Name: Espianto di tessuto corneale suino per studiare lefficacia degli antivirali Herpes Simplex Virus-1 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Scopri un modello ex vivo di cornea suina per testare l'efficacia di farmaci antivirali contro Herpes Simplex Virus-1. Questo metodo riduce costi e risorse rispetto ai modelli animali tradizionali.

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Questo studio è stato supportato da sovvenzioni NIH (R01 EY024710, RO1 AI139768 e RO1 EY029426) a D.S. A.A. è stato supportato da una sovvenzione F30EY025981 del National Eye Institute, NIH. Lo studio è stato condotto utilizzando le cornee suine ottenute dalla società Park Packing, 4107 Ashland Avenue, New City, Chicago, IL-60609

Tutto il tessuto suino utilizzato in questo studio è stato fornito da un'organizzazione privata di terze parti e nessuna delle manipolazioni degli animali è stata eseguita dal personale dell'Università dell'Illinois a Chicago.
1. Materiali
<ol><li>
Reagenti
	<ol>
<li>Utilizzare i seguenti reagenti per il test della placca: metilcellulosa in polvere, dmEM (Dulbecco's modified eagle' medium), siero bovino fetale (FBS), penicillina e streptomicina (P/S) per il test della placca.</li>
		<li>Utilizzare compresse di cristallo viola ed etanolo (grado di biologia molecolare) per preparare la soluzione di cristallo viola per il test della placca.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vero cell growth media - DMEM whole media
	<ol>
<li>Aprire il flacone DMEM all'interno del cappuccio di coltura del tessuto. Rimuovere 55 ml di media dalla bottiglia usando una pipetta sierologica e scartarla. Aggiungi 50 ml di FBS di P / S a DMEM. Conservare in frigorifero a 4 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Mezzi per il dosaggio della placca - Stock di mezzi metilcellulosa al 5%
	<ol>
<li>Misurare 2,5 g di polvere di metilcellulosa con un magnete di agitazione all'interno di una bottiglia di vetro da 500 ml e autoclave. Dopo che la bottiglia si è raffreddata a temperatura ambiente, prendere 500 mL di dmem intero contenente 50 mL di FBS e 5 mL di P / S e aggiungerlo al flacone di vetro contenente metilcellulosa.</li>
		<li>Mescolare a 4 °C per 2 giorni utilizzando un agitatore magnetico. Conservare in frigorifero a 4 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione dei supporti per la cornea suina asportata
	<ol>
<li>Aprire un flacone MEM (Minimum Essential Media) all'interno del cappuccio di coltura del tessuto. Scartare 10 ml di MEM dalla bottiglia usando una pipetta sierologica.</li>
		<li>Aggiungere 5 mL di insulina-transferrina-selenio (ITS) e 5 ml di antibiotico antimicotico (AA) al fluido e conservare in frigorifero a 4°C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Maestro e stock di lavoro di cristallo viola:
	<ol>
<li>Per preparare la soluzione stock di cristallo viola, aggiungere 1 g di polvere viola cristallina a 100 ml di etanolo al 20% in acqua. Questo stock (1% p / v cristallo viola) può essere conservato e utilizzato fino all'anno se conservato in un luogo buio.</li>
		<li>Per creare uno stock di lavoro da questo, aggiungere 50 ml di soluzione stock originale a 350 ml di acqua. Aggiungere 100 ml di etanolo a questa soluzione per produrre una soluzione di cristallo viola da 500 mL (0,1% p / v di cristallo viola). NOTA: entrambe queste soluzioni devono essere conservate al buio.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Procedura
<ol><li>Isolamento delle cornee suini da occhi interi17
	<ol>
<li>Dopo aver ricevuto gli occhi suini da un fornitore adatto, conservare sul ghiaccio se c'è un ritardo con l'elaborazione dei tessuti, come illustrato nella Figura 1.</li>
		<li>Assicurarsi che i dispositivi di protezione individuale siano utilizzati e indossati durante questa procedura per evitare contaminazioni e incidenti da fuoriuscita di umore vitreo.</li>
		<li>Spruzzare l'area di lavoro con etanolo al 70% per pulire e disinfettare. Per garantire che lo spazio di lavoro sia stabile, stendere un coperchio da banco e del nastro adesivo lungo i lati in modo sicuro, come illustrato nella Figura 2.</li>
		<li>Posizionare gli occhi suini sulla garza (Figura 3). Utilizzando una garza da 50 mm, tenere la sezione posteriore (Figura 4A) degli occhi suini come mostrato nella Figura 4B con una mano.</li>
		<li>Con un ago da 30 G, fare delicatamente un singolo colpo approssimativamente al centro della superficie epiteliale dell'occhio con attenzione e assicurarsi che non vi siano danni allo stroma (Figura 5). Il poke deve essere limitato all'epitelio (~100-200 μm) per evitare il coinvolgimento stromale.</li>
