Name: Applicazioni di immobilizzazione dei tessuti Drosophila con coaguli di fibrina per limaging dal vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Impara a immobilizzare tessuti neurali di Drosophila con coaguli di fibrina per l'imaging dal vivo. Questo metodo minimizza il drift e permette l'aggiunta di reagenti durante l'osservazione dinamica dei processi neurali.

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Il lavoro nel laboratorio Januschke è supportato da sovvenzioni wellcome trust 100031/Z/12/A e 1000032/Z/12/A. La struttura di imaging tissutale è supportata dalla sovvenzione WT101468 di Wellcome.

<ol><li>Restrepo, S., Zartman, J. J., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+and+live+imaging+of+Drosophila+imaginal+discs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cultivation and live imaging of Drosophila imaginal discs.</a> Methods in Molecular Biology. 11478, 203-213 (2016).</li>
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<li>Haigo, S. L., Bilder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+tissue+revolutions+in+a+morphogenetic+movement+controlling+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Global tissue revolutions in a morphogenetic movement controlling elongation.</a> Science. 331 (6020), 1071-1074 (2011).</li>
<li>Tissot, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+molecular+cues+ensure+a+robust+microtubule-dependent+nuclear+positioning+in+the+Drosophila+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Distinct molecular cues ensure a robust microtubule-dependent nuclear positioning in the Drosophila oocyte.</a> Nature Communications. 8, 15168(2017).</li>
<li>Martin, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+live+imaging+of+the+Drosophila+adult+midgut+reveals+real-time+dynamics+of+division%2C+differentiation+and+loss%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Long-term live imaging of the Drosophila adult midgut reveals real-time dynamics of division, differentiation and loss.</a> eLife. , (2018).</li>
<li>Cabernard, C., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+neuroblast+lineages+within+intact+larval+brains+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), 970-977 (2013).</li>
<li>Sabado, V., Nagoshi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+resolution+fluorescence+live+imaging+of+Drosophila+circadian+clocks+in+larval+brain+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Single-cell resolution fluorescence live imaging of Drosophila circadian clocks in larval brain culture.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), (2018).</li>
<li>Lerit, D. A., Plevock, K. M., Rusan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+Drosophila+larval+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Live imaging of Drosophila larval neuroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), (2014).</li>
<li>Egger, B., van Giesen, L., Moraru, M., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+imaging+of+primary+neural+cell+culture+from+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">In vitro imaging of primary neural cell culture from Drosophila.</a> Nature Protocols. 8 (5), 958-965 (2013).</li>
<li>Homem, C. C., Reichardt, I., Berger, C., Lendl, T., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+live+cell+imaging+and+automated+4D+analysis+of+drosophila+neuroblast+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Long-term live cell imaging and automated 4D analysis of drosophila neuroblast lineages.</a> PloS One. 8 (11), 79588(2013).</li>
<li>Forer, A., Pickett-Heaps, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochalasin+D+and+latrunculin+affect+chromosome+behaviour+during+meiosis+in+crane-fly+spermatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Research%3A+An+iIternational+Journal+On+the+Molecular%2C+Supramolecular+and+Evolutionary+Aspects+of+Chromosome+Biology%22%5BJournal%5D)">Cytochalasin D and latrunculin affect chromosome behaviour during meiosis in crane-fly spermatocytes.</a> Chromosome Research: An iIternational Journal On the Molecular, Supramolecular and Evolutionary Aspects of Chromosome Biology. 6 (7), 533-549 (1998).</li>
<li>Pampalona, J., Januschke, J., Sampaio, P., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+recording+of+centrosomes+and+other+organelles+in+Drosophila+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Time-lapse recording of centrosomes and other organelles in Drosophila neuroblasts.</a> Methods in Cell Biology. 129, 301-315 (2015).</li>
<li>Ramat, A., Hannaford, M., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+miranda+localization+in+Drosophila+neuroblasts+involves+interaction+with+the+cognate+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Maintenance of miranda localization in Drosophila neuroblasts involves interaction with the cognate mRNA.</a> Current Biology: CB. 27 (14), 2101-2111 (2017).</li>
<li>Rebollo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+unequal+centrosomes+drive+spindle+orientation+in+asymmetrically+dividing+drosophila+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Functionally unequal centrosomes drive spindle orientation in asymmetrically dividing drosophila neural stem cells.</a> Developmental Cell. 12 (3), 467-474 (2007).</li>
<li>Hannaford, M. R., Ramat, A., Loyer, N., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((aPKC-mediated+displacement+and+actomyosin-mediated+retention+polarize+Miranda+in+Drosophila+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">aPKC-mediated displacement and actomyosin-mediated retention polarize Miranda in Drosophila neuroblasts.</a> eLife. 7, 166(2018).</li>
