Name: In-Nucleus Hi-C nelle cellule di Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: Impara il protocollo in-nucleus Hi-C per mappare le interazioni cromatiniche ad alta risoluzione in Drosophila. Questo metodo combina editing genetico CRISPR/Cas9 per studiare il ruolo dei siti di legame delle proteine architetturali ai confini dei domini topologicamente associati.

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Questo lavoro è stato supportato dal numero di sovvenzione DELL'UNAM Technology Innovation and Research Support Program (PAPIIT) IN207319 e dal numero di sovvenzione del Consiglio nazionale della scienza e della tecnologia (CONACyT-FORDECyT) 303068. A.E.-L. è uno studente di master supportato dal Consiglio Nazionale della Scienza e della Tecnologia (CONACyT) CVU numero 968128.

1. Fissazione
<ol><li>Inizia con 10 milioni di cellule Schneider line 2 plus (S2R+) per preparare 17,5 mL di sospensione cellulare in mezzo Schneider contenente il 10% di siero bovino fetale (FBS) a temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Aggiungere formaldeide priva di metanolo per ottenere una concentrazione finale del 2%. Mescolare e incubare per 10 minuti a RT, avendo cura di mescolare ogni minuto. NOTA: La formaldeide è una sostanza chimica pericolosa. Seguire le norme di salute e sicurezza appropriate e lavorare nella cappa aspirante.</li>
	<li>Spegnere la reazione aggiungendo glicina per ottenere una concentrazione finale di 0,125 M e mescolare. Incubare per 5 minuti a RT, seguiti da 15 minuti sul ghiaccio.</li>
	<li>Centrifugare per 400 × g a RT per 5 min e poi per 10 min a 4 °C; scartare il surnatante. Rispenare accuratamente il pellet in 25 ml di soluzione salina fredda tamponata con 1x fosfato.</li>
	<li>Centrifugare a 400 × g per 10 minuti a 4 °C, quindi scartare il surnatante. NOTA: se si continua con il protocollo, andare al passaggio 2.1 per la lisi; in caso contrario, congelare il pellet nel liquido N2 e conservare il pellet a -80 °C.</li>
</ol>2. Lisi
<ol><li>Spesesere le cellule in 1 mL di tampone di lisi ghiacciato (10 mM Tris-HCl, pH 8; 0,2% di tensioattivo non ionico (vedere la Tabella dei materiali);10 mM NaCl; 1x inibitori della proteasi) e regolare il volume a 10 mL con tampone di lisi ghiacciato. Regolare il volume per ottenere una concentrazione di 1 × 106 celle/ml. Incubare su ghiaccio per 30 min, mescolando ogni 2 min invertendo i tubi.</li>
	<li>Centrifugare i nuclei a 300 × g per 5 minuti a 4 °C, quindi scartare con cura il surnatante. Lavare il pellet 1x con 1 mL di tampone di lisi fredda e trasferirlo in un tubo di microcentrifuga. Lavare il pellet 1x con 1 mL di buffer di restrizione freddo 1,25x e risusciere ogni pellet di cella in 360 μL di tampone di restrizione 1,25x.</li>
	<li>Aggiungere 11 μL di sodio dodecil solfato (SDS) al 10% per tubo (concentrazione finale dello 0,3%), mescolare accuratamente mediante pipettaggio e incubare a 37 °C per 45 minuti, agitando a 700-950 giri/min. Pipettare su e giù per interrompere i grumi un paio di volte durante l'incubazione.</li>
	<li>Spegnere la SDS aggiungendo 75 μL di tensioattivo non ionico (soluzione al 10%, vedere la Tabella dei materiali)per tubo (concentrazione finale dell'1,6%) e incubare a 37 °C per 45 min, agitando a 950 giri/min. Pipettare su e giù un paio di volte per interrompere i grumi durante l'incubazione. NOTA: se i grumi sono grandi e difficili da interrompere, ridurre la velocità di rotazione a 400 giri / min durante i trattamenti SDS e tensioattivi. Se i grumi sono difficili da disaggregare mediante pipettaggio, dividere il campione in due; regolare i volumi di buffer di restrizione, SDS e tensioattivo; e procedere con la permeabilizzazione. Quindi, ruotare i nuclei alla velocità minima (200 × g),scartare con cura il surnatante, raggruppare i campioni insieme in un buffer di restrizione 1X e procedere con la digestione. Prelevare un'aliquota di 10 μL come campione non digerito (UD).</li>
</ol>3. Digestione enzimatica
<ol><li>Digerire la cromatina aggiungendo 200 unità (U) di Mbo I per tubo e incubare a 37 °C per un periodo che va da 4 ore a una notte durante la rotazione (950 giri/min).</li>
	<li>Il giorno successivo, aggiungere altri 50 U di Mbo I per tubo e incubare a 37 °C per 2 ore durante la rotazione (950 giri/min).</li>
	<li>Inattivare l'enzima incubando i tubi a 60 °C per 20 min. Posizionare i tubi sul ghiaccio. NOTA: Prelevare un'aliquota di 10 μL come campione digerito (D).</li>
</ol>4. La biotinilazione delle estremità del DNA
<ol><li>Per riempire le sporgenze del frammento di restrizione ed etichettare le estremità del DNA con biotina, aggiungere 1,5 μL ciascuno di 10 mM dCTP, dGTP, dTTP, 20 μL di 0,4 mM di biotina dATP, 17,5 μL di tampone Tris a basso EDTA (TLE) [10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0] e 10 μL di 5 U / μL di Klenow (DNA polimerasi I grande frammento) a tutti i tubi. Mescolare con cura e incubare per 75 minuti a 37 °C. Agitare a 700 giri / min ogni 10 s per 30 s. Posizionare tutti i tubi sul ghiaccio mentre si prepara la miscela di legatura.</li>
</ol>5. Legatura
<ol><li>Trasferire ogni miscela di cromatina digerita in un tubo separato da 1 mL con miscela di legatura (100 μL di tampone di legatura 10x, 10 μL di albumina sierica bovina da 10 mg/mL, 15 U di DNA ligasi T4 e 425 μL di acqua a doppia distillazione [ddH2O]). Mescolare accuratamente con un leggero pipettaggio e incubare durante la notte a 16 °C.</li>
</ol>6. Inversione del reticolare e purificazione del DNA
<ol><li>Degradare le proteine aggiungendo 50 μL di 10 mg/mL di proteinasi K per tubo e incubare a 37 °C per 2 ore. Invertire i collegamenti incrociati aumentando la temperatura a 65 °C e incubare durante la notte.</li>
