Osservare la funzione delle isole e le interazioni isolo-cellule immunitarie nelle fette di tessuto pancreatico vivo
12 aprile 2021
Questo studio presenta l'applicazione di fette di tessuto pancreatico vivo allo studio della fisiologia delle isole e delle interazioni isolotto-cellula immunitaria.
Il nostro protocollo aiuterà a rispondere all'impatto che le interazioni delle cellule immunitarie hanno sulla funzionalità delle isole. Il metodo della fetta di tessuto pancreatico vivo consente di studiare la fisiologia e la funzione delle isole mantenendo i tessuti alla base delle patologie e del microambiente nativo. Questo metodo potrebbe fornire informazioni sui processi patologici delle malattie pancreatiche, come la pancreatite, il diabete di tipo I e il diabete di tipo II.
Per iniziare, disporre i blocchi sul supporto del campione in modo tale che non superino la larghezza della lama, assicurando che la lama possa spostarsi in avanti la minor distanza possibile quando il vibratoma si muove lentamente. Applicare una linea di super colla sul supporto del campione, creando uno strato sottile utilizzando l'estremità del distributore di colla, quindi capovolgere i blocchi di tessuto sulla colla in modo che il lato vicino al tessuto sia rivolto verso l'alto. Spingere delicatamente verso il basso i blocchi e lasciare asciugare la colla per tre minuti.
Quindi, fissare la piastra al vibratoma con una vite e regolare l'altezza e la distanza della lama percorse in modo che la lama si muova sulla lunghezza dei blocchi e appena sopra di essi. Spingere delicatamente i blocchi con la pinza per verificare che la colla si sia asciugata, quindi riempire il vassoio del vibratoma con una soluzione extracellulare refrigerata fino a quando la lama non è coperta. Impostare il vibratoma per fare fette di 120 micrometri di spessore e avviarlo, quindi osservare le fette che escono dai blocchi di tessuto.
Sollevare le fette quando galleggiano fuori dal blocco posizionando un pennello o una pinza sotto di esse e posizionare le fette in un tampone di bicarbonato Krebs-Ringer contenente tre D-glucosio millimolare e inibitore della tripsina. Posizionare le piastre contenenti le fette su un bilanciere e incubare a temperatura ambiente per un'ora a 25 RPM. Se le fette devono essere conservate più a lungo, posizionare le fette in 15 millilitri di terreno di coltura a fette e posizionare il piatto in un'incubatrice.
Incubare le fette preparate a 37 gradi Celsius per studi nello stesso giorno o trasferire le fette coltivate a 24 gradi Celsius durante la notte a 37 gradi Celsius per almeno un'ora prima dell'esperimento. Accendere il microscopio almeno un'ora prima della registrazione ed equilibrare l'incubatore superiore del palco a 37 gradi Celsius. Fissare la capsula di Petri con fondo di vetro di copertura contenente la fetta sul palco.
Focalizzare il microscopio impostando l'obiettivo 10X in modalità campo luminoso e individuare le isole utilizzando la modalità campo luminoso cercando ovali di colore marrone arancione all'interno della fetta. Passare il microscopio all'imaging confocale premendo il pulsante CS sul controller touch screen del microscopio. Per visualizzare gli isolotti utilizzando la riflettanza, accendere il rilevatore laser 638 e il rilevatore PMT.
Impostare la potenza del laser tra uno e il 2% e spegnere i filtri notch. Utilizzare il laser a 405 nanometri e il rilevatore PMT per osservare la macchia di acido nucleico. Il rivelatore ibrido per il rilevamento degli anticorpi CD8 e il laser a 488 nanometri e il rilevatore ibrido per visualizzare il tetramero dell'insulina.
Centra l'isolotto di interesse nel campo visivo usando le manopole X e Y del controller dello stage. Una volta individuato un isolotto di interesse, passa all'obiettivo 20X e ingrandisci in modo che l'isolotto occupi la maggior parte dell'inquadratura. Prendi una z-stack dell'isolotto, quindi trova le migliori sezioni ottiche in cui le cellule sono vive e tutte le cellule immunitarie circostanti sono a fuoco.
Impostare il microscopio per registrare in modalità XYZT e ottimizzare le impostazioni per registrare uno z-stack dei passaggi selezionati ogni 20 minuti per un periodo di diverse ore. Le isole in una fetta di tessuto pancreatico sono state visualizzate utilizzando la microscopia a campo luminoso e a luce riflessa. L'insulina nelle isole aumenta la granularità e provoca l'assorbimento di grandi quantità di luce riflessa, aumentando la visibilità delle isole.