		<li>Usando una lama affilata sterilizzata, fai una piccola incisione sulla sclera a 1 mm di distanza dalla cornea. Tagliare il bordo della cornea assicurandosi che l'umore vitreo non perda usando un'azione rotante rapida e liscia della mano (Figura 6A). Tenendo la cornea sul bordo cornea-sclera con una pinzetta piatta, tagliare le restanti membrane di legame dell'occhio usando la lama (Figura 6B).</li>
		<li>Prendi la cornea e mettila in una piastra a 12 pozzetti sovrapposta a 2 ml di mezzo corneale. La cornea deve essere posizionata rivolta verso l'alto, dimostrata in una serie di passaggi nelle Figure 7A-D, Figura 8).</li>
		<li>Aggiungere 5 μL della soluzione virale contenente 5 x 105 unità formanti placche (PFU) di 17 GFP al sito di strigliatura sulla superficie corneale. Posizionare la piastra a 12 pozzetti contenente cornee suini infette in un'incubatrice con il 5% di CO2 per 72 ore.</li>
		<li>Spruzzare eventuali occhi aggiuntivi non utilizzati in esperimento con candeggina al 10% e smaltiti in modo sicuro in sacchetti a rischio biologico.</li>
	</ol></li>
	<li>Visualizzazione NOTA: Il virus deve essere visualizzato ogni giorno prima dell'aggiunta di farmaci.<ol>
<li>Accendere lo stereomicroscopio e la sorgente luminosa a LED e consentire alla lampada della macchina di riscaldarsi prima di immaginare le cornee. Portare con attenzione la piastra di cornee allo strumento senza disturbare la soluzione. Modificare il filtro in modo che GFP (380-460 nm) venga utilizzato per esaminare i campioni. Impostare il tempo di esposizione su 500 ms per acquisire immagini.</li>
		<li>Per prima cosa, posiziona la piastra corneale sotto lo stereoscopio e cattura le immagini con l'ingrandimento più basso di 7,5x. Segui questo con una serie di immagini ad ingrandimento crescente (ad esempio, 15x, 25x, 35x) in modo tale che tutta la diffusione virale e la formazione di dendrite siano visualizzate chiaramente</li>
		<li>Assicurati di riportare le cornee infette nell'incubatore di colture tissutali e salva tutte le immagini che sono state scattate.</li>
	</ol></li>
	<li>Quantificazione dell'infezione da virus NOTA: I titoli dei virus delle cornee suine devono essere valutati ogni giorno per analizzare l'effetto del trattamento farmacologico.<ol>
<li>Per quantificare il virus, seminare cellule Vero ad una densità di 5 x 105 di cellule per pozzo se si utilizza una piastra a 6 pozzetti come fatto in questo esperimento. Fallo un giorno prima dell'infezione. Incubare le cellule placcate durante la notte per assicurarsi che siano confluenti per la quantificazione del virus.</li>
		<li>Aliquota 500 μL di mezzi privi di siero in più tubi microcentrifugati. Inserire un tampone sterile con punta di cotone immerso nei tubi riempiti di supporti privi di siero. I tamponi di cotone devono essere immersi e bagnati per almeno 5 minuti prima dell'uso.</li>
		<li>Senza disturbare il supporto sottostante, trasportare la piastra corneale suina infetta in un armadietto di biosicurezza. Utilizzando i tamponi di cotone bagnati, effettuare 3 giri in senso orario e 3 giri in senso antiorario ad un diametro di 5 mm dal centro della cornea suina infetta senza applicare una pressione eccessiva.</li>
		<li>Inserire di nuovo il batuffolo di cotone nel tubo microcentrifuga riempito con media senza siero e ruotarlo in senso orario e antiorario 5 volte. La punta metallica del batuffolo di cotone deve essere tagliata corta in modo che si adatti interamente al tubo di microcentrifuga e il coperchio possa essere chiuso.</li>
		<li>Posizionare il tubo di microcentrifuga contenente la punta di cotone tamponata su una macchina a vortice e vortice ad alta velocità per 1 minuto.</li>
		<li>Eseguire la quantificazione del virus tramite un test della placca su questi campioni. NOTA: questa fase di quantificazione deve essere eseguita nei giorni 2, 4 e facoltativamente nei giorni 6 successivi all'infezione.</li>
	</ol></li>
	<li>Quantificazione del virus mediante test della placca NOTA: Per eseguire un test della placca, far crescere e placcare le cellule Vero in una piastra a 6 pozzetti e garantire il 90% di confluenza delle cellule prima dell'inizio del test. Utilizzare un pallone confluente di 75 cm2 di queste cellule. Tutti i passaggi seguenti devono essere eseguiti all'interno di un armadio di biosicurezza.<ol>