<li>Hannaford, M., Loyer, N., Tonelli, F., Zoltner, M., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical-genetics+approach+to+study+the+role+of+atypical+Protein+Kinase+C+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A chemical-genetics approach to study the role of atypical Protein Kinase C in Drosophila.</a> Development. 146 (2), (2019).</li>
<li>Loyer, N., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+last-born+daughter+cell+contributes+to+division+orientation+of+Drosophila+larval+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The last-born daughter cell contributes to division orientation of Drosophila larval neuroblasts.</a> Nature Communications. 9 (1), 3745(2018).</li>
<li>Wilcockson, S. G., Ashe, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+ovarian+germline+stem+cell+cytocensor+projections+dynamically+receive+and+attenuate+BMP+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Drosophila ovarian germline stem cell cytocensor projections dynamically receive and attenuate BMP signaling.</a> Developmental Cell. 50 (3), 296-312 (2019).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

L'imaging dal vivo di cervelli larvali D. melanogaster a montaggio intero offre l'opportunità di osservare divisioni asimmetriche delle cellule staminali neurali in condizioni vicine a un contesto fisiologico. La prima parte del nostro protocollo introduce il nostro approccio sulla dissezione del cervello larvale. Come già affermato13, un aspetto critico della preparazione è evitare di danneggiare il cervello. L'aspetto più impegnativo di questo è separare il cervello dai dischi immaginari vicini senza tirare eccessivamente sul cervello. Il nostro approccio al "taglio senza trazione" è quello di eseguire un movimento di rettifica con le punte di una coppia di pini, o di far scorrere una punta di pin pin lungo altre due punte di pin che tengono la connessione tra i tessuti (Figura 1A) mentre Lerit et al. Consigliamo allo sperimentatore di provare tutti gli approcci e di adottare quello più adatto a se stesso. Suggeriamo inoltre di utilizzare punte di pipette rivestite in BSA o FCS piuttosto che strumenti di dissezione per trasferire cervelli isolati. Il rivestimento impedisce ai tessuti di attaccarsi alla plastica e consente il trasferimento sicuro dei tessuti mantenendoli sempre completamente immersi, senza sottometterli a una possibile deformazione transitoria mentre si attaccano allo strumento di dissezione durante il trasferimento. Le punte rivestite hanno altri vantaggi per consentire il trasferimento di più cervelli contemporaneamente, il che è particolarmente utile quando è fondamentale controllare il tempo di residenza dei campioni all'interno di un particolare mezzo; sono adatti per il trasferimento di altri tessuti, anche fragili come, ad esempio, corpi grassi; possono ospitare una vasta gamma di diverse dimensioni del campione utilizzando punte più grandi o tagliando l'estremità della punta.
Successivamente, questo protocollo descrive l'uso della coagulazione di Fibrinogen per immobilizzare il cervello larvale sul coverslip di un piatto di coltura. Un cervello è orientato all'interno di una goccia di mezzo di coltura + Fibrinogeno, dopo di che la coagulazione è indotta dall'aggiunta di Trombina. La formazione di fibrina è graduale, fornendo un'area di tempo durante la quale l'orientamento del campione può essere messo a punto, se necessario (Figura 2C). Se è necessaria una leggera compressione del campione - cosa che sconsigliamo nel caso di cervelli larvali - può anche essere regolata finemente premendo il coagulo più o meno vicino al campione durante i passaggi 3.4.4 e 3.5.2. Il principale vantaggio di questa coagulazione di Fibrinogen rispetto al protocollo descritto in Lerit et al., in cui i cervelli sono montati tra una membrana permeabile al gas e un coverslip, è la capacità di sostituire il mezzo di coltura durante l'imaging dal vivo. Un possibile vantaggio dell'uso di una membrana permeabile al gas rispetto al nostro protocollo potrebbe essere che fornisce un'ossigenazione ottimale dei campioni, che potrebbe essere più limitata con il nostro approccio poiché i cervelli sono separati dall'aria dal coagulo e da qualche mezzo. Per questo motivo, anche se non abbiamo valutato l'effetto della quantità di mezzo di coltura all'interno del piatto di coltura, suggeriamo di limitare la quantità di mezzo di coltura sopra i coaguli mantenendo i coaguli completamente immersi.
Poiché la manipolazione dei coaguli può essere sperimentalmente difficile e dispendiosa in termini di tempo, si consiglia allo sperimentatore di praticare prima la manipolazione dei coaguli senza campioni. Modulare il volume della goccia di mezzo di coltura + Fibrinogeno sul coverslip, la concentrazione di Fibrinogen o il volume e la concentrazione di Trombina potrebbero contribuire a facilitare la preparazione e potrebbero essere importanti quando si adatta il protocollo ad altri tipi di tessuti. Con abbastanza esperienza nella manipolazione dei coaguli, diversi cervelli possono essere immobilizzati in un unico coagulo se necessario, anche se complica la messa a punto dell'orientamento. Diversi coaguli possono essere formati sul coverslip, consentendo, ad esempio, di immagini campioni di diversi genotipi. È anche possibile esporre coaguli diversi sullo stesso copriscicolo a diversi mezzi di coltura, anche se occorre fare attenzione a non mescolare mai le gocce di mezzo di coltura che coprono i diversi coaguli. Una volta che i cervelli larvali sono immobilizzati e pronti per l'imaging dal vivo, si consiglia di seguire le raccomandazioni di Lerit etal. Aggiungiamo solo a queste raccomandazioni non solo per mantenere il cervello a 25 °C durante l'imaging dal vivo con un incubatore di stadio, ma anche per preriscaldare questa fase per almeno 30 minuti prima dell'inizio dell'imaging. Nelle nostre mani, non farlo sistematicamente si traduce in una forte deriva di attenzione.
