>10</td><td>chirurgia</td></tr><tr><td>Buprenorfina-SR Lab</td><td>ZooPharm</td><td>Buprenorfina-SR Lab&reg;</td><td>analgesia (0,6-1 mg/kg oltre 3 giorni)</td></tr><tr><td>PBS VWR</td><td></td><td>02-0119-0500</td><td>NSC dissociazione</td></tr><tr><td>DCX anticorpo</td><td>Millipore</td><td>AB2253</td><td></td></tr><tr><td>immunocolorazione GFAP anticorpo</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>180063 immunocolorazione</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>50562-1</td><td></td></tr><tr><td>chirurgia MCAO per topo</td><td>Doccol</td><td>702223PK5Re</td><td>chirurgia</td></tr><tr><td>Filamento MCAO per ratto</td><td>Doccol</td><td>503334PK5Re</td><td></td></tr><tr><td>chirurgia Catetere MRE010</td><td>Braintree Scientific</td><td>MRE010</td><td>preparazione del catetere per iniezione</td></tr><tr><td>Catetere MRE025</td><td>Braintree Scientific</td><td>MRE025</td><td>preparazione del catetere per iniezione</td></tr><tr><td>Catetere MRE050</td><td>Braintree Scientific</td><td>MRE050</td><td>preparazione del catetere per iniezione</td></tr><tr><td>Nu-Tears Unguento</td><td>NuLife Pharmaceuticals</td><td>Nu-Tears Unguento</td><td>cura degli occhi durante l'intervento chirurgico</td></tr><tr><td>S& Pinze a T - Punte SuperGrip JF-5TC Strumenti angolati</td><td>per scienze fini</td><td>00649-11</td><td></td></tr><tr><td>chirurgia S & Pinze a T - Punte SuperGrip JF-5TC Dritto</td><td>Strumenti di Fine Science</td><td>00632-11</td><td>chirurgia</td></tr><tr><td>Supercolla</td><td>Pacer Technology</td><td>15187</td><td>preparazione della pompa a siringa del catetere per iniezione</td></tr><tr><td></td><td>Kent Scientific</td><td>Chirurgia GenieTouch</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Tuj1</td><td>Millipore</td><td>MAb1637</td><td>immunocolorazione</td></tr><tr><td>bicomponente 5 minuti epossidica</td><td>Devcon</td><td>20445</td><td>preparazione del catetere per iniezione</td></tr><tr><td>Forbici a molla Vannas</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>morsetti vascolari</td> chirurgici <td>Fine Science Tools</td><td>00400-03</td><td>chirurgia</td></tr><tr><td>Microscopio Zeiss</td><td>Microscopia Zeiss</td><td>Axio Imager 2</td><td></td></tr></tbody></table> microscopia

consegna intra-arteriosa di cellule staminali neurali al cervello di ratto e topo: applicazione all'ischemia cerebrale

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

La terapia con cellule staminali neurali (NSC) è un trattamento innovativo emergente per ictus, lesioni cerebrali traumatiche e disturbi neurodegenerativi. Rispetto alla consegna intracranica, la somministrazione intra-arteriosa delle NSC è meno invasiva e produce una distribuzione più diffusa delle NSC all'interno del parenchyma cerebrale. Inoltre, la somministrazione intra-arteriosa consente l'effetto del primo passaggio nella circolazione cerebrale, dimezzando il potenziale di intrappolamento delle cellule negli organi periferici, come il fegato e la milza, una complicazione associata alle iniezioni periferiche. Qui, dettagliamo la metodologia, sia nei topi che nei ratti, per la consegna delle NSC attraverso l'arteria carotide comune (topo) o l'arteria carotide esterna (ratto) all'emisfero ipsilaterale dopo un ictus ischemico. Utilizzando NSC con etichetta tramite GFP, illustriamo la distribuzione diffusa ottenuta in tutto l'emisfero roditore ipsilaterale a 1 d, 1 settimana e 4 settimane dopo la consegna postischemica, con una maggiore densità all'interno o vicino al sito di lesioni ischemiche. Oltre alla sopravvivenza a lungo termine, dimostriamo di differenziare le cellule etichettate con GFP a 4 settimane. L'approccio di consegna intra-arteriosa descritto qui per le NSC può essere utilizzato anche per la somministrazione di composti terapeutici, e quindi ha un'ampia applicabilità a vari modelli di lesioni e malattie del SNC in più specie.