	<li>Degradare l'RNA aggiungendo 20 μL di 10 mg/mL di RNasi A e incubare a 37 °C per 1 ora.</li>
	<li>Eseguire l'estrazione del fenolo:cloroformio seguita dalla precipitazione dell'etanolo.<ol>
<li>Aggiungere 1 volume di fenolo-cloroformio e mescolare accuratamente per inversione per ottenere una fase bianca omogenea. NOTA: Il fenolo è una sostanza chimica pericolosa. Seguire le norme di salute e sicurezza appropriate. Lavora nella cappa aspirante.</li>
		<li>Centrifuga a 15.000 × g per 15 min. Trasferire la fase acquosa in un tubo microcentrifuga fresco da 2 ml. Eseguire una retro-estrazione dello strato inferiore con 100 μL di tampone TLE e trasferire la fase acquosa nello stesso tubo da 2 mL.</li>
		<li>Precipitare il DNA aggiungendo 2 volumi di alcol etilico al 100% (EtOH), 0,1 volumi di acetato di sodio 3 M e 2 μL di glicogeno da 20 mg/mL. Incubare a -20 °C per un periodo che va dalle 2 ore alla notte.</li>
		<li>Girare a 15.000 × g per 30 minuti a 4 °C e lavare il pellet 2 volte con etOH al 70% ghiacciato. Asciugare i pellet a RT e ricaspenare in 100 μL di tampone TLE. Quantificare il DNA utilizzando un colorante fluorogenico che si lega selettivamente al DNA e un fluorometro secondo le istruzioni del produttore (Tabella dei materiali). NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui. Conservare i prodotti di legatura a 4 °C per il breve periodo o a -20 °C a lungo termine. Utilizzare un'aliquota (100 ng) del materiale come campione legato (L) per il controllo di qualità.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Valuta la qualità del modello Hi-C
<ol><li>Controlli qualitativi di digestione e legatura<ol>
<li>Purificare il DNA dalle aliquote UD e D invertendo i collegamenti incrociati ed eseguire l'estrazione fenolo:cloroformio e la precipitazione dell'etanolo come descritto sopra.</li>
		<li>Caricare 100 ng di campioni UD, D e L in un gel di acarosio all'1,5%. Cerca uno striscio centrato intorno a 500 bp nel campione D rispetto a una banda ad alto peso molecolare per il campione L (vedi risultati rappresentativi).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Controllo quantitativo dell'efficienza digestiva NOTA: per valutare l'efficienza della digestione in modo più accurato, utilizzare i campioni UD e D come modelli per eseguire reazioni quantitative a catena della polimerasi (qPCR) utilizzando primer progettati come segue.<ol>
<li>Progettare una coppia di primer che amplifichi un frammento di DNA contenente il sito di restrizione del DNA per l'enzima utilizzato per la digestione (Mbo I nel presente protocollo), chiamato R nella formula nel passaggio 7.2.3.</li>
		<li>Progettare una coppia di primer che amplifichi un frammento di DNA di controllo che non contiene il sito di restrizione per l'enzima utilizzato per la digestione (Mbo I per il presente protocollo), chiamato C nella formula nel passaggio 7.2.3.</li>
		<li>Utilizzare i valori di soglia del ciclo (valori Ct) dell'amplificazione per calcolare l'efficienza di restrizione secondo la formula mostrata di seguito: % Restrizione = 100 - 100/2{(CtR - CtC)D - (CtR - CtC)UD} Dove CtR si riferisce al valore Ct del frammento R e CtC si riferisce al valore Ct del frammento C per il campione D e il campione UD. NOTA: la percentuale di restrizione riflette l'efficienza dell'enzima di restrizione che scinde il frammento di DNA (R) ristretto rispetto a un frammento di DNA di controllo (C) che non contiene il sito del DNA di restrizione. Si raccomanda un'efficienza di restrizione dell'≥ dell'80%.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rilevamento di interazioni note<ol>
<li>Eseguire la PCR per amplificare un controllo di legatura interno per esaminare le interazioni a corto raggio e/ o medio o lungo raggio (vedere risultati rappresentativi).</li>
		<li>In alternativa, progettare primer per amplificare un prodotto di legatura in cui i primer sono in orientamento avanti-avanti o indietro-indietro in frammenti di restrizione adiacenti.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Controllo del riempimento e dell'etichettatura della biotina<ol>
<li>Verificare la marcatura Hi-C e l'efficienza di legatura mediante amplificazione e digestione di un'interazione nota o di un prodotto di legatura tra frammenti di restrizione adiacenti nel genoma, come descritto sopra. NOTA: Il riempimento e la legatura riusciti del sito Mbo I (GATC) generano un nuovo sito per l'enzima di restrizione Cla I (ATCGAT) alla giunzione di legatura e rigenerano il sito Mbo I.</li>
		<li>Digerire il prodotto PCR con Mbo I, Cla I o entrambi. Dopo aver eseguito i campioni su un gel all'1,5-2%, stimare il numero relativo di giunzioni di legatura 3C e Hi-C quantificando l'intensità delle bande tagliate e nontagliate 26. NOTA: si desidera un'efficienza del > il 70% (vedere risultati rappresentativi).</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. Sonicazione
<ol><li>Sonicare i campioni per ottenere frammenti di DNA da 200-500 bp. Per lo strumento utilizzato in questo protocollo (vedi tabella dei materiali),diluire il campione (da 5 a 10 μg) in 130 μL di ddH2O per tubo e impostare lo strumento su sonicare a 400 bp: livello di riempimento: 10; fattore di dazio: 10%; potenza incidente di picco (w): 140; cicli per scoppio: 200; tempo (i): 80.</li>
</ol>9. Rimozione della biotina / riparazione finale
NOTA: I passaggi mostrati di seguito sono regolati per 5 μg di DNA Hi-C.
<ol><li>Per eseguire la rimozione della biotina, trasferire il campione (130 μL) in un tubo microcentrifuga fresco. Aggiungere 16 μL di tampone di legatura 10x, 2 μL di dATP 10 mM, 5 μL di T4 DNA polimerasi (15U) e 7 μL di ddH2O (160 μL di volume totale). Incubare a 20 °C per 30 min.</li>