Può essere vantaggioso in alcuni contesti essere in grado di eseguire microscopia correlata e fissare e immunosomodiare un campione dopo l'imaging dal vivo. Tuttavia, una limitazione dell'uso di coaguli di Fibrin è che è quasi impossibile isolare meccanicamente un cervello da un coagulo senza danneggiarlo. Un possibile modo per superare questa limitazione potrebbe essere quello di sviluppare metodi per degradare i coaguli di fibrina con plasmina o per indurre lo smontaggio del coagulo mediante l'aggiunta di un peptide che imita le manopole permettendo la polimerizzazione della Fibrina28. In genere usiamo coaguli di fibrina su campioni che vanno da singole cellule a tessuti lunghi 200 μM, ma potremmo anche immobilizzare con successo nei coaguli e nel cervello dell'immagine da bombi adulti larghi oltre 3 mm. Resta da determinare il limite superiore della dimensione del campione che può essere immobilizzato nei coaguli. Allo stesso modo, sebbene di solito immaginiamo campioni immobilizzati per 4-5 ore, abbiamo immaginato con successo i neuroblasti nella coltura primaria per un massimo di 3 giorni, indicando che il coagulo almeno non interferisce con la vitalità a lungo termine. Al contrario, i coaguli possono facilitare la sostituzione regolare del mezzo, un requisito per l'imaging a lungo termine, senza la necessità di dispositivi come pompe peristaltiche a questo scopo. Anche se non abbiamo misurato i parametri di permeabilità dei coaguli di fibrina, la natura fibrosa simile a un gel dei coaguli sembra essere penetrabile da molecole permeabili cellulari. Abbiamo scoperto che Latrunculin A, Colcemid o 1-NAPP1, ligandi a tag HALO e altri coloranti standard utilizzati in biologia cellulare raggiungono le cellule nel coagulo di fibrina senza problemi e finora non hanno incontrato molecole che sarebbero state trattenute dal coagulo, che, tuttavia, è una possibilità che deve essere testata empiricamente.
In conclusione, l'utilizzo di coaguli di Fibrin fornisce un modo affidabile e relativamente facile da implementare per immobilizzare i tessuti viventi per l'imaging dal vivo. Al di là della sua utilità nel limitare la deriva laterale, la capacità di cambiare il mezzo di coltura durante l'imaging vivo si è dimostrata inestimabile per il nostro approccio di genetica chimica allo studio della divisione cellulare asimmetrica dei neuroblasti D. melanogaster 21. Prevediamo che questa tecnica sarà utile per gli studi su una vasta gamma di tessuti diversi, in particolare se coinvolgono genetica chimica o, ad esempio, autoeticazione proteica29.
La nostra macro MultiHyperStackReg si basa sul plug-in TurboReg ImageJ, che allinea frame o sezioni successive di uno stack, e sul plug-in MultiStackReg ImageJ, che consente di applicare le trasformazioni ad altri stack. MultiHyperStackReg consente semplicemente di applicare queste trasformazioni agli iperstack (stack con almeno quattro dimensioni). Poiché l'uso di MultiHyperStackReg, come lo descriviamo, richiede molte azioni e può richiedere molto tempo, abbiamo anche scritto la macro AutoHyperStackReg, che esegue automaticamente tutti i passaggi descritti nei passaggi 6.2 e 6.3. Tuttavia, contrariamente a MultiHyperStackReg, AutoHyperStackReg attualmente non ha la possibilità di calcolare l'allineamento di uno stack in base a una sottoregione di questo stack, un'opzione che abbiamo trovato a volte è cruciale per un allineamento soddisfacente. Un'altra limitazione di AutoHyperStackReg è che il suo utilizzo è limitato alle traduzioni e non alle altre trasformazioni proposte da TurboReg e MultiStackReg, mentre MultiHyperStackReg può essere applicato a un hyperstack qualsiasi tipo di trasformazione se l'utente ne ha bisogno. Le versioni future implementeranno queste funzioni e saranno disponibili su GitHub30. Infine, la nostra macro di linee rotanti può fornire un modo semplice per misurare rapidamente i segnali corticali in time lapses, anche se la corteccia cambia la sua posizione o orientamento nel tempo. Se la sua modalità di tracciamento o la sua modalità di non tracciamento è più adatta per l'analisi dipende dalla qualità e dalla coerenza del segnale corticale. La modalità di tracciamento è più facile da usare in quanto l'utente non ha bisogno di considerare dove sarà la corteccia per ogni punto di tempo e può adattarsi a grandi cambiamenti di posizione e orientamento nel tempo. Tuttavia, è adatto solo se il segnale corticale rimane abbastanza forte per il rilevamento durante l'intero filmato: la mancata rilevazione di nient'altro che la corteccia (ad esempio, un compartimento citoplasmatico luminoso vicino alla corteccia) può compromettere il rilevamento per ogni successivo punto di tempo (ad esempio, il compartimento citoplasmatico si allontana dalla corteccia e le linee corticalican lo seguono per il resto del tempo decadrà). La modalità di non tracciamento non ha questa insidia in quanto il rilevamento è limitato alla linea originariamente disegnata dall'utente (ad esempio, un compartimento citoplasmatico luminoso può causare il fallimento del rilevamento per alcuni punti di tempo, ma man mano che il compartimento citoplasmatico si allontana dalla zona di rilevamento, riprende il corretto rilevamento della corteccia), ma non si comporta bene se la posizione o l'orientamento della corteccia cambia molto nel tempo. La prossima funzione (che sarà disponibile su GitHub30) da sviluppare per la modalità di tracciamento sarà la possibilità di analizzare solo i punti di tempo specificati e di definire un punto di tempo di riferimento (anziché il primo punto di tempo) prima del quale e dopo di che verrà eseguito il rilevamento, che consentirà all'utente di evitare almeno punti di tempo problematici.