<li>Lavare il monostrato confluente di cellule Vero nel matraccio con 10 ml di soluzione salina tampone fosfato fresco (PBS) dopo aver aspirato il terreno di coltura. Ripetere nuovamente la fase di lavaggio con PBS dopo aver aspirato la prima serie di soluzioni di lavaggio.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di tripsina allo 0,05% al monostrato cellulare. Incubare il matraccio a 37 °C per 5 min. Ad occhio nudo, assicurarsi che le cellule siano staccate dalla superficie interna del pallone. In caso contrario, attendere altri 5 minuti prima di esaminare nuovamente il pallone. Quando le cellule sembrano essere staccate, aggiungere 9 mL di mezzo intero al monostrato per assicurarsi che le cellule si spostino completamente dalla superficie del pallone.</li>
		<li>Raccogliere tutte le cellule dal pallone insieme all'intero mezzo e metterle in un tubo di centrifuga da 15 ml.</li>
		<li>Per ogni pozzo delle 6 piastre del pozzo utilizzate per il dosaggio della placca, utilizzare 300 μL dal tubo della centrifuga. Ricaricare ogni pozzo della piastra a 6 pozzi con 2 ml di supporto intero. Lasciare le piastre nell'incubatrice durante la notte per consentire loro di crescere e formare un monostrato confluente in ciascun pozzetti.</li>
		<li>Per eseguire un test della placca, eseguire una diluizione seriale dei campioni deve essere condotta prima della quantificazione del virus.</li>
		<li>Eseguire una diluizione log101 volte del virus in tubi di microcentrghifuga utilizzando mezzi privi di siero fino a raggiungere una diluizione di10 -8. Quando a una diluizione 10-3, trasferire 1 mL della diluizione al monostrato di cellule placcate dopo aver aspirato il mezzo di crescita sulle cellule dalla piastra a 6 pozzetti, questa sarà la fase di infezione. Incubare la piastra infetta a 37 °C incubatore per 2 ore.</li>
		<li>Aspirare i mezzi di infezione esistenti, lavare con PBS due volte delicatamente per rivestire le cellule e aggiungere 2 ml di mezzi carichi di metilcellulosa per pozzo a tutti e 6 i pozzi. Incubare per 72 ore o fino a quando non si può vedere la formazione di placche. Le placche possono essere identificate dalla formazione di piccoli spazi tra le cellule nel monostrato cellulare.</li>
		<li>Aggiungere lentamente 1 ml di metanolo all'angolo di ciascun pozzo, usando la parete come punta guida. Incubare la piastra da 6 pozzi a temperatura ambiente per 15 min. Aspirare lentamente il contenuto di ciascun pozzo dalla piastra senza disturbare o agitare il monostrato cellulare.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di soluzione di lavoro viola cristallino a ciascun pozzo di 6 piastre di pozzo, assicurandosi che tutte le celle siano coperte. Incubare la piastra a 6 pozzi al buio per 30 minuti. Scartare la soluzione viola cristallina aspirandola e asciugare i pozzezze su un foglio di carta assorbente.</li>
		<li>Contare bene il numero di placche alla massima diluizione per quantificare il contenuto totale del virus nella soluzione iniziale. Ripeti il processo due volte per confermare il titolo virale.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Liesegang, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+epidemiology+and+ocular+importance%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus epidemiology and ocular importance.</a> Cornea. 20 (1), 1-13 (2001).</li>
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<li>Crumpacker, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+to+antiviral+drugs+of+herpes+simplex+virus+isolated+from+a+patient+treated+with+Acyclovir%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Resistance to antiviral drugs of herpes simplex virus isolated from a patient treated with Acyclovir.</a> New England Journal of Medicine. 306 (6), 343-346 (2010).</li>
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<li>Pescina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al+Development+of+a+convenient+ex+vivo+model+for+the+study+of+the+transcorneal+permeation+of+drugs%3A+Histological+and+permeability+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">et al Development of a convenient ex vivo model for the study of the transcorneal permeation of drugs: Histological and permeability evaluation.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 104, 63-71 (2015).</li>
<li>Jaishankar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+off-target+effect+of+BX795+blocks+herpes+simplex+virus+type+1+infection+of+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">An off-target effect of BX795 blocks herpes simplex virus type 1 infection of the eye.</a> Science Translational Medicine. 10, 5861(2018).</li>
<li>Duggal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+oxide+tetrapods+inhibit+herpes+simplex+virus+infection+of+cultured+corneas%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Zinc oxide tetrapods inhibit herpes simplex virus infection of cultured corneas.</a> Molecular Vision. 23, 26-38 (2017).</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi e nessun interesse finanziario concorrente.