	<li>Aggiungere 5 μL di 10 mM dNTPs, 4 μL di tampone di legatura 10x, 5 μL di polinucleotide chinasi T4 (10 U/μL), 1 μL di Klenow e 25 μL di ddH2O (200 μL di volume totale). Incubare a 20 °C per 30 min.</li>
</ol>10. Selezione delle dimensioni
<ol><li>Per selezionare frammenti per lo più nell'intervallo di dimensioni 250-550 bp, eseguire la selezione sequenziale delle dimensioni dell'immobilizzazione reversibile in fase solida (SPRI) prima con 0,6x, seguita da 0,90x secondo le istruzioni del produttore, ed eluire il DNA utilizzando 100 μL di TLE.</li>
</ol>11. Pulldown di biotina / A-tailing / legatura dell'adattatore
NOTA: Eseguire i lavaggi risussoscendendo le perle magnetiche vorticosamente, ruotare i campioni per 3 minuti su una ruota rotante, quindi ruotare brevemente il campione e posizionarlo sul supporto magnetico. Lasciare che le pere si attacchino al magnete, scartare il surnatante e procedere con la successiva fase di lavaggio. Eseguire i lavaggi a 55 °C su un termoblotto con rotazione al posto della ruota rotante.
<ol><li>Portare il volume finale a 300 μL per campione con TLE per il pull-down. Preparare i tamponi per il lavaggio delle perle: 1x Tween Buffer (TB) (TB: 5 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl, 0,05% Tween), 0,5x TB, 1x Tampone No-Tween (NTB) (5 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl), 2x NTB.</li>
	<li>Utilizzare 150 μL di perle magnetiche legate alla streptavitina (vedere la Tabella dei materiali)per biblioteca. Lavare le perle 2x con 400 μL di 1x TB. Quindi sospendare le perle in 300 μL 2x NTB.</li>
	<li>Mescolare le perle con il materiale Hi-C da 300 μL e incubare a RT per 30 minuti su una ruota rotante per consentire il legame della biotina alle perle di streptavicina.</li>
	<li>Lavare le perle con 400 μL di 0,5x TB e incubare a 55 °C per 3 min, ruotando a 750 giri/min. Lavare le perle in 200 μL di 1x buffer di restrizione.</li>
	<li>Riespendare le perle in 100 μL di miscela di coda dATP (5 μL di 10 mM dATP, 10 μL di tampone di restrizione 10x, 5 μL di Klenow exo- e 80 μL di ddH2O). Incubare a 37 °C per 30 min.</li>
	<li>Rimuovere il surnatante, lavare le perle 2x con 400 μL di 0,5x TB incubando a 55 °C per 3 min e ruotando a 750 rpm.</li>
	<li>Lavare le perle con 400 μL di 1x NTB e poi con 100 μL di 1x tampone di legatura.</li>
	<li>Risuscimere le perle in 50 μL di tampone di legatura 1x e trasferire la sospensione in un nuovo tubo. Aggiungere 4 μL di adattatori in PE preittidati (15 μM di stock) e 2 μL di T4 ligasi (400 U/μL, cioè 800 U/tubo); incubare a RT per 2 ore. NOTA: Pre-ricottura degli adattatori aggiungendo volumi uguali di entrambi gli adattatori PE 1.0 e PE 2.0 (stock da 30 μM) e incubando per 10 minuti a RT (vedi la Tabella dei materiali).</li>
	<li>Ricatturisci le perle rimuovendo il surnatante e lavando le perle 2x con 400 μL di TB. Lavare le perle con 200 μL di 1x NTB, quindi con 100 μL di 1x buffer di restrizione, e risospendare le perle in 40 μL di 1x buffer di restrizione.</li>
</ol>12. Amplificazione PCR
<ol><li>Impostare PCR di 25 μL di volume con 5, 6, 7 e 8 cicli. Per ogni PCR, utilizzare:<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Ricetta di reazione</td>
			</tr>
<tr>
<td>Pere Hi-C</td>
				<td>2,5 μL</td>
			</tr>
<tr>
<td>10 μM PE PCR primer 1 (Tabella dei materiali)</td>
				<td>0,75 μL</td>
			</tr>
<tr>
<td>10 μM PE PCR primer 2 (Tabella dei materiali)</td>
				<td>0,75 μL</td>
			</tr>
<tr>
<td>10 mM dNTP</td>
				<td>0,6 μL</td>
			</tr>
<tr>
<td>5x tampone di reazione</td>
				<td>5 μL</td>
			</tr>
<tr>
<td>DNA polimerasi</td>
				<td>0,3 μL</td>
			</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
				<td>14,65 μL</td>
			</tr>
<tr>
<td>Totale</td>
				<td>25 μL</td>
			</tr>
</tbody></table>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Cicli</td>
				<td>Temperatura</td>
				<td>Ore</td>
			</tr>
<tr>
<td>1</td>
				<td>98 °C</td>
				<td>30 anni</td>
			</tr>
<tr>
<td rowspan="3">n cicli</td>
				<td>98 °C</td>
				<td>10 s</td>
			</tr>
<tr>
<td>65 °C</td>
				<td>30 anni</td>
			</tr>
<tr>
<td>72 °C</td>
				<td>30 anni</td>
			</tr>
<tr>
<td>1</td>
				<td>72 °C</td>
				<td>7 minuti</td>
			</tr>
</tbody></table>
</li>
</ol>13. Amplificazione PCR finale
<ol><li>Eseguire l'amplificazione PCR finale utilizzando le stesse condizioni sopra descritte e il numero di cicli selezionati. Dividere il campione utilizzando 5 μL di perle Hi-C come modello in reazioni da 50 μL.</li>
	<li>Raccogliere tutte le reazioni PCR e trasferirle in un tubo fresco. Utilizzare il magnete per rimuovere le pere di streptavitina e recuperare il surnatante (prodotti PCR). Trasferire le perle in un tubo fresco, lavare le perle come indicato al punto 11.2.9 e conservare in 1x buffer di restrizione a 4 °C come backup.</li>
	<li>Purificare i prodotti PCR utilizzando 0,85 volte il volume delle perle SPRI secondo le istruzioni del produttore. Elute con 30 μL di tampone TLE.</li>
	<li>Quantificare la libreria Hi-C utilizzando uno strumento fluorometrico e confermare la qualità della libreria mediante elettroforesi capillare basata su chip.</li>
	<li>Come ultimo punto di controllo di qualità, utilizzare 1 μL della libreria Hi-C come modello per eseguire una reazione PCR utilizzando 10 cicli utilizzando le stesse condizioni descritte nel passaggio 12.1. Dividere il prodotto PCR in due tubi microcentrifuga: digerire uno con Cla I e lasciare l'altro non digerito come controllo. Eseguire i prodotti in un gel di acarosio all'1,5-2% (vedere risultati rappresentativi).</li>
	<li>Procedere al sequenziamento accoppiato a 50 bp o 75 bp su una piattaforma di sequenziamento adeguata.</li>
</ol>