La vitalità di una fetta di tessuto pancreatico umano vivo è stata valutata mediante colorazione. Le cellule vive sono indicate in verde e le cellule morte in blu. Un altro indicatore positivo per la vitalità è l'attività basale osservabile.
Quando una fetta pancreatica viva è stata caricata con un indicatore di calcio permeabile alle cellule, la stimolazione del glucosio è stata osservata sia nelle fette pancreatiche di topo che in quelle umane. È stata anche quantificata la fluorescenza delle singole cellule durante la stimolazione del glucosio. Isole intatte e malate sono state osservate utilizzando la colorazione del ditizone e la microscopia a luce riflessa.
Le isole malate iniziano a perdere granularità a causa dell'infiltrazione delle cellule immunitarie e della morte cellulare. Le popolazioni di cellule immunitarie possono essere identificate utilizzando anticorpi CD8 e colorazione del tetramero dell'insulina. La co-colorazione indica che le cellule sono cellule T effettrici che mirano specificamente all'antigene dell'insulina.
La cosa più critica da ricordare in questa procedura è mantenere le fette in soluzioni inibitore della proteasi in ogni momento. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire numerose funzionalità negli esperimenti sulle cellule immunitarie che consentono di studiare l'effetto delle interazioni delle cellule immunitarie e della funzione delle isole.
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Panoramica
Questo studio presenta l'applicazione di fette di tessuto pancreatico vitali allo studio della fisiologia degli isolotti e delle interazioni tra isolotti e cellule immunitarie. Il metodo consente l'esame della funzionalità degli isolotti mantenendo intatto il microambiente nativo.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Immunologia
Sfondo
- Le cellule delle isole pancreatiche svolgono un ruolo fondamentale nel metabolismo del glucosio.
- Le interazioni tra cellule immunitarie possono influenzare la funzione delle isole.
- Comprendere queste interazioni è essenziale per affrontare le malattie pancreatiche.
- Le sezioni di tessuto vitali mantengono il contesto fisiologico delle cellule.
Scopo dello studio
- Studiare l'impatto delle interazioni tra cellule immunitarie sulla funzionalità delle isole pancreatiche.
- Fornire informazioni sulle malattie pancreatiche come il diabete di tipo I e di tipo II.
- Sviluppare un metodo che preservi le patologie tissutali e i microambienti.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di fette di tessuto pancreatico vivo.
- Utilizzo di un vibratomo per il taglio preciso.
- Applicazione di colla cianoacrilica per la stabilizzazione del blocco di tessuto.
- Osservazione in tempo reale delle interazioni tra isole e cellule immunitarie.
Risultati principali
- Il metodo della fetta di tessuto pancreatico vitale preserva efficacemente la fisiologia delle isole.
- È stato dimostrato che le interazioni tra cellule immunitarie influenzano significativamente la funzione delle isole.
- Questo approccio consente lo studio delle patologie sottostanti.
- Le conoscenze acquisite potrebbero orientare le strategie terapeutiche per le malattie pancreatiche.
Conclusioni
- Le sezioni di tessuto pancreatico vitali sono uno strumento prezioso per lo studio della fisiologia degli isolotti.
- Il metodo può migliorare la comprensione delle interazioni immunitarie nella funzione degli isolotti.
- La ricerca futura potrà basarsi su questi risultati per affrontare le patologie pancreatiche.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
Le sezioni di tessuto pancreatico vitali permettono l'osservazione diretta delle interazioni tra cellule delle isole e cellule immunitarie all'interno di un microambiente nativo preservato, offrendo un sistema fisiologicamente rilevante per la riduzione del rischio meccanicistica nella validazione di bersagli per il diabete. Questo approccio sostiene la fiducia predittiva mantenendo la vitalità del tessuto e le patologie sottostanti come il diabete di tipo 1 e di tipo 2, consentendo ai team di ricerca e sviluppo di valutare ipotesi terapeutiche in un contesto rilevante per la malattia. Il metodo collega la biologia della scoperta alla ricerca traslazionale fornendo letture quantitative in tempo reale della funzione delle isole e della dinamica delle cellule immunitarie, fondamentali per prendere decisioni di avanzamento o interruzione nelle prime fasi della scoperta di farmaci per il diabete.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante la visualizzazione dell'infiltrazione delle cellule immunitarie e del relativo impatto diretto sull'integrità dei granuli delle isole e sul rilascio di insulina.
- Valore operativo: Preserva l'architettura tissutale nativa e le interazioni cellulari, riducendo l'ambiguità meccanicistica nella validazione di bersagli per terapie immunomodulanti nel diabete.