Ricerche precedenti hanno dimostrato che BX795 ha un ruolo promettente come agente antivirale contro l'infezione da HSV-1; inibendo la chinasi 1 (TBK1)16che lega il serbatoio. Sia il TBK1 che l'autofagia hanno svolto un ruolo nell'aiutare a inibire l'infezione da HSV-1 come dimostrato sulle cellule epiteliali corneali umane. BX795 ha dimostrato di essere massimamente efficace con l'attività antivirale ad una concentrazione di 10μM e utilizzando sia l'analisi western blot che l'analisi della placca...

Le persone che soffrono di infezioni oculari spesso incorrono in perdita dellavista 1. Con un'elevata sieroprevalenza in tutto il mondo, gli individui infetti da HSV soffrono di infezioni oculari ricorrenti che portano a cicatrici corneali, cheratite stromale e neovascolarizzazione2,3,4,5. Le infezioni da HSV hanno anche dimostrato di causare meno frequentemente, una serie di condizioni gravi tra i pazienti immunocompromessi e non trattati come l'encefalite e la morbilità sistemica6,7,8. Farmaci come aciclovir (ACV) e i suoi analoghi nucleosidici hanno mostrato un successo costante nel frenare l'infezione da HSV-1 e persino controllare la riattivazione, ma l'uso prolungato di questi farmaci è associato a insufficienza renale, anomalie fetali e incapacità di limitare l'emergere di resistenza ai farmaci ai ceppi virali in evoluzione9,10,11,12,13. Le complessità associate alle infezioni oculari da HSV-1, sono state precedentemente studiate in vitro utilizzando monostrati e colture 3D di cellule corneali umane e in vivo utilizzando infezioni oculari murine o di coniglio. Mentre questi modelli in vitro forniscono dati significativi sulle componenti biologiche cellulari delle infezioni da HSV-1, tuttavia, non riescono a imitare l'intricata complessità del tessuto corneale e fanno poco per illuminare la diffusione dendritica del virus14. Al contrario, sebbene i sistemi in vivo siano più perspicaci nel mostrare la diffusione dell'infezione nelle cornee e le risposte di attivazione immunitaria durante l'infezione da HSV-1, vengono con l'avvertenza che richiedono investigatori addestrati e grandi strutture per la cura degli animali per trascurare gli esperimenti.
Qui usiamo le cornee suini come modello ex vivo per esaminare il sistema di ferite indotte dall'infezione da HSV-1. Sia la potenziale farmacologia di alcuni farmaci che la biologia cellulare e molecolare del sistema della ferita causata dall'infezione possono essere studiate attraverso colture di espianto tissutale. Questo modello può anche essere modificato per l'uso per altre infezioni virali e batteriche pure. In questo studio, le cornee suini sono state utilizzate per testare l'efficacia antivirale di una piccola molecola preclinica, BX795. L'uso di cornee suini è stato preferito a causa della facilità di accesso e dell'economicità. Inoltre, i modelli corneali suini sono buoni modelli di occhi umani con le cornee facili da isolare, adeguatamente dimensionate per l'infezione e la visualizzazione e robuste da gestire15. Le cornee suini sono anche paragonabili alla complessità dei modelli corneali umani sia nella permeabilità trans corneale che nell'assorbimento sistemico15. Utilizzando questo modello per lo studio, siamo stati in grado di chiarire come BX795 sia degno di ulteriori indagini come inibitore competente dell'infezione da virus HSV-1 e si aggiunge alla letteratura di classificarlo come potenziale composto antivirale a piccola molecola16.