Drosophila continua ad essere un importante sistema modello per studiare una vasta gamma di questioni biologiche ed è eccelleto nel far progredire le conoscenze in molte discipline per decenni. Una caratteristica che lo distingue particolarmente è che è particolarmente adatto per l'imaging dal vivo. La capacità di monitorare i processi subcellulari o il comportamento di cellule e tessuti in tempo reale continua a contribuire a generare concetti chiave rilevanti per la biologia cellulare e dello sviluppo. Molti protocolli di successo sono stati sviluppati da diversi gruppi per mantenere vivi e sani tali campioni di Drosophila per studiare il comportamento del campione e delle molecole fluorescenti vive. Organi e tessuti della mosca come idischi immaginari1,2,il cervello larvale3,4,5, 6o camere d'uovo di femmine adulte7,8,9o l'intestino adulto10 per esempio possono essere estratti e conservati in coltura per l'imaging con microscopia time-lapse. Una sfida fondamentale per l'imaging dal vivo consiste nel garantire che il campione sia tenuto vicino alla superficie di imaging per una risoluzione ottimale e immobile senza compromettere l'integrità del campione che può essere sensibile agli impatti meccanici. Per studiare le cellule staminali neurali, chiamate neuroblasti o neuroni nel cervello larvale della Drosophila, ad esempio, mantenere i campioni vicini alla superficie di imaging può essere ottenuto coprendoli con mezzi di coltura in camere di imaging sigillate11,12,13. Tuttavia, questo approccio non consente facilmente lo scambio di media limitando così lo spazio sperimentale di manovra. In alternativa, i campioni possono essere preparati e posizionati su coverlips trattati per aumentare l'adesione delle cellule e consentire la microscopia a visita multi-punto e l'imaging esteso a cellule vive in piatti a coltura aperta, che potenzialmente consentono lo scambio di media, ma non forniscono mezzi facili per prevenire la deriva o la perdita del campione durante lo scambiodi media 14,15.
Il metodo del coagulo di Fibrina originariamente sviluppato per studiare la meiosi negli spermatociti vita gru-mosca16 è specificamente adatto a superare questi problemi. Il fibrinogeno viene sciolto nel mezzo di coltura pertinente, i campioni posizionati e orientati in una goccia di questa soluzione su un'adeguata camera di imaging vetro-superficie prima dell'aggiunta di Trombina, con conseguente rapida formazione di un coagulo di Fibrina insolubile, una rete fibrosa appiccicosa che aderisce alla superficie del vetro e ai campioni garantendo al contempo l'accesso del campione al terreno di coltura. Il mezzo può quindi essere scambiato senza perturbo il coagulo o la posizione del campione. Lo scambio di mezzi di coltura durante l'imaging è, ad esempio, auspicabile quando gli inibitori devono essere aggiunti come nel metodo originale o per esperimenti di lavaggio o inseguimento di impulsi o quando i coloranti fluorescenti devono essere aggiunti durante l'imaging di cellule vive mantenendo cellule e tessuti in posizione. I coaguli di fibrina sono adatti per l'imaging di tessuti Drosophila e singolecellule 13,17. I coaguli di fibrina possono essere ulteriormente utilizzati per aiutare a orientare i campioni, che a causa della loro forma o altre proprietà normalmente non sarebbero orientati nel modo desiderato modulando la posizione del campione all'interno del coagulo di Fibrina e la forma del coagulo stesso.
Qui forniamo un aggiornamento sui nostri attuali metodi di imaging basati sul coagulo di Fibrin e forniamo strumenti per l'analisi delle immagini basata sulla segmentazione e ci concentriamo sull'uso di questo metodo per studiare le divisioni dei neuroblasti nel cervello della mosca in via di sviluppo. Usiamo regolarmente il metodo del coagulo di Fibrin per seguire più campioni in coaguli diversi nello stesso piatto di coltura. Ciò consente di i) l'imaging di eventi subcellulari come il comportamento centrosoma o la localizzazione dell'mRNAdal vivo 18,19, ii) il monitoraggio del comportamento dei campioni durante il trattamento farmacologico di diversi genotipi sotto le stesse impostazioni di imaging utilizzando visite multi-punto microscopia20, iii) studio degli effetti dell'inibizione acutadegli enzimi 21 e iv) minimizzazione della deriva per studiare i cambiamenti nell'orientamento della divisione cellulare delle cellule all'interno del loro ambiente fisiologico su laser-ablazionemirata 22. Mentre gli effetti indesiderati di Trombina e Fibrinogeno e del coagulo di Fibrina devono essere testati empiricamente per ogni campione, questo metodo è in linea di principio adatto a immobilizzare qualsiasi tipo di campione che deve essere analizzato mediante imaging a cellule vive e in Drosophila è stato utilizzato con successo per studiare molteplici aspetti della biologia dei neuroblasti5,19,20, ma anche la dinamica delle proiezioni citosensoriali delle cellule staminali della linea germinalefemminile 23 e i cambiamenti di polarità sull'inibizione acuta dell'aPKC delle cellule follicolari delle camere uovo femminili drosophila 21.