<ol><li>Cremer, T., Cremer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+territories%2C+nuclear+architecture+and+gene+regulation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Genetics%22%5BJournal%5D)">Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells.</a> Nature Review Genetics. 2, 292-301 (2001).</li>
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<li>Van Bortle, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulator+function+and+topological+domain+border+strength+scale+with+architectural+protein+occupancy%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Insulator function and topological domain border strength scale with architectural protein occupancy.</a> Genome Biology. 15, 82(2014).</li>
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<li>Ulianov, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+chromatin+and+transcription+play+a+key+role+in+chromosome+partitioning+into+topologically+associating+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Active chromatin and transcription play a key role in chromosome partitioning into topologically associating domains.</a> Genome Research. 26, 70-84 (2016).</li>
<li>Rowley, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionarily+conserved+principles+predict+3D+chromatin+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Evolutionarily conserved principles predict 3D chromatin organization.</a> Molecular Cell. 67, 837-852 (2017).</li>
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<li>Gavrilov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disclosure+of+a+structural+milieu+for+the+proximity+ligation+reveals+the+elusive+nature+of+an+active+chromatin+hub%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Disclosure of a structural milieu for the proximity ligation reveals the elusive nature of an active chromatin hub.</a> Nucleic Acids Research. 41, 3563-3575 (2013).</li>
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<li>Wingett, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HiCUP%3A+pipeline+for+mapping+and+processing+Hi-C+data%5BTitle%5D)+AND+%22F1000+Research%22%5BJournal%5D)">HiCUP: pipeline for mapping and processing Hi-C data.</a> F1000 Research. 4, 1310(2015).</li>
<li>Imakaev, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iterative+correction+of+Hi-C+data+reveals+hallmarks+of+chromosome+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Iterative correction of Hi-C data reveals hallmarks of chromosome organization.</a> Nature Methods. 9 (10), 999-1003 (2012).</li>
<li>Akdemir, K. C., Chin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HiCPlotter+integrates+genomic+data+with+interaction+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biolog%22%5BJournal%5D)">HiCPlotter integrates genomic data with interaction matrices.</a> Genome Biolog. 16, 198(2015).</li>
<li>Ramirez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+TADs+reveal+DNA+sequences+underlying+genome+organization+in+flies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">High-resolution TADs reveal DNA sequences underlying genome organization in flies.</a> Nature Communications. 9, 189(2018).</li>
<li>Ando-Kuri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global+and+promoter-centric+3D+genome+organization+temporally+resolved+during+a+circadian+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">The global and promoter-centric 3D genome organization temporally resolved during a circadian cycle.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Cuellar-Partida, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+priors+for+identifying+active+transcription+factor+binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Epigenetic priors for identifying active transcription factor binding sites.</a> Bioinformatics. 28 (1), 56-62 (2012).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model-based+analysis+of+ChIP-Seq+%28MACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biology. 9, 137(2008).</li>
<li>Ong, C. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28ADP-ribosyl%29ation+regulates+insulator+function+and+intrachromosomal+interactions+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Poly(ADP-ribosyl)ation regulates insulator function and intrachromosomal interactions in Drosophila.</a> Cell. 155 (1), 148-159 (2013).</li>
<li>Fresán, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+insulator+protein+CTCF+regulates+Drosophila+steroidogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">The insulator protein CTCF regulates Drosophila steroidogenesis.</a> Biology Open. 4 (7), 852-857 (2015).</li>
<li>Quinodoz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+promotes+the+formation+of+spatial+compartments+in+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RNA promotes the formation of spatial compartments in the nucleus.</a> Cell. 174, 744-757 (2018).</li>
<li>Olivares-Chauvet, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+pairwise+and+multi-way+chromosomal+conformations+using+chromosomal+walks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Capturing pairwise and multi-way chromosomal conformations using chromosomal walks.</a> Nature. 540 (7632), 296-300 (2016).</li>
<li>Beagrie, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+multi-enhancer+contacts+captured+by+genome+architecture+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Complex multi-enhancer contacts captured by genome architecture mapping.</a> Nature. 543, 519-524 (2017).</li>
<li>Redolfi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DamC+reveals+principles+of+chromatin+folding+in+vivo+without+crosslinking+and+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">DamC reveals principles of chromatin folding in vivo without crosslinking and ligation.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 26, 471-480 (2019).</li>
<li>Maxwell, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HiChIP%3A+efficient+and+sensitive+analysis+of+protein-directed+genome+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">HiChIP: efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture.</a> Nature Methods. 13, 919-922 (2016).</li>
<li>Gao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-BERST%3A+Defining+subnuclear+proteomic+landscapes+at+genomic+elements+with+dCas9-APEX2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">C-BERST: Defining subnuclear proteomic landscapes at genomic elements with dCas9-APEX2.</a> Nature Methods. 15 (6), 433-436 (2018).</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.