<table><tbody><tr><td>30 g di aghi ipodermici.</td><td>BD</td><td>305128</td><td></td></tr><tr><td>flacone in vetro da 500 ml.</td><td>Thomas Scientific</td><td>844027</td><td></td></tr><tr><td>Antimicotico e Antibiotico (AA)</td><td>GIBCO</td><td>15240096</td><td>Aliquot in provette da 5 mL e conservare congelato fino all'uso</td></tr><tr><td>del vortex da banco.</td><td>Armadio di biosicurezza BioDot</td><td>BDVM-3200</td><td></td></tr><tr><td>con certificazione di biosicurezza di livello 2 (BSL-2).</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Herasafe 2030i</td><td></td></tr><tr><td>Calgiswab 6" tamponi standard sterili in alginato di calcio.</td><td>Raschietto cellulare Puritan</td><td>22029501</td><td></td></tr><tr><td>- 25 cm</td><td>Biologix BE</td><td>70-1180 70-1250</td><td></td></tr><tr><td>Crystal violet</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6158</td><td>Conservare la polvere in un luogo buio</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Eagle modificato' s medium - DMEM</td><td>GIBCO</td><td>41966029</td><td>Store a 4 gradi C fino all'uso</td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino -FBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2442</td><td>Aliquotare in provette da 50 ml e conservare congelato fino all'uso</td></tr><tr><td>Pinzetta a lama piatta &ndash; 2.Harward</td> <td>Instruments</td><td>72-8595</td><td></td></tr><tr><td>Congelatori --80 &deg;C. -</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>13 100 790</td><td></td></tr><tr><td>Scatola fresca di lame.</td><td>Thomas Scientific</td><td>TE05091</td><td></td></tr><tr><td>Guaze</td><td>Johnson & </td><td></td> Johnson <td>108 pollici quadrati cartella 12 strati</td></tr><tr><td>HSV-1 17GFP</td><td>coltivato in</td><td></td> <td>casa-Ceppo originale dalla dottoressa Patricia Spears, Northwestern University. GFP che esprime HSV-1 ceppo 17</td></tr><tr><td>Insulina, Transferrina, Selenio - ITS</td><td>GIBCO</td><td>41400045</td><td>Aliquot in provette da 5 mL e conservare congelato fino all'uso dell'agitatore</td></tr><tr><td>magnetico.</td><td>Thomas Scientific</td><td>H3710-HS</td><td></td></tr><tr><td>Forbici metalliche.</td><td>Harward Instruments</td><td>72-8400</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette da 1 a 1000 &micro;L.</td><td>Thomas Scientific</td><td>1159M37</td><td></td></tr><tr><td>Minimo Essenziale Mezzo - MEM</td><td>GIBCO</td><td>11095080</td><td>Store a 4 &deg; C fino all'uso</td></tr><tr><td>di OptiMEM</td><td>Negozio GIBCO</td><td>31985047</td><td>a 4 gradi C fino all'uso</td></tr><tr><td>di penicillina/streptomicina.</td><td>GIBCO</td><td>15140148</td><td>Aliquotare in provette da 5 mL e conservare congelato fino all'uso</td></tr><tr><td>Soluzione salina tampone fosfato -PBS</td><td>GIBCO</td><td>10010072</td><td>Conservare a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Porcine Corneas</td><td>Park Packaging Co., Chicago, IL</td><td></td><td>Ordine speciale su richiesta</td></tr><tr><td>Coperture per banchi di procedura - secondo necessità.</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>S42400</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sierologiche</td><td>Thomas Scientific</td><td>P7132, P7127, P7128, P7129, P7137</td><td></td></tr><tr><td>Attrezzatura per pipettaggio sierologico.</td><td>Thomas Scientific</td><td>Ezpette Pro</td><td></td></tr><tr><td>Stereoscopio</td><td>Carl Zeiss</td><td>SteREO Discovery V20</td><td></td></tr><tr><td>Magnete di agitazione.</td><td>Thomas Scientific</td><td>F37120</td><td></td></tr><tr><td>Fiasche per coltura tissutale, T175 cm2.</td><td>Thomas Scientific</td><td>T1275</td><td></td></tr><tr><td>Incubatori per colture tissutali in grado di mantenere il 5% di CO2 e 37 gradi C temperatura.</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Forma 50145523</td><td></td></tr><tr><td>Piastre trattate per colture tissutali (6 pozzetti).</td><td>Thomas Scientific</td><td>T1006</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,05%), rosso fenolo</td><td>GIBCO</td><td>25-300-062</td><td>Aliquotare in provette da 10 mL e conservare congelato fino all'uso</td></tr><tr><td>Vero cells</td><td>American Type Culture Collection ATCC</td><td>CRL-1586</td><td></td></tr></tbody></table>