L'imaging fluorescente time-lapse si traduce nella generazione di complessi set di dati 3D risolti nel tempo che richiedono metodi per estrarre queste informazioni quantitative. Qui descriviamo il nostro ulteriore sviluppo dimacro 24 basate su ImageJ che possono essere utilizzate per correggere la deriva negli iperstack e macro ImageJ su misura che consentono la quantificazione semi-automatizzata della fluorescenza multicanale presso la corteccia cellulare sviluppata per quantificare le proteine corticali nei neuroblasti dei cervelli larvali di Drosophila o dei singoli neuroblasti nella coltura cellulare primaria.

<table><tbody><tr><td>Siero bovino all'albumina, BSA</td><td>Merck</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-glucosio</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil solfossido</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 Pinze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Siero bovie fetale, adatto per colture cellulari</td><td>Sigma</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogeno da plasma</td> <td>umanoPiastra</td> per colture cellulari Sigma <td>F3879</td><td></td></tr><tr><td>FluoroDish - 35 mm, pozzetto da 23 mm</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD35-100</td><td></td></tr><tr><td>PP1 Analogico (1NA-PP1)</td><td>Merck Millipore</td><td>529579</td><td></td></tr><tr><td>Piastra spot Pyrex con nove depressioni Sigma</td><td></td><td>CLS722085-18EA</td><td></td></tr><tr><td>Schneider's Insect Medium</td><td>Sigma</td><td>S0146</td><td></td></tr><tr><td>Trombina da plasma bovino</td><td>Merck</td><td>T4648</td><td></td></tr></tbody></table>

applicazioni di immobilizzazione dei tessuti drosophila con coaguli di fibrina per l'imaging dal vivo

Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

Drosophila è un importante sistema modello per studiare una vasta gamma di questioni biologiche. Vari organi e tessuti di diversi stadi di sviluppo della mosca come i dischi immaginari, le camere larvali del cervello o delle uova delle femmine adulte o dell'intestino adulto possono essere estratti e tenuti in coltura per l'imaging con microscopia time-lapse, fornendo preziose informazioni sulla biologia cellulare e dello sviluppo. Qui, descriviamo in dettaglio il nostro attuale protocollo per la dissezione dei cervelli larvali di Drosophila, e poi presentiamo il nostro attuale approccio per immobilizzare e orientare cervelli larvali e altri tessuti su una coverlip di vetro usando coaguli di fibrina. Questo metodo di immobilizzazione richiede solo l'aggiunta di Fibrinogen e Thrombin al mezzo di coltura. È adatto per l'imaging time lapse ad alta risoluzione su microscopi rovesciati di più campioni nello stesso piatto di coltura, riduce al minimo la deriva laterale frequentemente causata dai movimenti della fase del microscopio in microscopia da visita multi-punto e consente l'aggiunta e la rimozione di reagenti durante il corso di imaging. Presentiamo anche macro su misura che utilizziamo regolarmente per correggere per la deriva e per estrarre ed elaborare informazioni quantitative specifiche dall'analisi time-lapse.

Immobilizzazione dei tessuti Drosophila con coaguli di Fibrina e scambio di mezzi di coltura durante l'imaging dal vivo. Dopo essere stati sezionati seguendo la procedura presentata nella fase 2 (Figura 1) e immobilizzati nei coaguli di Fibrina sullo stesso coverslip seguendo la procedura presentata al passaggio 3 (Figura 2), i cervelli larvali che esprimono Bazooka taggato dalla GFP (Baz::GFP), l'ortologo a mosca della proteina polarità Par-3, sono stati imageizzati per 30 minuti in imaging confocale multi-posizione time-lapse. Baz::GFP è combinato con apkcas4, un allele che consente l'inibizione acuta della proteina atipica chinasi C (aPKC) attraverso l'aggiunta del piccolo atp analogico 1-NAPP120. 1-NAPP1 è stato quindi aggiunto al mezzo di coltura seguendo la procedura presentata nella fase 4 e l'imaging dal vivo è stato ripreso per 2,5 ore. I cervelli di controllo che trasportavano una versione di tipo selvaggio dell'aPKC della chinasi non hanno reagito all'analogo ATP, mentre i cervelli che trasportavano inoltre una mutazione analoga sensibile dell'aPKC (apkcas4) hanno mostrato una contrazione del neuroepitelio e dei gruppi luminosi di Baz nei neuroblasti e nella loro progenie(Figura 6, Video 1). I neuroblasti continuano a dividersi per tutto il time-lapse, indicando che il tessuto rimane sano, e il cervello mostra poca deriva nonostante il cambiamento del mezzo di coltura, indicando che sono ben immobilizzati. Allo stesso modo, dopo essere stati sezionati seguendo la procedura presentata in27, gli ovariole che esprimono Baz::GFP sono stati immobilizzati nei coaguli di Fibrina sullo stesso coverslip e con immagini per 8 minuti, dopo di che l'applicazione di 1-NAPP1 ha indotto la contrazione di cellule follicolari mutanti apkcas4 ma non di controlli(Figura 7, Video 2).