Il metodo Hi-C in-nucleus qui presentato ha permesso l'esplorazione dettagliata della topologia del genoma di Drosophila ad alta risoluzione, fornendo una visione delle interazioni genomiche a diverse scale genomiche, dai loop di cromatina tra elementi regolatori come promotori e potenziatori a TAD e identificazione di grandi compartimenti25. La stessa tecnologia è stata applicata in modo efficiente anche ai tessuti dei mammiferi con alcune modifiche33. Ad esempio, quando s...

Negli eucarioti, il genoma è diviso in cromosomi che occupano territori specifici nello spazio nucleare durante l'interfase1. La cromatina che forma i cromosomi può essere divisa in due stati principali: uno di cromatina accessibile che è trascrizionalmente permissiva e l'altro di cromatina compatta che è trascrizionalmente repressiva. Questi stati di cromatina si segregano e raramente si mescolano nello spazio nucleare, formando due compartimenti distinti nel nucleo2. Alla scala sub-megabase, i confini separano i domini delle interazioni cromatiniche ad alta frequenza, chiamati TAD, che segnano l'organizzazione cromosomica3,4,5. Nei mammiferi, i confini TAD sono occupati dalla coesina e dal fattore di legame CCCTC (CTCF)6,7,8. Il complesso della coesina estrude la cromatina e si ferma nei siti di legame CTCF che vengono disposti in un orientamento convergente nella sequenza genomica per formare anelli di cromatina stabili9,10,13,14. L'interruzione genetica del sito di legame del DNA CTCF ai confini o la riduzione dell'abbondanza di CTCF e della proteina coesina provoca interazioni anormali tra elementi regolatori, perdita di formazione di TAD e derregolazione dell'espressionegenica 9,10,11,13,14.
In Drosophila, i confini tra i TAD sono occupati da diversi AP, tra cui il fattore 32 kDa associato all'elemento limite (BEAF-32), la proteina legante Motif 1 (M1BP), la proteina centrosomiale 190 (CP190), soppressore dell'ala pelosa (SuHW) e CTCF, e sono arricchiti in modificazioni isoniche attive e polimerasi II16,17,18. È stato suggerito che in Drosophila, i TAD appaiono come conseguenza della trascrizione13,17, 19e l'esattoruolodegli AP indipendenti nella formazione dei confini e nelle proprietà di isolamento è ancora in fase di studio. Pertanto, se i domini in Drosophila sono l'unica conseguenza dell'aggregazione di regioni di stati trascrizionali simili o se gli AP, incluso il CTCF, contribuiscono alla formazione dei confini rimane da caratterizzare completamente. L'esplorazione dei contatti genomici ad alta risoluzione è stata possibile attraverso lo sviluppo di tecnologie di cattura della conformazione cromosomica abbinate al sequenziamento di nuova generazione. Il protocollo Hi-C è stato descritto per la prima volta con la fase di legatura eseguita "insoluzione" 2 nel tentativo di evitare prodotti di legatura spuri tra frammenti di cromatina. Tuttavia, diversi studi hanno indicato la realizzazione che il segnale utile nei dati proveniva da prodotti di legatura formati in nuclei parzialmente llysed che non erano insoluzione 20,21.
Il protocollo è stato quindi modificato per eseguire la legatura all'interno del nucleo come parte dell'esperimento Hi-C a cellula singola22. Il protocollo Hi-C in-nucleus è stato successivamente incorporato nella popolazione cellulare Hi-C per produrre una copertura più coerente su tutta la gamma di distanze genomiche e produrre dati con meno rumore tecnico23,24. Il protocollo, qui descritto in dettaglio, si basa sul protocollo Hi-C23, 24 in-nucleus di popolazione ed è stato utilizzato per studiare le conseguenze della rimozione genetica di motivi leganti il DNA per CTCF e M1BP da un confine di dominio al locus del gene Notch in Drosophila25. I risultati mostrano che l'alterazione dei motivi di legame del DNA per gli AP al confine ha conseguenze drastiche per la formazione del dominio di Notch, difetti topologici più grandi nelle regioni che circondano il locus di Notch e la derregolazione dell'espressione genica. Ciò indica che gli elementi genetici ai confini del dominio sono importanti per il mantenimento della topologia del genoma e dell'espressione genica in Drosophila25.