Le NSC etichettate GFP sono state prontamente rilevate nel cervello ischemico, per lo più nell'emisfero ipsilaterale, specialmente nella penombra e lungo il bordo delle lesioni (Figura 6). L'esaminatore è stato singolo-cieco durante l'imaging e l'analisi.
Ad esempio, a 1 d dopo l'iniezione, le NSC sono state rilevate all'interno dell'ippocampo del topo. Un sottoinsieme di NSC ha mostrato la co-espressione del marcatore neuronale immaturo DCX nel giro dentato anche...

Un metodo per la fornitura di cellule staminali neurali, adattabile per l'iniezione di soluzioni o sospensioni, attraverso l'arteria carotide comune (mouse) o l'arteria carotide esterna (ratto) dopo ictus ischemico è segnalato. Le cellule iniettate sono distribuite ampiamente in tutto il parenchyma cerebrale e possono essere rilevate fino a 30 d dopo la consegna.

Consegna intra-arteriosa di cellule staminali neurali al cervello di ratto e topo: applicazione all'ischemia cerebrale

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

L'ictus è la principale causa di mortalità e disabilità in tutto il mondo. Sebbene la trombolisi e la rimozione chirurgica dell'occlusione vascolare cerebrale possano essere eseguite in pazienti selezionati, vi è ancora l'urgente necessità di terapie efficaci contro l'ictus. Qui, dimostriamo un'erogazione intra-arteriosa a base di catetere di cellule staminali nell'emisfero ischemico come potenziale regime per la terapia dell'ictus.In primo luogo, introduciamo come preparare il catetere a iniezione e i ganci chirurgici. Abbiamo progettato due tipi di cateteri di iniezione per iniezione intra-arteriosa. Il progetto uno viene utilizzato per l'iniezione di una soluzione o sospensione che non richiede il lavaggio del tubo.La progettazione due consente l'iniezione di cellule staminali neurali, seguita da uno scarico del volume morto per fornire l'intero volume. Per costruire un set di cateteri di iniezione, avrai bisogno di aghi calibro 26 e calibro 20, una lunghezza da 10 a 15 centimetri di catetere MRE 25 e una lunghezza di tre centimetri di cateteri MRE 50 e MRE 10. Tagliare entrambe le punte dell'ago e lucidare l'estremità metallica su carta vetrata per riaprire il tubo e lisciare i bordi e quindi lavare con acqua distillata per pulire il foro e lavare via i detriti.La figura mostra un'estremità chiusa di un ago calibro 20 dopo aver ritagliato la punta dell'ago, che viene riaperta con un foro liscio dopo la lucidatura. Al microscopio, inserire l'ago calibro 20 all'estremità del tubo MRE 50. Piegare l'ago calibro 26 e quindi penetrare nel tubo sotto l'estremità della punta dell'ago calibro 20.Fissare l'ago calibro 26 con super colla. Quindi incorporare i due mozzi dell'ago e i tubi ed epossidici per costruire un blocco solido per migliorare la resistenza. Avrai anche bisogno di tre ganci chirurgici per tenere il tessuto in posizione per una migliore esposizione dei siti chirurgici.Tagliare un albero dell'ago lungo da uno e mezzo a due centimetri da un ago calibro 27 e lucidare entrambe le estremità su carta vetrata fino a quando non sono opache. Utilizzare un piccolo morsetto emostatico per piegare l'albero in un gancio ad un'estremità e a forma di anello all'altra estremità. Inserire un catetere MRE 25 lungo da 10 a 15 centimetri attraverso l'anello e fissare con nastro chirurgico chiaro.Crea altri due hook usando lo stesso metodo. I ganci e il sistema di catetere dovrebbero essere immersi durante la notte in etanolo al settanta per cento per la sterilizzazione. Tutte le procedure riguardanti materie animali sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee dell'Università del Kentucky.Usiamo il cervello del topo embrionale ENT per coltura della GFP, cellule staminali neurali positive. Gli embrioni positivi alla GFP possono essere facilmente visualizzati nel canale FITC su un microscopio fluorescente. Mentre gli embrioni di tipo selvatico non mostrano fluorescenza usando la stessa esposizione.L'autofluorescenza degli embrioni di tipo selvatico è visibile solo quando il tempo di esposizione