Correzione della deriva laterale e dello stato attivo mediante MultiHyperstackReg. Un hyperstack che mostra sia la deriva laterale che quella di messa a fuoco(Video 3,pannello sinistro) è stato prima corretto per la deriva laterale (passaggio 6.2, Figura 3, Video 3, pannello centrale), quindi la deriva di messa a fuoco (passaggio 6.3, Figura 4, Video 3, pannello destro) utilizzando il plugin MultiStackReg e la macro MultiHyperstackReg, con conseguente sostanziale riduzione dei movimenti osservati nell'iperstack originale.
Misurazione corticale del segnale utilizzando lattine di linea rotanti Un neuroblasto che esprime Baz::GFP (verde) e la proteina transmembrana CD4 taggata con una proteina fluorescente infrarossa (CD4::mIFP, rosso) è stato immaginato durante una mitosi. Il segnale CD4::mIFP è stato utilizzato come riferimento per rilevare la corteccia in varie parti del neuroblasto con lattine di linee (passo 7, Figura 5, Figura 8A-C) e il segnale Baz::GFP è stato misurato nelle posizioni rilevate Figura 8D). Durante la loro divisione, i neuroblasti si polarizzarono transitoriamente stabilendo domini corticali distinti e opposti: il polo apicale e il polo basale. Baz definisce il polo apicale e, coerentemente, il segnale Baz::GFP aumentato al polo apicale del neuroblasto e diminuito al polo basale durante la divisione (Figura 8C,D). La posizione della corteccia è stata tracciata in modo soddisfacente per tutto il time-lapse(Figura 8C, Video 4). Le linee e i genotipi drosophila sono referenziati nella tabella supplementare 1-2.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61954/61954fig06.jpg"> Figura 6: Applicazione di un analogo ATP sul cervello larvale immobilizzato durante l'imaging dal vivo. (A) Imaging dal vivo di due cervelli larvali che esprimono Baz::GFP immobilizzato sullo stesso coverslip. Il mezzo di coltura viene cambiato in una concentrazione di 10 μM dell'ATP analogico 1-NAPP1 a 0 min. I cervelli di controllo non reagiscono visibilmente all'analogo ATP, mentre i cervelli che portano una mutazione sensibile analogica diaPKC ( aPKCAS4) mostrano una contrazione del neuroepitelio (punte di freccia) e dei gruppi luminosi di Baz nei neuroblasti e nella loro progenie. Proiezione di intensità massima di 33 fette per una profondità di 23 μM. Barra di scala: 20 μM. (B) Ingrandimento del neuroepitelio. Barra di scala: 10 μM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61954/61954fig06large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61954/61954fig07.jpg"> Figura 7: Applicazione di un analogo ATP sulle camere delle uova immobilizzate durante l'imaging dal vivo. Imaging dal vivo di due ovariole che esprimono Baz::GFP immobilizzato sullo stesso coverslip. Il mezzo di coltura viene cambiato in una concentrazione di 10 μM dell'ATP analogico 1-NAPP1 a 0 min. Le camere delle uova di controllo non reagiscono visibilmente all'analogo ATP, mentre le camere delle uova che portano una mutazione sensibile analogica diaPKC (aPKCAS4) mostrano una contrazione dell'epitelio (punte di freccia) che alla fine porta all'apparente rottura delle giunzioni aderenti. Proiezione di intensità massima di 33 fette per una profondità di 27 μM. Barra di scala: 20 μM. Fare clic <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61954/61954fig07large.jpg" target="_blank">qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61954/61954fig08.jpg"> Figura 8: Misurazione del segnale corticale mediante lacanne rotanti. (A) Neuroblasto D. melanogaster vivo che esprime Baz::GFP (verde) e CD4::mIFP (rosso). Linee ciano: linee di scansione iniziali tracciate perpendicolarmente a varie zone corticali da misurare. Barra di scala: 5 μM. (B) Identificazione della corteccia (linea blu scuro) usando lattine di linee corticali e CD4::mIFP (rosso) come canale di riferimento. Linea ciano: area definita dal parametro "Misura intorno" (qui, 2 pixel), dove il segnale viene misurato dopo il rilevamento della corteccia. Barra di scala: 2 μm. (C) Ciano: aree corticali identificate durante una divisione di neuroblasti dal metodo delle reti a linee rotanti dalle linee di scansione iniziali visualizzate in (A), usando CD4::mIFP (rosso) come canale di riferimento. Barra di scala: 5 μM. Freccia: polo apicale. Punta di freccia: palo basale. (D) Misurazione dell'intensità del segnale Baz::GFP nel tempo nelle due zone corrispondenti identificate dalle lattine rotanti visualizzate in (C). Durante la mitosi, Baz::GFP si arricchisce transitoriamente al polo apicale del neuroblasto e si esaurisce dal polo basale opposto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61954/61954fig08large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Video 1: Applicazione dello scambio di media sul cervello larvale immobilizzato durante l'imaging dal vivo per aggiungere un inibitore, presentato nella Figura 6, barra di scala: 20 μm. Fare <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_1_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">clic qui per scaricare questo video.</a>