espianto di tessuto corneale suino per studiare l'efficacia degli antivirali herpes simplex virus-1

Porcine Corneal Tissue Explant to Study the Efficacy of Herpes Simplex Virus-1 Antivirals

Virus e batteri possono causare una varietà di difetti della superficie oculare e degenerazione come ferite e ulcere attraverso l'infezione corneale. Con una sieroprevalenza che varia dal 60-90% in tutto il mondo, l'Herpes Simplex Virus di tipo 1 (HSV-1) provoca comunemente lesioni mucocutanee della regione orofacciale che si manifestano anche come lesioni e cecità associata all'infezione. Mentre gli attuali farmaci antivirali sono efficaci, l'emergere di resistenza e persistenza di effetti collaterali tossici richiede lo sviluppo di nuovi antivirali contro questo agente patogeno onnipresente. Sebbene la valutazione in vitro fornisca alcuni dati funzionali riguardanti un antivirale emergente, non dimostrano la complessità del tessuto oculare in vivo. Tuttavia, gli studi in vivo sono costosi e richiedono personale qualificato, specialmente quando si lavora con agenti virali. Quindi i modelli ex vivo sono passaggi efficienti ma poco costosi per i test antivirali. Qui discutiamo un protocollo per studiare l'infezione da HSV-1 utilizzando cornee suini ex vivo e un metodo per trattarle localmente usando farmaci antivirali esistenti e nuovi. Dimostriamo anche il metodo per eseguire un test della placca utilizzando HSV-1. I metodi dettagliati possono essere utilizzati per condurre esperimenti simili per studiare infezioni che assomigliano al patogeno HSV-1.

Per comprendere l'efficacia degli antivirali sperimentali, devono essere ampiamente testati prima di essere inviati per studi clinici umani in vivo. A questo proposito, devono essere identificati i gruppi di controllo positivo, controllo negativo e test. La trifluorothymidina (TFT) è stata a lungo utilizzata come trattamento preferito per trattare l'herpes cheratite topicamente16. Usato come controllo positivo, i gruppi corneali trattati con TFT mostrano una minore diffusione dell'infezione. Come ...

Descriviamo l'uso di una cornea suina per testare l'efficacia antivirale dei farmaci sperimentali.

Espianto di tessuto corneale suino per studiare l'efficacia degli antivirali Herpes Simplex Virus-1

Viruses and bacteria can cause a variety of ocular surface defects and degeneration such as wounds and ulcers through corneal infection. With a ...

Comprendere l'efficacia dei farmaci nei modelli animali è costoso e laborioso. Il nostro protocollo che utilizza un modello di espianto tissutale ex vivo è significativamente inferiore sia in termini di costi che di personale scientifico richiesto per condurre lo studio. Il vantaggio principale di questa tecnica è l'uso di occhi suini, che hanno anatomia e fisiologia molto simili agli occhi umani rispetto ad altri piccoli modelli animali.Quando testiamo i farmaci in vitro, potrebbero mostrare un'efficacia che potrebbe essere assente nei modelli animali o umani. I sistemi tissutali ex vivo sono il modo migliore per capire se i nostri sistemi in vitro possono essere tradotti o meno in sperimentazioni animali e umane. Il sistema corneale suino, sebbene meno laborioso, richiede competenze addestrabili per isolare, mantenere, infettare e trattare con i farmaci, in particolare il processo di isolamento della cornea dall'intero occhio suino è difficile da esprimere a parole, ma richiede una dimostrazione visiva.Dopo aver ricevuto gli occhi suini da un fornitore adatto, conservare i tessuti sul ghiaccio fino alla lavorazione e indossare l'apposito dispositivo di protezione individuale. Dis

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In questo video articolo si descrive l'uso di una...

