Applicazioni di immobilizzazione dei tessuti Drosophila con coaguli di fibrina per l'imaging dal vivo

Questo protocollo descriveva l'immobilizzazione del campione utilizzando coaguli di fibrina. I campioni vengono trasferiti in una goccia di fibrinogeno contenente terreno di coltura sulla superficie di un vetrino coprioggetti, dopodiché la polimerizzazione viene indotta mediante l'aggiunta di trombina. Sotto un microscopio da dissezione, utilizzare un pennello per trasferire le larve L3 in un piatto di vetro borosilicato a nove pozzetti contenente PBS.

Mescolare per staccare la maggior parte del cibo per mosche dalle larve e trasferirlo in un altro pozzetto contenente terreno di coltura. Usa una pinza per afferrare una larva per tutto il suo diametro al centro della sua lunghezza corporea e trasferiscila in un altro pozzetto della piastra borosilicata contenente 200 microlitri di terreno di coltura fresco. Non rilasciare la larva.

Per tagliare la larva a metà per tutto il suo diametro, macinare l'area afferrata con il movimento laterale delle punte delle pinze, oppure far scorrere una punta di un altro paio di pinze tra le due punte delle pinze che tengono la larva. Usa la pinza per tenere la larva per la cuticola e un altro paio di pinze per staccare la cuticola senza tirare il cervello. Ripeti l'operazione fino a quando i nervi che originano dal cervello sono visibili e non è possibile accedere agli organi che collegano il cervello alle parti della bocca.

Tenendo i nervi che originano dal cervello con una pinza, tagliare la connessione tra il cervello e le parti della bocca con l'altro paio di pinze, separando il cervello dal resto della cuticola. Tenere il cervello per gli assoni che escono dal cordone nervoso ventrale e strappare gli organi circostanti tirandoli delicatamente via dal cervello. Quindi afferra la connessione tra i dischi immaginali dell'occhio e il cervello con l'altro paio di pinze, e taglia questa connessione senza tirare il cervello.

Assicurati che il cervello sia adeguatamente ripulito da altri tessuti e non danneggiato. Scartare il cervello se mostra segni di danno. Pipettare la soluzione di rivestimento con un P20 dentro e fuori per rivestire la punta della pipetta, quindi aspirare il cervello con la punta rivestita insieme a tre microlitri di terreno e pipettarlo in un altro pozzetto contenente 200 microlitri di terreno di coltura pulito.

Ripetere questo processo fino a quando non viene sezionato un numero sufficiente di cervelli, sostituendo occasionalmente il terreno di coltura del pozzetto in cui vengono eseguite le dissezioni. Utilizzare una pipetta P20 con punta rivestita per trasferire i cervelli sezionati in un altro pozzetto della piastra borosilicata contenente 200 microlitri di terreno di coltura e fibrinogeno. Aspirare un cervello insieme a nove microlitri di terreno di coltura e fibrinogeno.

Con l'estremità del puntale quasi a contatto con il fondo del vetro di copertura della piastra per colture cellulari, pipettare il contenuto in modo che il terreno di coltura tocchi il vetrino coprioggetto subito dopo essere uscito dal puntale della pipetta. Utilizzare una punta di un paio di pinze, o un paio di pinze chiuse, per spingere delicatamente e posizionare il cervello all'interno del terreno di coltura e della goccia di fibrinogeno. Se è necessario eseguire l'imaging della parte ventrale del cervello, indurre la coagulazione del fibrinogeno per orientare correttamente il cervello all'interno del coagulo.

Spingi il cervello su un lato della goccia. Toccare il bordo della goccia sul lato opposto del cervello con la punta della pipetta e aggiungere un microlitro di trombina. Attendere uno o due minuti affinché il fibrinogeno inizi a polimerizzare, con conseguente formazione di un precipitato torbido su un lato della goccia, quindi spingere delicatamente e infilare il cervello nel coagulo di fibrina, assicurandosi che il lato ventrale sia il più vicino possibile al vetrino coprioggetti senza deformare il cervello.