Video 2: Applicazione dello scambio di supporti su camere di uova immobilizzate durante l'imaging dal vivo per aggiungere un inibitore, presentato nella figura 7, barra di scala: 20 μm. Fare <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_2_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">clic qui per scaricare questo video.</a>
Video 3: Correzione della deriva laterale e di messa a fuoco con MultiHyperStackReg. Imaging dal vivo di un neuroblasto che esprime la sonda di membrana PH::GFP. Xy: piano focale singolo. Xz: reslice ortogonale. A sinistra: prima della correzione della deriva. Al centro: dopo la correzione della deriva laterale. A destra: dopo aver corretto la deriva laterale e di messa a fuoco, barra di scala: 10 μm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_3_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo video.</a>
Video 4: Rilevamento della corteccia utilizzando lattine rotanti, presentato nella figura 8, barra di scala: 5 μm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_4_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo video.</a>
Tabella supplementare 1: Genotipi di tessuti Drosophila con immagini. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Supplemental_Table_1_genotypes.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>
Tabella supplementare 2: Origine dei transgeni utilizzati. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Supplemental_Table_2_origine_of_transgenes.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>
File di codifica supplementare 1: Origine dei transgeni utilizzati. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Code1_MultiHyperstackReg.ijm" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
File di codifica supplementare 2: Origine dei transgeni utilizzati. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Code2_AutoHyperstackReg.ijm" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
File di codifica supplementare 3: Origine dei transgeni utilizzati. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Code3_RotatingLineScan.ijm" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>

Questo protocollo descrive le applicazioni dell'immobilizzazione dei campioni utilizzando coaguli di Fibrin, limitando la deriva e consentendo l'aggiunta e il lavaggio di reagenti durante l'imaging dal vivo. I campioni vengono trasferiti in una goccia di Fibrinogen contenente terreno di coltura sulla superficie di un coverslip, dopo di che la polimerizzazione è indotta dall'aggiunta di trombina.

Applicazioni di immobilizzazione dei tessuti Drosophila con coaguli di fibrina per l'imaging dal vivo

Drosophila is an important model system to study a vast range of biological questions. Various organs and tissues from different developmental stages of ...

Questo protocollo descriveva l'immobilizzazione del campione utilizzando coaguli di fibrina. I campioni vengono trasferiti in una goccia di fibrinogeno contenente terreno di coltura sulla superficie di un vetrino coprioggetti, dopodiché la polimerizzazione viene indotta mediante l'aggiunta di trombina. Sotto un microscopio da dissezione, utilizzare un pennello per trasferire le larve L3 in un piatto di vetro borosilicato a nove pozzetti contenente PBS.Mescolare per staccare la maggior parte del cibo per mosche dalle larve e trasferirlo in un altro pozzetto contenente terreno di coltura. Usa una pinza per afferrare una larva per tutto il suo diametro al centro della sua lunghezza corporea e trasferiscila in un altro pozzetto della piastra borosilicata contenente 200 microlitri di terreno di coltura fresco. Non rilasciare la larva.Per tagliare la larva a metà per tutto il suo diametro, macinare l'area afferrata con il movimento laterale delle punte delle pinze, oppure far scorrere una punta di un altro paio di pinze tra le due punte delle pinze che tengono la larva. Usa la pinza per tenere la larva per la cuticola e un altro paio di pinze per staccare la cuticola senza tirare il cervello. Ripeti l'operazione fino a quando i nervi che originano dal cervello sono visibili e non è possibile accedere agli organi che collegano il cervello alle parti della bocca.Tenendo i nervi che originano dal cervello con una pinza, tagliare la connessione tra il cervello e le parti della bocca con l'altro paio di pinze, separando il cervello dal resto della cuticola. Tenere il cervello per gli assoni che escono dal cordone nervoso ventrale e strappare gli organi circostanti tirandoli delicatamente via dal cervello. Quindi afferra la connessione tra i dischi immaginali dell'occhio e il cervello con l'altro paio di pinze, e taglia questa connessione senza tirare il cervello.Assicurati che il cervello sia adeguatamente ripulito da altri tessuti e non danneggiato. Scartare il cervello se mostra segni di danno. Pipettare la soluzione di rivestimento con un P20 dentro e fuori per rivestire la punta della pipetta, quindi aspirare il cervello con la punta rivestita insieme a tre microlitri di terreno e pipettarlo in un altro pozzetto contenente 200 microlitri di terreno di coltura pulito.Ripetere questo processo fino a quando non viene sezionato un numero sufficiente di cervelli, sostituendo occasionalmente il terreno di coltura del pozzetto in cui vengono eseguite le dissezioni. Utilizzare una pipetta P20 con punta rivestita per trasferire i cervelli sezionati