- Valore predittivo: Supporta la selezione del portafoglio terapeutico collegando l'attività delle cellule immunitarie al declino funzionale delle isole, fornendo un output allineato a biomarcatori per la conferma dell'interazione con il bersaglio.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera letture quantitative di fluorescenza da indicatori del calcio e da colorazione del tetramero di insulina per valutare gli effetti dose-dipendenti di composti sulla funzione delle isole.
- Valore operativo: Standardizza le procedure di preparazione dei tessuti e di acquisizione delle immagini, garantendo misurazioni di base riproducibili tra diverse prove sperimentali e sistemi modello.
- Scalabilità: Compatibile con microscopia a intervalli e acquisizione di z-stack, consentendo il monitoraggio longitudinale della dinamica delle cellule immunitarie per diverse ore.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per la malattia: Mantiene le patologie sottostanti di tessuto pancreatico umano e murino, consentendo lo studio dei meccanismi del diabete di tipo 1 e di tipo 2 in un sistema rilevante per la malattia.
- Continuità traslazionale: Collega le scoperte iniziali alla validazione preclinica preservando le interazioni intercellulari fondamentali per la disfunzione delle isole mediata dal sistema immunitario.
- Progressione basata sul rischio: Permette la visualizzazione delle interazioni tra linfociti T effettrici e antigeni dell'insulina mediante colorazione coniugata con tetramero di CD8 e insulina, supportando decisioni di tipo meccanicistico di prosecuzione o interruzione del progetto.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo della fetta di tessuto pancreatico vitale si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio alla ricerca preclinica, fornendo un sistema rilevante per la malattia che mantiene la vitalità del tessuto e il microambiente per studi meccanicistici sulle interazioni tra isole e sistema immunitario.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi consentendo l'osservazione in tempo reale dell'impatto delle cellule immunitarie sulla fisiologia degli isolotti, chiarificando i percorsi coinvolti nella patogenesi del diabete.
- Screening: Fornisce sezioni di tessuto pronte per il saggio con risultati quantitativi derivanti dal flusso di calcio stimolato dal glucosio e dal legame del tetramero di insulina, facilitando la valutazione affidabile di composti.
- Analisi: Genera dati cronologici XYZT e sezioni ottiche a z-stack, consentendo ai gruppi di quantificare le risposte cellulari e la localizzazione delle cellule immunitarie nel tempo.
- Ricerca traslazionale: Mantiene patologie rilevanti per la malattia e il microambiente nativo, sostenendo la continuità dalla scoperta alla validazione preclinica dei meccanismi immunomodulatori.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per lo studio della funzione degli isolotti in diversi modelli di malattia e modalità terapeutiche, riducendo lo sviluppo ridondante di modelli.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Fornisce una previsione affidabile nella validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità meccanicistica attraverso la visualizzazione diretta delle interazioni tra isole e sistema immunitario in tessuto integro.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione e riproducibilità mediante protocolli controllati di sezionamento, incubazione e acquisizione delle immagini, che mantengono la vitalità e la funzionalità delle fette.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione progettuale collegando l'attività delle cellule immunitarie al declino funzionale delle isole, riducendo il rischio biologico in fase avanzata nello sviluppo di farmaci per il diabete.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione adeguata al rischio dei candidati immunomodulatori in base alla loro capacità di attenuare la disfunzione delle isole mediata dal sistema immunitario in un sistema rilevante per la malattia.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella manipolazione dei tessuti, nella sezionatura con vibratomo e nella microscopia confocale per l'acquisizione in tempo reale della dinamica delle cellule immunitarie.
- È dipendente da strumentazione specifica, tra cui un vibratomo, un microscopio confocale dotato di rivelatori laser (405 nm, 488 nm, 638 nm) e un incubatore da tavolo per il controllo ambientale.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro riguardo alla preparazione delle sezioni, alla composizione del buffer (bicarbonato di Krebs-Ringer con D-glucosio e inibitore della tripsina) e alle condizioni di incubazione, al fine di garantire la riproducibilità.
- Comporta considerazioni di adattamento nell'applicare il metodo a diversi sistemi modello (umano rispetto a topo) o stati patologici (diabete di tipo 1 rispetto a diabete di tipo 2), al fine di mantenere la vitalità del tessuto e la rilevanza patologica.
- Presenta limitazioni pratiche, come la necessità di inibitori delle proteasi per preservare l'integrità delle sezioni e la difficoltà tecnica di mantenere la trasparenza ottica durante acquisizioni in time-lapse a lungo termine.
