Un modello preclinico di impatto corticale controllato per emorragia traumatica, contusione e neuroinfiammazione

L'emorragia intraparenchimale e la neuroinfiammazione accompagnate da contusione cerebrale possono innescare gravi lesioni cerebrali secondarie. Questo protocollo descrive in dettaglio un modello di impatto corticale controllato (CCI) sui topi, che consente ai ricercatori di studiare l'emorragia, la contusione e le risposte immunitarie post-traumatiche ed esplorare potenziali terapie.

Questo modello può essere utilizzato per studiare le patologie associate alla contusione cerebrale, tra cui l'emorragia intracranica, la tossicità del ferro, la morte dei neuroni, il danno assonale, il deficit neurologico e l'infiammazione neurale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che la gravità del danno cerebrale può essere facilmente controllata manipolando i parametri biochimici come la velocità e la morte dell'impatto sul dispositivo CCI. La lesione da frantumazione corticale focale indotta da CCI è altamente riproducibile.

Una corretta tecnica stereotassica e la procedura di craniotomia sono i principali fattori determinanti nella produzione di una lesione cerebrale indotta da CCI stabile e riproducibile. In generale, lo sperimentatore nuovo alla procedura avrà difficoltà a stabilizzare il topo sul telaio steriotexico e ad eseguire la craniotomia appropriata. A dimostrare la procedura sarà la signora Jhih Shuan Lin, un tecnico di laboratorio del mio laboratorio.

Inizia confermando la mancanza di riflesso di pizzicamento dell'alluce nell'animale per assicurarti che sia adeguatamente anestetizzato. Radere la testa del topo con un tagliacapelli elettrico in direzione da caudale a rostrale. Ma non tagliare i baffi.

Posiziona il mouse sul telaio stereotassico e inserisci con cura le barre auricolari nei canali uditivi, assicurandoti che la testa del mouse sia stabilizzata da entrambe le barre auricolari allo stesso modo. Mantenere l'anestesia all'uno al 2% di isoflurano per tutta la durata dell'intervento chirurgico. Applicare vaselina su entrambi gli occhi per evitare che si secchi durante l'intervento.

Quindi utilizzare tamponi di cotone sterili per disinfettare la testa rasata con betadina seguita da etanolo al 70%. Somministrare 100 microlitri di bupivacaina allo 0,25% per via sottocutanea con un ago da insulina calibro 31 e massaggiare delicatamente il sito di iniezione per un migliore assorbimento. Praticare un'incisione longitudinale lungo la linea mediana del cuoio capelluto con un bisturi o delle forbici.

Quindi usa un emostatico per estrarre la pelle sul lato destro. Lasciare asciugare il cranio esposto per un minuto. Quindi pulire eventuali residui di sangue e tessuti sul cranio con un batuffolo di cotone sterile.

Verificare che la testa dell'animale sia a livello sul piano orizzontale e individuare i punti di riferimento anatomici, Bregma e Lambda, segnando entrambe le posizioni con una matita. Assicurarsi che la testa dell'animale sia a livello in direzione rostrale-caudale misurando le coordinate Z sia di Bregma che di Lambda. Utilizzare la stessa procedura per posizionare orizzontalmente la testa.

Utilizzare un ago da insulina calibro 31 per identificare il sito della craniectomia. Imposta l'origine XY su Bregma e sposta lateralmente l'ago di tre millimetri a destra. Segna questa posizione come sito di craniectomia e disegna un cerchio di quattro millimetri di diametro sul cranio con una matita.

Tagliare lungo il cerchio delineato a matita con un micro trapano ad alta velocità con la trepina per creare un foro aperto di quattro millimetri di diametro. Rimuovere il lembo osseo con una pinzetta e conservarlo in soluzione salina normale ghiacciata. Sciacquare delicatamente il foro con soluzione fisiologica prima di applicare pressione sulla superficie del cervello per fermare l'emorragia.

Sul dispositivo CCI, impostare la punta arrotondata dell'impattatore di 2,5 millimetri di diametro su un angolo di 22,5 gradi. Azzerare la punta dell'impatto sulla superficie durale e impostare i parametri di impatto sulla scatola di controllo su una velocità di quattro metri al secondo e una profondità di deformazione di due millimetri. Ritrarre la punta metallica.

Scaricare il pistone per generare un impatto sul cervello. Quindi posizionare un batuffolo di cotone sterile sulla zona lesa per fermare l'emorragia. Sostituire il lembo osseo e fissarlo con cemento dentale.

Chiudere il cuoio capelluto con un adesivo per tessuti. Posiziona il mouse sotto la lampada riscaldante in una gabbia di recupero pulita con lettiera fino al completo recupero. Una corretta tecnica stereotassica e la procedura di craniectomia sono i principali determinanti nella produzione di lesioni cerebrali indotte da CCI stabili e riproducibili.

Una procedura di craniectomia ideale causerebbe una lesione istologica minima nel cervello finto. Cambiamenti nel danno cerebrale e nella perdita del corpo calloso sono stati osservati ai giorni 1, 3, 7 e 28 dopo la CCI. Inoltre, l'atrofia cerebrale unilaterale sul lato della contusione è stata osservata il giorno 28 dopo la CCI.

La neuroinfiammazione è stata rivelata dall'attivazione della microglia Iba1-positiva e dall'accumulo di macrofagi attorno al bordo dell'area della contusione. L'emorragia intraparenchimale è stata rilevabile anche dalla colorazione Ly76-positiva dal primo al settimo giorno dopo la CCI. Una miscela di globuli rossi con morfologia cellulare rotta e intatta è stata osservata al settimo giorno dopo la CCI, suggerendo che i globuli rossi sono stati lisati in questa fase.

Questo fenomeno era coerente con l'osservazione che la deposizione di ferro ferrico era rilevabile nella regione della contusione dal settimo al 28° giorno dopo la CCI. Microglia e macrofagi attivati sono stati osservati nello striato lontano dal sito della contusione dal terzo al 28° giorno dopo la CCI, indicando lesioni del corpo calloso e dello striatale. Questa tecnica apre la strada allo sperimentatore per esplorare ulteriormente l'interazione della neuroinfiammazione indotta dall'emorragia cerebrale attraverso la comprensione della risposta delle cellule immunitarie, come la microglia, dopo la contusione dell'emorragia.