<table><tbody><tr><td>Soluzione di paraformaldeide al 16% (vol/vol)</td><td>Agar Scientific</td><td>R1026</td><td></td></tr><tr><td>Biotina-14-dATP</td><td>Invitrogen</td><td>CA1524-016</td><td></td></tr><tr><td>Enzima ClaI</td><td>NEB</td><td>R0197S</td><td></td></tr><tr><td>COVARIS Ultrasuonatore</td><td>Covaris</td><td>LE220-M220</td><td></td></tr><tr><td>Cut Smart</td><td>NEB</td><td>B72002S</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 1x</td><td>Life Technologies</td><td>41965-039</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptabidin C1</td><td>Invitrogen</td><td>65002</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS) filtrato sterile</td><td>Sigma</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Klenow Dna PolI grande frammento</td><td>NEB</td><td>M0210L</td><td></td></tr><tr><td>Klenow exo(-)</td><td>NEB</td><td>M0210S Tampone</td><td></td></tr><tr><td>di legatura</td><td>NEB</td><td>B020S</td><td></td></tr><tr><td>Enzima MboI</td><td>NEB</td><td>R0147M</td><td></td></tr><tr><td>NP40-Igepal</td><td>SIGMA</td><td>CA-420</td><td>Tensioattivo non ionico per l'aggiunta in tampone di lisi</td></tr><tr><td>Adattatore PE 1.0</td><td>Illumina</td><td>5'-P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAG GAATGCCGAG-3'PE</td><td></td></tr> <tr><td>adattatore 2.0</td><td>Illumina</td><td>5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCT CTTCCGATCT-3'PE</td><td></td></tr> <tr><td>PCR primer 1.0</td><td>Illumina</td><td>5'-AATGATACGGCGACCACCGAGAT CTACACTCTTTCCCTACACGACG CTCTTCCGATCT-3'PE</td><td></td></tr> <tr><td>PCR primer 2.0</td><td>Illumina</td><td>5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG ATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGA ACCGCTCTTCCGATCTCT-3'Fenolo</td><td></td></tr><tr><td>: Cloroformio:Alcool isoamilico 25:24:1</td><td>SIGMA</td><td>P2069</td><td></td></tr><tr><td>Primer 1 (interazione nota, Figura 2A)</td><td>Sigma</td><td>5'-TCGCGGTAATTTTGCGTTTGA-3'Primer</td><td></td></tr> <tr><td>2 (interazioni note, Figura 2A)</td><td>Sigma</td><td>5'-CCTCCCTGCCAAAACGTTTT-3'Compresse</td><td></td></tr> <tr><td>da cocktail con inibitore della proteasi</td><td>Roche</td><td>4693132001</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasi K</td><td>Roche</td><td>3115879001</td><td></td></tr><tr><td>Qubit</td><td>ThermoFisher</td><td>Q33327</td><td></td></tr><tr><td>RNAsi</td><td>Roche</td><td>10109142001</td><td></td></tr><tr><td>SPRI Perline</td><td>Beckman</td><td>B23318</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligasi</td><td>Invitrogen</td><td>15224-025</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA polimerasi</td><td>NEB</td><td>M0203S</td><td></td></tr><tr><td>T4 polinucleotide chinasi (PNK)&nbsp;</td><td>NEB</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>TaqPhusion</td><td>NEB</td><td>M0530S</td><td>DNA polimerasi</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td></td><td></td><td>Tensioattivo non ionico per l'estinzione di SDS</td></tr></tbody></table>

in-nucleus hi-c nelle cellule di drosophila

In-Nucleus Hi-C in Drosophila Cells

Il genoma è organizzato in domini topologicamente associanti (TAD) delimitati da confini che isolano le interazioni tra domini. In Drosophila, i meccanismi alla base della formazione e dei confini di TAD sono ancora in fase di studio. L'applicazione del metodo Hi-C nel nucleo qui descritto ha contribuito a sezionare la funzione dei siti di legame delle proteine architetturali (AP) ai confini TAD isolando il gene Notch. La modificazione genetica dei confini di dominio che causano la perdita di AP provoca la fusione TAD, difetti trascrizionali e alterazioni topologiche a lungo raggio. Questi risultati hanno fornito prove che dimostrano il contributo degli elementi genetici alla formazione dei confini del dominio e al controllo dell'espressione genica in Drosophila. Qui, il metodo Hi-C in-nucleus è stato descritto in dettaglio, che fornisce importanti punti di controllo per valutare la qualità dell'esperimento insieme al protocollo. Vengono inoltre mostrati i numeri richiesti di letture di sequenziamento e coppie Hi-C valide per analizzare le interazioni genomiche a diverse scale genomiche. L'editing genetico mediato da CRISPR/Cas9 di elementi regolatori e la profilazione ad alta risoluzione delle interazioni genomiche utilizzando questo protocollo Hi-C in-nucleus potrebbero essere una potente combinazione per lo studio della funzione strutturale degli elementi genetici.

Di seguito sono descritti i risultati di un protocollo Hi-C di successo (vedere un riepilogo del flusso di lavoro del protocollo Hi-C nella Figura 1A). Ci sono diversi punti di controllo della qualità durante l'esperimento Hi-C in-nucleus. Le aliquote del campione sono state raccolte prima (UD) e dopo (D) la fase di restrizione della cromatina e dopo la legatura (L). I collegamenti incrociati sono stati invertiti e il DNA è stato purificato eseguito su un gel di agarosio. Uno striscio di 200...