Ex Vivo Modello organotipiche corneale di acuta epiteliali Herpes simplex virus di tipo I Infezione

La maggior parte degli studi sulla malattia erpetica corneale utilizzare un modello di infezione primaria. Tuttavia, l'infezione primaria con HSV-1 non tipicamente portare a malattie umane. Qui si descrive un modello ricorrente della malattia erpetica corneale, che più da vicino imita malattia umana.

Ricorrente cheratite erpetica Stromal in Mouse, un modello per lo studio HSK umano

Questo video descrive un protocollo per impostare un modello ex vivo per la cheratite batterica utilizzando un bottone corneosclerale sezionato dall'occhio suino. I batteri inoculati attraversano le incisioni epiteliali corneali per invadere lo stroma sottostante e stabilire un'infezione all'interno dei tessuti corneali che imita l'infezione in vivo.

Modello di cornea suina ex vivo di cheratite batterica: una tecnica per stabilire l'infezione batterica nelle cellule epiteliali corneali

Questo video mostra una procedura laser assistita non invasiva per danneggiare selettivamente le cellule endoteliali corneali nell'occhio suino. Il modello ex vivo sviluppato del danno alle cellule endoteliali può essere utilizzato per studiare le malattie dell'endotelio corneale.

Ablazione selettiva laser-assistita di cellule endoteliali corneali suine: una tecnica per indurre una lesione endoteliale corneale suina focalizzata per studi ex vivo

Questo video mostra il metodo per eseguire un test della placca utilizzando un virus ottenuto da cornea suina infetta. La cornea suina viene utilizzata per testare l'efficacia antivirale di farmaci sperimentali.

Determinazione dell'efficacia antivirale di farmaci sperimentali attraverso un test a placca

La pelle è un tessuto bersaglio del virus dell'herpes simplex umano di tipo 1 (HSV-1). Per esplorare la via di invasione dell'HSV-1 nei tessuti, abbiamo stabilito un modello di infezione ex vivo di fogli epidermici murini che rappresentano lo strato più esterno della pelle.

Ex Vivo infezione di Murine epidermide con Herpes Simplex Virus di tipo 1

Questo articolo descrive un protocollo passo-passo per impostare un modello suino ex vivo di cheratite batterica. Pseudomonas aeruginosa è usato come organismo prototipico. Questo modello innovativo imita l'infezione in vivo in quanto la proliferazione batterica dipende dalla capacità del batterio di danneggiare il tessuto corneale.

Stabilire un modello di Cornea ex vivo suina per lo studio dei trattamenti farmacologici contro la cheratite batterica

Abbiamo sviluppato un modello di ratto di grave infiammazione corneale attraverso il curettage dell'epitelio corneale combinato con suture corneali. Lo studio ha valutato i modelli di infiammazione corneale, la proliferazione epiteliale e i cambiamenti nelle cellule staminali limbari in condizioni infiammatorie.

Definizione di un modello di grave infiammazione corneale nei ratti basato sul curettage dell'epitelio corneale combinato con suture corneali

La coltura di organi corneali suini ex vivo e la guarigione delle ferite epiteliali forniscono un mezzo economico, etico, riproducibile e quantitativo per testare la tossicità oculare delle sostanze chimiche. Aiutano anche a chiarire i meccanismi alla base della regolazione dell'epitelizzazione e della riparazione dei tessuti e a valutare le terapie per il trattamento della cheratopatia diabetica e della guarigione ritardata delle ferite.

Valutazione della tossicità terapeutica e chimica mediante cornee suine coltivate in organo e guarigione delle ferite epiteliali

Il sistema di genetica inversa per la Valle del virus della febbre della Rift MP-12 ceppo vaccinale è un utile strumento per la creazione di ulteriori MP-12 mutanti con attenuazione aumentata e l'immunogenicità. Noi descriviamo il protocollo per generare e caratterizzare NSS ceppi mutanti.

Utilizzando genetica inversa per manipolare il gene del NSS il virus della febbre della Rift Valley MP-12 Strain per migliorare la sicurezza e l&#39;efficacia del vaccino

Scopri un modello ex vivo di cornea suina per testare l'efficacia di farmaci antivirali contro Herpes Simplex Virus-1. Questo metodo riduce costi e risorse rispetto ai modelli animali tradizionali.

Espianto di tessuto corneale suino per studiare l'efficacia degli antivirali Herpes Simplex Virus-1

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