è aumentato 100 volte. La corteccia embrionale viene raccolta e utilizzata per stabilire colture di cellule staminali neurali seguendo il protocollo del produttore. Queste cellule staminali neurali possono formare neurosfere e possono passare per 10 generazioni e possono differenziarsi in glia sono neuroni.Pannelli di marcatori di cellule staminali embrionali come nanog, SSEA1, Oct4 e Sox3 possono essere utilizzati per identificare le proprietà delle cellule staminali mentre si trova nelle neurosfere. Le neurosfere sono state coltivate nei media, seguendo il protocollo del produttore e l'uso tra i passaggi tre e cinque per la consegna di cellule staminali neurali. L'ictus ischemico è stato indotto nell'emisfero sinistro sia per topi che per ratti, usando un'occlusione dell'arteria cerebrale media a base di filamento, MCAO con alcune modifiche a seconda della specie.Nei topi, il filamento viene inserito attraverso la comune arteria carotide, CCA e avanzato nell'arteria carotide interna, ICA. Mentre è nei ratti, il filamento viene introdotto attraverso l'arteria carotide esterna, ECA nell'ICA a causa del più ampio spazio di lavoro. Qui dimostriamo l'intervento al topo.Dopo aver fatto un'incisione della linea mediana lungo il collo, separare i tessuti sottostanti usando la dissezione smussata. Utilizzare i tre ganci microchirurgici realizzati con alberi ad ago calibro 27 per ottenere un campo visivo migliore. Il quadrato nero indica l'area chirurgica per il passaggio successivo.Lo strato muscolare sopra il CCA sinistro è accuratamente aperto per esporre il CCA sinistro e il nervo vago. Seguire il CCA fino a raggiungere e identificare la biforcazione. Si deve prestare attenzione a non allungare, spostare o spremere questo nervo CCA o vago.Aprire con cura il tessuto connettivo chiaro, coprendo il CCA e il nervo vago. Liberare lo spazio sotto questo CCA con una punta delle forcep e isolare il più possibile lo stelo CCA. Infilare una sutura chirurgica in nylon intrecciato a sei o intrecciati sotto il CCA.Tagliare il punto centrale per lasciare alle suture sottostanti il CCA. Posizionare un'altra sutura di nylon sotto il CCA. Legare uno slipknot sulla sutura superiore, tenendolo libero.Separare le due suture inferiori. Legare un nodo di slittamento con la sutura centrale, mantenendola sciolta per ora. Legare il nodo di un chirurgo con una sutura inferiore e spostarlo all'estremità prossimale il più lontano possibile.Tagliare le estremità della sutura. Esporre ulteriormente il CCA oltre la biforcazione. Spingere lo slipknot sciolto superiore alla biforcazione e stringerlo per evitare il riflusso di sangue.Posare la sutura MCAO in nylon 70 rivestita in gomma di silicio accanto alla CCA. Usando micro forbici, tagliare una piccola incisione sul CCA, accanto al nodo inferiore. Inserire la punta della sutura MCAO nel CCA attraverso questa incisione e avanzare verso il nodo superiore.Regolare la posizione del nodo centrale e stringerlo fino a quando non può mantenere la sutura MCAO in posizione. Non stringere eccessivamente il nodo. Rilasciare il nodo superiore, ma fare un altro nodo di slittamento sciolto nella stessa posizione.Far avanzare la sutura MCAO nell'ICA. Confermare che la sutura MCAO passa la biforcazione nell'ICA. Il percorso della sutura dovrebbe essere relativamente dritto, entrando più in profondità nel tessuto mentre avanza.Controlla il pennarello d'argento all'estremità della sutura. Assicurarsi che raggiunga la biforcazione. Controllare di nuovo la direzione della sutura MCAO.Regolare i nodi superiore e centrale per evitare perdite di sangue. Avanzare ulteriormente la sutura MCAO, stringere i due nodi superiori per fissare la sutura MCAO in posizione. Inizia a registrare il tempo per un'ora di ischemia.Dopo un'ora di ischemia, anestetizziamo l'animale e riapriamo la ferita della pelle. Esponi l'area chirurgica. Individuare gli slipknot superiori e medi.Rilasciare delicatamente il nodo superiore. Estrarre delicatamente la sutura MCAO fino a quando la parte in gomma siliconica