in un altro pozzetto della piastra borosilicata contenente 200 microlitri di terreno di coltura e fibrinogeno. Aspirare un cervello insieme a nove microlitri di terreno di coltura e fibrinogeno.Con l'estremità del puntale quasi a contatto con il fondo del vetro di copertura della piastra per colture cellulari, pipettare il contenuto in modo che il terreno di coltura tocchi il vetrino coprioggetto subito dopo essere uscito dal puntale della pipetta. Utilizzare una punta di un paio di pinze, o un paio di pinze chiuse, per spingere delicatamente e posizionare il cervello all'interno del terreno di coltura e della goccia di fibrinogeno. Se è necessario eseguire l'imaging della parte ventrale del cervello, indurre la coagulazione del fibrinogeno per orientare correttamente il cervello all'interno del coagulo.Spingi il cervello su un lato della goccia. Toccare il bordo della goccia sul lato opposto del cervello con la punta della pipetta e aggiungere un microlitro di trombina. Attendere uno o due minuti affinché il fibrinogeno inizi a polimerizzare, con conseguente formazione di un precipitato torbido su un lato della goccia, quindi spingere delicatamente e infilare il cervello nel coagulo di fibrina, assicurandosi che il lato ventrale sia il più vicino possibile al vetrino coprioggetti senza deformare il cervello.Pipettare un microlitro di soluzione di trombina vicino al lato del cervello non nascosto nel coagulo di fibrina. Attendere due o tre minuti affinché il secondo coagulo di fibrina si solidifichi, quindi premere sui bordi del coagulo per farlo aderire più fortemente al vetrino coprioggetti, facendo attenzione a non deformare il cervello. Se il cervello sembra essere troppo lontano dal vetrino coprioggetti, avvicinalo premendo il coagulo di fibrina più vicino al cervello.Per indurre il coagulo di fibrina per l'imaging della parte dorsale del cervello, posizionare il cervello al centro della goccia, la parte dorsale rivolta verso il vetrino coprioggetti. Usando una pipetta P2, toccare il bordo della goccia sul lato opposto del cervello con la punta della pipetta e pipettare un microlitro di trombina. Attendere due o tre minuti affinché il fibrinogeno inizi a polimerizzare, con conseguente formazione di un precipitato fibroso torbido, quindi premere sui bordi del coagulo per farlo aderire più fortemente al vetrino coprioggetti, facendo attenzione a non deformare il cervello.Con l'estremità del puntale posizionata a circa 0,5 centimetri sopra il coagulo, pipettare delicatamente 390 microlitri di terreno di coltura senza fibrinogeno goccia a goccia sopra il coagulo. Non aggiungere il terreno di coltura sui lati del coagulo, poiché potrebbe staccarlo dal vetrino coprioggetto. Per eliminare la trombina in eccesso, rimuovere 300 microlitri dal piatto, quindi aggiungere 300 microlitri di terreno di coltura pulito, assicurandosi che i coaguli rimangano completamente immersi.Per evitare che le variazioni di temperatura causino cambiamenti di messa a fuoco, mantenere la soluzione con i reagenti alla stessa temperatura del piatto di coltura. Rimuovere il coperchio del piatto di coltura senza spostare il piatto stesso. Per una rimozione più semplice, posizionare il coperchio della piastra da 35 millimetri capovolto sopra la piastra prima di eseguire l'imaging.Posizionare il puntale di una pipetta P1000 vicino alla superficie del terreno all'interno del piatto di coltura e rilasciare delicatamente il volume adeguato di soluzione reattiva su di esso, senza generare flussi forti che potrebbero staccare i coaguli. Per omogeneizzare la soluzione all'interno della piastra di coltura, utilizzare una pipetta P200 per pipettare lentamente una piccola quantità di soluzione dentro e fuori cinque volte. Riposizionare il coperchio senza spostare la piastra di coltura e riprendere l'imaging.Quando un NAPP1 è stato aggiunto a cervelli larvali immobilizzati con fibrina che esprimono Bazooka marcato con GFP, i cervelli portatori di una mutazione analogicamente sensibile di aPKC, hanno mostrato una contrazione dell'epitelio neurale, così come grappoli luminosi di Baz nei neuroblasti e nella loro progenie. I neuroblasti hanno continuato a dividersi durante il time-lapse, indicando che il tessuto è rimasto sano. E i cervelli hanno mostrato poca deriva nonostante il cambiamento del mezzo culturale.Allo stesso modo, l'applicazione di un NAPP1 alle ovaie che esprimono Bazooka marcato con GFP ha indotto la contrazione di cellule follicolari mutanti aPKC sensibili all'analogo, ma non di controlli. Un hyper stack che mostrava sia la deriva laterale che quella focalizzata è stato prima corretto per la deriva laterale, quindi per la deriva del fuoco, con conseguente riduzione sostanziale dei movimenti osservati nell'hyper stack originale. Quando si tenta questo protocollo, è importante infilare il cervello nel coagulo di fibrina parzialmente polimerizzato mentre il coagulo è ancora malleabile ma abbastanza solido da trattenere stabilmente il cervello.Sperimenta la manipolazione dei coaguli vuoti e sonda delicatamente il coagulo mentre sta polimerizzando per verificare quanto sia robusto.

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