Pipettare un microlitro di soluzione di trombina vicino al lato del cervello non nascosto nel coagulo di fibrina. Attendere due o tre minuti affinché il secondo coagulo di fibrina si solidifichi, quindi premere sui bordi del coagulo per farlo aderire più fortemente al vetrino coprioggetti, facendo attenzione a non deformare il cervello. Se il cervello sembra essere troppo lontano dal vetrino coprioggetti, avvicinalo premendo il coagulo di fibrina più vicino al cervello.

Per indurre il coagulo di fibrina per l'imaging della parte dorsale del cervello, posizionare il cervello al centro della goccia, la parte dorsale rivolta verso il vetrino coprioggetti. Usando una pipetta P2, toccare il bordo della goccia sul lato opposto del cervello con la punta della pipetta e pipettare un microlitro di trombina. Attendere due o tre minuti affinché il fibrinogeno inizi a polimerizzare, con conseguente formazione di un precipitato fibroso torbido, quindi premere sui bordi del coagulo per farlo aderire più fortemente al vetrino coprioggetti, facendo attenzione a non deformare il cervello.

Con l'estremità del puntale posizionata a circa 0,5 centimetri sopra il coagulo, pipettare delicatamente 390 microlitri di terreno di coltura senza fibrinogeno goccia a goccia sopra il coagulo. Non aggiungere il terreno di coltura sui lati del coagulo, poiché potrebbe staccarlo dal vetrino coprioggetto. Per eliminare la trombina in eccesso, rimuovere 300 microlitri dal piatto, quindi aggiungere 300 microlitri di terreno di coltura pulito, assicurandosi che i coaguli rimangano completamente immersi.

Per evitare che le variazioni di temperatura causino cambiamenti di messa a fuoco, mantenere la soluzione con i reagenti alla stessa temperatura del piatto di coltura. Rimuovere il coperchio del piatto di coltura senza spostare il piatto stesso. Per una rimozione più semplice, posizionare il coperchio della piastra da 35 millimetri capovolto sopra la piastra prima di eseguire l'imaging.

Posizionare il puntale di una pipetta P1000 vicino alla superficie del terreno all'interno del piatto di coltura e rilasciare delicatamente il volume adeguato di soluzione reattiva su di esso, senza generare flussi forti che potrebbero staccare i coaguli. Per omogeneizzare la soluzione all'interno della piastra di coltura, utilizzare una pipetta P200 per pipettare lentamente una piccola quantità di soluzione dentro e fuori cinque volte. Riposizionare il coperchio senza spostare la piastra di coltura e riprendere l'imaging.

Quando un NAPP1 è stato aggiunto a cervelli larvali immobilizzati con fibrina che esprimono Bazooka marcato con GFP, i cervelli portatori di una mutazione analogicamente sensibile di aPKC, hanno mostrato una contrazione dell'epitelio neurale, così come grappoli luminosi di Baz nei neuroblasti e nella loro progenie. I neuroblasti hanno continuato a dividersi durante il time-lapse, indicando che il tessuto è rimasto sano. E i cervelli hanno mostrato poca deriva nonostante il cambiamento del mezzo culturale.

Allo stesso modo, l'applicazione di un NAPP1 alle ovaie che esprimono Bazooka marcato con GFP ha indotto la contrazione di cellule follicolari mutanti aPKC sensibili all'analogo, ma non di controlli. Un hyper stack che mostrava sia la deriva laterale che quella focalizzata è stato prima corretto per la deriva laterale, quindi per la deriva del fuoco, con conseguente riduzione sostanziale dei movimenti osservati nell'hyper stack originale. Quando si tenta questo protocollo, è importante infilare il cervello nel coagulo di fibrina parzialmente polimerizzato mentre il coagulo è ancora malleabile ma abbastanza solido da trattenere stabilmente il cervello.

Sperimenta la manipolazione dei coaguli vuoti e sonda delicatamente il coagulo mentre sta polimerizzando per verificare quanto sia robusto.