bianca raggiunge il nodo centrale. Stringere il nodo superiore per mantenere la sutura MCAO in posizione per evitare sanguinamenti.Rilasciare delicatamente lo slipknot centrale. Estrarre la sutura MCAO fino a quando la sua estremità non passa il nodo superiore. Stringere il nodo superiore.Posizionare lo slipknot centrale proprio sopra l'incisione sul CCA. Stringi lo slipknot centrale. Rimuovere il nodo superiore.Tagliare le estremità della sutura del nodo centrale. Chiudi la ferita della pelle e lascia che l'animale si riprenda. Sulla base della nostra esperienza, le cellule staminali neurali iniettate in modo sicuro attraverso questa via arteriosa tra uno e tre giorni dopo l'ictus.Ancora una volta, ci sono piccole variazioni tra gli interventi chirurgici del topo e del ratto per l'iniezione di cellule staminali neurali. E qui dimostriamo l'intervento al topo. Il terzo giorno post-ictus, anestetizza l'animale, riapre la ferita e risporse il CCA.Posare una sutura chirurgica a doppio filamento sotto il CCA e tagliarla al punto centrale per ottenere due suture. Posizionare correttamente le due suture. Fai uno slipknot con la sutura superiore.Posizionarlo proprio sotto la biforcazione. Stringi lo slipknot superiore. Fai un altro slipknot con la sutura centrale.Tagliare una piccola incisione proprio sopra il nodo tagliato rimanente dall'intervento chirurgico all'ictus. Tagliare la punta del catetere MRE 10 con un angolo di circa 45 gradi. Utilizzare questa estremità affilata per inserire l'incisione sul CCA.Fare attenzione a regolare correttamente l'angolo di entrata e la forza utilizzata per inserire il catetere. In caso contrario, il catetere potrebbe non entrare nel CCA o perforarlo. Inserire il catetere e avanzare fino a quando la punta raggiunge il nodo superiore.Stringere lo slipknot centrale per tenere il catetere in posizione e assicurarsi che non vi sia alcun legame sanguigno. Rilasciare il nodo superiore. Fai un nodo di slittamento con la sutura superiore.Regolare l'angolo del catetere all'interno del CCA e le posizioni di entrambi i nodi fino a quando non è visibile un rapido riflusso di sangue, indicando una comunicazione riuscita tra il catetere e il flusso CCA. Avviare la pompa della siringa. Il sangue nel catetere verrà riportato nel CCA.Terminare l'iniezione dopo cinque minuti. Ligate il nodo superiore. Rilasciare il nodo centrale e ritirare il catetere.Ligate il nodo centrale. Tagliare tutti i nodi. Chiudi la ferita e lascia che l'animale si riprenda.Dopo l'iniezione intra-arteriosa, le cellule staminali neurali etichettate GFP si trovano principalmente nell'emisfero ipsilaterale. Qui, mostriamo la distribuzione nel giro dentato ippocampale un giorno dopo l'iniezione. Nell'emisfero ipsilaterale, alcune delle cellule staminali neurali positive del GFP localizzate nella corteccia e nello striato, esprimono il doppio cort, un marcatore dei neuroni immaturi.Queste sono immagini rappresentative di animali finti e accarezzati con o senza iniezione di cellule staminali neurali a sette giorni dall'iniezione. A 30 giorni dalla consegna, è possibile rilevare solo una piccola fluorescenza automatica attraverso il canale FITC negli animali che ricevono l'iniezione del veicolo. Mentre nelle cellule staminali iniettate animali, le cellule staminali neurali etichettate GFP possono essere trovate nel cervello ferito con espressione di vari marcatori cellulari come il marcatore gleo GFP o il marcatore neuronale tujuan.Le frecce bianche in ogni immagine indicano cellule staminali neurali che esprimono rispettivamente marcatori GFP o tujuan. In conclusione, l'iniezione intra-arteriosa è un metodo fattibile per la somministrazione di cellule staminali neurali per la terapia dell'ictus. Le cellule staminali neurali possono sopravvivere e differenziarsi in diversi tipi di cellule all'interno del cervello ferito.E infine, il metodo di iniezione intra-arteriosa qui introdotto può essere utilizzato anche per la consegna di soluzioni e sospensioni.

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