Raffinata compensazione dei tessuti basata su CLARITY per l'organizzazione tridimensionale dei fibroblasti nei cuori di topo sani e feriti

Questo nuovo protocollo di compensazione dei tessuti migliora la tecnologia esistente per consentire uno sguardo in vivo più accurato su specifici tipi di cellule nel cuore e sul loro comportamento in condizioni di lesione. Questo protocollo è rapido e abbastanza semplice. Consente il mantenimento della fluorescenza marca con minima interferenza dall'autofluorescenza del tessuto di fondo senza richiedere colorazione cellulare o tissutale.

Iniziare utilizzando una garza imbevuta di etanolo al 70% per pulire la superficie ventrale del mouse sperimentale. Usa le forbici chirurgiche per fare un'incisione trasversale di tre centimetri, circa tre metri sotto il processo xifoide e deglovare il topo dall'addome al processo xifoide per separare la pelle dal tessuto della parete addominale sottostante. Fai un'incisione trasversale di due centimetri nel tessuto della parete addominale sottocutanea, tre centimetri sotto il processo xifoide e fai un taglio verticale da questa incisione lungo la linea mediana attraverso la gabbia toracica.

Schienare la gabbia toracica per esporre il cuore. E utilizzare una siringa da 10 millilitri dotata di un ago calibro 27 per iniettare PBS freddo nella vena cava e nell'aorta superiori. Quando tutto il sangue è stato lavato dal cuore, consegnare 10 millilitri di FREDDO 4%PFA nella vena cava superiore e nell'aorta per iniziare il processo di fissazione.

Quando tutto il fissatore è stato lampeggiato, asportare il cuore e utilizzare un bisturi a lama dritta per separare gli atri, il ventricolo destro e il setto e il ventricolo sinistro. Mettere il cuore in un tubo conico da 15 millilitri di PFA freddo al 4% per un'incubazione notturna a quattro gradi Celsius su un nutator. La mattina seguente, aggiungere una soluzione di fotoaziatore allo 0,25% a una soluzione di idrogel preparata al momento e trasferire il cuore all'idrogel.

Avvolgere il tubo conico in un foglio per un'incubazione notturna a quattro gradi Celsius senza disturbi fisici. La mattina successiva riscaldare il tubo in un bagno di perline di 37 gradi celsius per 2,5 ore prima di utilizzare le forcep per trasferire attentamente il cuore in un tubo da 15 millilitri di PBS. Lavare il cuore tre volte in PBS per un'ora per lavaggio a 37 gradi Celsius su un nutator e trasferire il cuore nel cestello di una macchina per elettroforesi attiva.

Fissare il coperchio in posizione e riempire il serbatoio attivo della camera di elettroforesi con soluzione di compensazione dell'elettroforesi. Una volta che la camera è piena, immergere il cestello nella soluzione e stringere il tappo sulla macchina per l'elettroforesi in posizione. Quindi eseguire la macchina per elettroforesi a 1,5 ampere e 37 gradi celsius per 1,5 ore.

Dopo l'elettroforesi, controllare visivamente il cuore per assicurarsi che non rimanga tessuto opaco. Lavare il cuore sgombrato tre volte in un due da 15 millilitri per un'ora in PBS fresco a 37 gradi celsius per lavaggio su un nutator. Prima di immergere il cuore in agente decolorante per ridurre la fluorescenza automatica dell'eme.

Dopo 48 ore, lavare il cuore tre volte in PBS come dimostrato ed equilibrare il cuore in RIMS appena preparato per 48 ore prima dell'imaging. Per l'imaging 3D del cuore cancellato, posizionare innanzitutto un sottile strato di grasso sottovuoto sul fondo di un serbatoio inferiore stampato in 3D, la stessa altezza del campione che viene immaginato. Riempire il serbatoio con RIMS e utilizzare una punta di pipetta per rimuovere eventuali bolle.

Posizionare con cura il cuore nel RIMS con la parete ventricolare sinistra rivolta verso l'alto, facendo attenzione che nessuna bolla sia introdotta nella soluzione. Utilizzare grasso sottovuoto per attaccare un coperchio di vetro alla superficie inferiore di un pezzo del serbatoio superiore stampato in 3D e posizionare il coperchio superiore del serbatoio verso il basso sui serbatoi inferiori, facendo attenzione a evitare bolle. Quindi riempire i serbatoi principali con glicerolo.

Usa un microscopio confocale per immagini i cuori cancellati. La combinazione di una raffinata pulizia dei tessuti cardiaci con l'imaging 3D consente una visualizzazione dettagliata avanzata dei fibroblasti cardiaci. Utilizzando questa tecnica di imaging, i fibroblasti sono osservati essere densamente imballati e avere una morfologia spinosa nei cuori illesi.

Dopo la lesione da riperfusione dell'ischemia, si vede una perdita di fibroblasti cardiaci nella regione ischemica per i primi tre giorni dopo l'infortunio. Al settimo e al 14° giorno, i fibroblasti sono migrati o proliferati per ripopolare l'area del tessuto ferito. Al giorno 28, la popolazione di fibroblasti cardiaci che circonda le aree ferite del cuore è alla loro massima densità.

Un giorno e mezzo dopo la lesione da infarto del miocardio, pochi fibroblasti rimangono all'interno del ventricolo sinistro ferito. Al terzo giorno, tuttavia, i fibroblasti si espandono e sono presenti nella maggior parte del ventricolo sinistro. A differenza della chirurgia ischemica, l'infusione di angiotensina due e fenoefrina per diverse settimane non si traducono in perdita cardiaca del tessuto e assottigliamento delle pareti.

Invece, i fibroblasti si allineano lungo l'asse del modello di contrazione dell'elica destrorsa come si vede quando si utilizza il protocollo raffinato per la compensazione dei tessuti. Inoltre, dopo il trattamento con angiotensina due e fenoefrina, i fibroblasti appaiono piccoli e arrotondati rispetto alla forma del mandrino osservata nei modelli di rifusione di ischemia e lesione da infarto del miocardio. La radura elettroforetica deve essere eseguita con attenzione soprattutto quando si lavora con cuori che hanno subito protocolli di lesione.

Questo protocollo può essere utilizzato per valutare come i fibroblasti cardiaci reagiscono alle lesioni in vivo. Diversi marcatori fluorescenti possono anche essere utilizzati per capire come il cuore risponde alle lesioni a livello cellulare.