Il genoma è organizzato nello spazio nucleare in diverse strutture che possono essere rivelate attraverso tecnologie di cattura della conformazione cromosomica. Il metodo Hi-C in-nucleus fornisce una raccolta a livello di genoma di interazioni cromatiniche nelle linee cellulari di Drosophila, che genera mappe di contatto che possono essere esplorate a risoluzione megabase a livello di frammento di restrizione.

In-Nucleus Hi-C nelle cellule di Drosophila

The genome is organized into topologically associating domains (TADs) delimited by boundaries that isolate interactions between domains. In Drosophila, ...

I protocolli Hi-C del nucleo consentono l'esplorazione della conferma cromosomica a diversa risoluzione per la caratterizzazione di loop, domini e compartimenti cromatici che organizzano il genoma. Questo protocollo fornisce una profilazione ad alta risoluzione delle interazioni genomiche a diverse scale, producendo una copertura più coerente sull'intera gamma di distanze genomiche e dati con meno rumore tecnico. La combinazione di questo protocollo con l'editing genetico è una potente strategia per testare la funzione strutturale degli elementi genetici.Può anche essere applicato alla caratterizzazione delle variazioni strutturali che portano alla malattia. Il protocollo Hi-C del nucleo può essere applicato per esplorare l'organizzazione del genoma di qualsiasi genoma eucariotico. Il trattamento SDS e Triton disaggrega eventuali grumi nucleari mediante pipettaggio poiché gli aggregati interferiscono con l'efficienza della reazione enzimatica e assicurarsi di eseguire la misura di controllo di qualità appropriata prima del sequenziamento.Iniziare aggiungendo formaldeide priva di metanolo a una volta 10 alle sette cellule Di Drosophila Line 2 Plus di Schneider in 17,5 millilitri di mezzo Schneider integrate con il 10% FBS a una concentrazione finale del 2%Incubare le cellule per 10 minuti a temperatura ambiente mescolando ogni 60 secondi o su una ruota rotante e aggiungere glicina a una concentrazione finale di 0,125 molari con la miscelazione. Dopo cinque minuti a temperatura ambiente e 15 minuti su ghiaccio, raccogliere le cellule mediante centrifugazione e risusciere accuratamente il pellet in 25 millilitri di PBS freddo e raccogliere le celle con un'altra centrifugazione. Alla fine della centrifugazione, risuscise le cellule in un millilitro di tampone di lisi ghiacciata per il conteggio e regola le cellule a una volta 10 alla concentrazione di sei celle per millilitro.Incubare le cellule sul ghiaccio per 30 minuti, invertendo il tubo ogni due minuti per mescolare e raccogliere le cellule con un'altra centrifugazione. Risuspenare il pellet in un millilitro di tampone di lisi ghiacciata fresca. Dopo la centrifugazione, lavare il lisato con un millilitro di tampone di restrizione 1,25X.Centrifugare nuovamente per raccogliere il lisi. Rinsociempere il pellet in 360 microlitri di tampone di restrizione fresco e 11 microlitri di 10% SDS con un accurato pipettaggio e incubare per 45 minuti a 37 gradi Celsius e da 7 a 950 giri al minuto con pipettaggio occasionale. Al termine dell'incubazione, interrompere la permeabilizzazione con 75 microlitri di tensioattivo non ionico e riportare il tubo all'incubatore per ulteriori 45 minuti con agitazione a 950 giri al minuto con pipettaggio occasionale.Per la digestione della cromatina, aggiungere 200 unità di Mbo1 al tubo per un'incubazione da quattro a 16 ore a 37 gradi Celsius con rotazione. Alla fine dell'incubazione, inattivare l'enzima con incubazione di 20 minuti a 60 gradi Celsius. Per riempire le sporgenze del frammento di restrizione ed etichettare le estremità del DNA con biotina, aggiungere 1,5 microlitri ciascuno di 10 millimolari dCTP, dGTP, dTTP, 20 microlitri di 0,4 millimolari biotina dATP, 17,5 microlitri di tris basso tampone EDTA e 10 microlitri di cinque unità per microlitro di DNA polimerasi un grande frammento al tubo con un'attenta miscelazione.Incubare la reazione per 75 minuti a 37 gradi Celsius con agitazione a 700 giri al minuto ogni 10 secondi per 30 secondi. Alla fine dell'incubazione, aggiungere la miscela di legatura alla cromatina e regolarla a un millilitro di volume di reazione finale con un'accurata miscelazione delicata e incubare durante la notte a 16 gradi Celsius. Per degradare le proteine del campione, aggiungere 50 microlitri di 10 milligrammi per millilitro proteinasi K al tubo per un'incubazione di due ore a 37 gradi Celsius.Alla fine dell'incubazione, aumentare la temperatura a 65 gradi Celsius durante la notte per invertire la reticolazione del campione. La mattina successiva, degradare l'RNA con 10 microlitri da 10 milligrammi per millilitro RNAsi A.Dopo un'ora a 37 gradi Celsius, aggiungere un volume di cloroformio fenolica al tubo e mescolare accuratamente per inversione per ottenere una fase bianca omogenea. Dopo aver precipitato il DNA secondo protocolli standard, quantificare il DNA utilizzando un colorante fluorogenico che si lega selettivamente al DNA e un fluorometro secondo le istruzioni del produttore.Per purificare il DNA da aliquote non digerite e digerite, caricare 100 nanogrammi di campioni non digeriti, digeriti e ligati su un gel di agarosio all'1,5% e cercare uno striscio centrato su 500 coppie di basi nel campione digerito rispetto a una banda ad alto peso molecolare per il campione legato. Per verificare l'efficienza di marcatura e legatura Hi-C mediante amplificazione e digestione di un'interazione nota, dopo PCR, digerire i prodotti con Mbo1, Cla1 o entrambi ed eseguire i campioni su un nuovo gel da 1,5 a 2% per consentire la stima del numero relativo di giunzioni di legatura 3C e Hi-C. Dopo aver sonicato il campione per ottenere da 200 a 500 frammenti di DNA a coppia di basi, trasferire 130 microlitri con cinque microgrammi di DNA da ciascun campione in nuovi tubi microcentrifuga contenenti 16 microlitri di tampone di legatura 10X, due microlitri di dATP da 10 millimolari, cinque microlitri di DNA polimerasi T4 e sette microlitri di acqua doppia distillata per un'incubazione di 30 minuti a 20 gradi Celsius.Alla fine dell'incubazione, aggiungere cinque microlitri di 10 dNTP millimolari, quattro microlitri di tampone di legatura 10X, cinque microlitri di polinucleotide chinasi T4, un microlitro di DNA polimerasi un grande frammento e 25 microlitri di acqua doppia distillata ai tubi per una seconda incubazione di 30 minuti a 20 gradi Celsius. Per selezionare i frammenti principalmente nell'intervallo di dimensioni della coppia di basi da 250 a 550, eseguire la selezione sequenziale della fase solida reversibile e della dimensione di mobilizzazione con 0,6X, quindi 0,9X secondo le istruzioni del produttore ed eluire il DNA con 100 microlitri di tris basso EDTA. Per il pulldown della biotina per ogni libreria, lavare 150 microlitri di perle magnetiche legate alla streptavitina due volte con 400 microlitri di tampone 1X Tween e ruotare i campioni per tre minuti su una ruota rotante.Al termine dell'incubazione, rispesciare le perle in 300 microlitri di tampone 2X no Tween e mescolarle con 300 microlitri di materiale Hi-C per una rotazione di 30 minuti su una ruota rotante. Alla fine dell'incubazione, lavare le perle con 400 microlitri di tampone 0,5X Tween per un'incubazione di tre minuti a 55 gradi Celsius e 750 giri al minuto, seguiti da due lavaggi in 200 microlitri di tampone di restrizione 1X per lavaggio. Dopo il secondo lavaggio, risuscie le perle in 100 microlitri di miscela di coda dATP per un'incubazione di 30 minuti a 37 gradi Celsius.Al termine dell'incubazione, risuscimere le perle in 50 microlitri di tampone di legatura 1X e trasferire la sospensione in un nuovo tubo contenente quattro microlitri accoppiati pre-ricotti accoppiati e due microlitri di T4 ligasi. Dopo due ore a temperatura ambiente, rimuovere il surnatante e lavare le perle due volte con 400 microlitri di buffer Tween, quindi lavare le perle una volta con 200 microlitri di nessun buffer Tween e una volta con 100 microlitri di buffer di restrizione prima di ri-sospendere le perle in 40 microlitri di buffer di restrizione 1X. Uno striscio da 200 a 1.000 coppie di basi si osserva quando la restrizione con Mbo1 ha successo.Se la legatura ha successo, si osserva una fascia ad alto peso molecolare nella parte superiore del gel. L'efficienza della digestione può anche essere confermata dalla PCR quantitativa. Un'efficienza di digestione accettabile è dell'80% o superiore.Come illustrato, l'amplificazione di un'interazione nota a medio raggio nei prodotti di legatura Hi-C può essere stimata mediante digestione del prodotto PCR recuperato nell'amplificazione. Si raccomanda un'efficienza di digestione superiore al 70% per evitare di avere una grande percentuale di letture non utili per le librerie dopo il sequenziamento. Il numero di cicli pcr per l'amplificazione finale dovrebbe essere un ciclo inferiore al numero di cicli per i quali lo striscio è visibile.Il livello di digestione della biblioteca indica l'abbondanza di coppie Hi-C valide e riflette la proporzione di letture utili che si otterranno dalla biblioteca. Utilizzando le coppie Hi-C valide univoche, è possibile eseguire l'analisi di base della distribuzione delle coppie. Come osservato in questo esempio rappresentativo, il locus del gene NOTCH può essere visto insieme alle proteine architettoniche, ai domini uno e due e alle modificazioni istoniche lungo il locus.Dopo la delezione della regione contenente entrambi i siti di legame del DNA CTCF e M1BP, si può osservare un drammatico cambiamento nei contatti con la cromatina. Dopo l'esperimento Hi-C, è possibile eseguire un'comunicazione per raggiungere un insieme specifico di contatti, ad esempio dalle regioni del promotore. Ciò è particolarmente utile quando si valutano genomi di grandi dimensioni.Come dimostrato, la combinazione del protocollo Hi-C con l'aggiunta genetica può essere utilizzata per valutare la funzione strutturale e regolatoria degli elementi genomici.

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Questo protocollo illustra come eseguire immunoistochimica su sezionato larva di Drosophila.

Drosophila larvali NMJ Immunoistochimica

Questo documento dimostra l'uso di una scansione rapida microscopio confocale a comportamenti cella di immagine direttamente attraverso il puparium. Lasciando il bozzolo intatto, questo metodo permette l'osservazione e la misurazione dei processi cellulari dinamiche in una fase di sviluppo Drosophila che è difficile da studiare direttamente.

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Tessuti Drosophila spesso contengono una miscela eterogenea di tipi cellulari. Per esaminare l'espressione genica in specifici tipi cellulari da un particolare tessuto, i nuclei possono essere geneticamente marcato e successivamente isolate utilizzando un approccio basato affinità. Isolato nuclei possono essere utilizzate per applicazioni a valle come l'analisi dell'espressione genica e della cromatina.

L&#39;isolamento a base di affinità di Tagged Nuclei di<em&gt; Drosophila</em&gt; tessuti per Gene Expression Analysis

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