Name: Osservare la funzione delle isole e le interazioni isolo-cellule immunitarie nelle fette di tessuto pancreatico vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 51 s
Description: Scopri la fisiologia delle isole pancreatiche e le interazioni con le cellule immunitarie utilizzando fette di tessuto pancreatico vivo. Questo metodo preserva il microambiente nativo per studiare patologie come il diabete.

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Questo lavoro è stato finanziato dalle sovvenzioni NIH R01 DK123292, T32 DK108736, UC4 DK104194, UG3 DK122638 e P01 AI042288. Questa ricerca è stata condotta con il supporto del Network for Pancreatic Organ donors with Diabetes (nPOD; RRID: SCR_014641), un progetto collaborativo di ricerca sul diabete di tipo 1 sponsorizzato da JDRF (nPOD: 5-SRA-2018-557-Q-R) e The Leona M. & Harry B. Helmsley Charitable Trust (Grant #2018PG-T1D053). Il contenuto e le opinioni espresse sono responsabilità degli autori e non riflettono necessariamente il punto di vista ufficiale di nPOD. Le organizzazioni di approvvigionamento di organi (OPO) che collaborano con nPOD per fornire risorse di ricerca sono elencate in http://www.jdrfnpod.org/for-partners/npod-partners/. Grazie al Dr. Kevin Otto, Università della Florida, per aver fornito il vibratoma utilizzato per generare fette di mouse.

<ol><li>Uc, A., Fishman, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Pancreatic disorders.</a> Pediatric Clinics of North America. 64 (3), 685-706 (2017).</li>
<li>Bluestone, J. A., Herold, K., Eisenbarth, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics%2C+pathogenesis+and+clinical+interventions+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetics, pathogenesis and clinical interventions in type 1 diabetes.</a> Nature. 464 (7293), 1293-1300 (2010).</li>
<li>Taylor, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+2+diabetes%3A+etiology+and+reversibility%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Type 2 diabetes: etiology and reversibility.</a> Diabetes Care. 36 (4), 1047-1055 (2013).</li>
<li>Meier, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+of+Langerhans+isolation+from+pediatric+and+juvenile+donor+pancreases%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+International%22%5BJournal%5D)">Islet of Langerhans isolation from pediatric and juvenile donor pancreases.</a> Transplant International. 27 (9), 949-955 (2014).</li>
<li>Marciniak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+pancreas+tissue+slices+for+in+situ+studies+of+islet+of+Langerhans+and+acinar+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Using pancreas tissue slices for in situ studies of islet of Langerhans and acinar cell biology.</a> Nature Protocols. 9 (12), 2809-2822 (2014).</li>
<li>Panzer, J. K., Cohrs, C. M., Speier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+pancreas+tissue+slices+for+the+study+of+islet+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Using pancreas tissue slices for the study of islet physiology.</a> Methods in Molecular Biology. 2128, 301-312 (2020).</li>
<li>Speier, S., Rupnik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+approach+to+in+situ+characterization+of+pancreatic+beta-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archive%22%5BJournal%5D)">A novel approach to in situ characterization of pancreatic beta-cells.</a> Pflugers Archive. 446 (5), 553-558 (2003).</li>
<li>Panzer, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreas+tissue+slices+from+organ+donors+enable+in+situ+analysis+of+type+1+diabetes+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Pancreas tissue slices from organ donors enable in situ analysis of type 1 diabetes pathogenesis.</a> JCI Insight. 5 (8), 134525(2020).</li>
<li>Dolai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatitis-induced+depletion+of+syntaxin+2+promotes+autophagy+and+increases+basolateral+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Pancreatitis-induced depletion of syntaxin 2 promotes autophagy and increases basolateral exocytosis.</a> Gastroenterology. 154 (6), 1805-1821 (2018).</li>
<li>Dolai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreas-specific+SNAP23+depletion+prevents+pancreatitis+by+attenuating+pathological+basolateral+exocytosis+and+formation+of+trypsin-activating+autolysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Pancreas-specific SNAP23 depletion prevents pancreatitis by attenuating pathological basolateral exocytosis and formation of trypsin-activating autolysosomes.</a> Autophagy. , 1-14 (2020).</li>
<li>Qadir, M. M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+human+pancreatic+slices+as+a+model+to+study+real-time+islet+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of human pancreatic slices as a model to study real-time islet regeneration.</a> Nature Communications. 11 (1), 3265(2020).</li>
<li>Cohrs, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysfunction+of+persisting+%CE%B2+cells+is+a+key+feature+of+early+type+2+diabetes+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Dysfunction of persisting β cells is a key feature of early type 2 diabetes pathogenesis.</a> Cell Reports. 31 (1), 107469(2020).</li>
<li>Liang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+human+pancreatic+slice+preparations+offer+a+valuable+model+for+studying+pancreatic+exocrine+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ex vivo human pancreatic slice preparations offer a valuable model for studying pancreatic exocrine biology.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (14), 5957-5969 (2017).</li>
<li>Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+mice+in+translational+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Humanized mice in translational biomedical research.</a> Nat Reviews. Immunology. 7 (2), 118-130 (2007).</li>
<li>Lamont, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compensatory+mechanisms+allow+undersized+anchor-deficient+class+I+MHC+ligands+to+mediate+pathogenic+autoreactive+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Compensatory mechanisms allow undersized anchor-deficient class I MHC ligands to mediate pathogenic autoreactive T cell responses.</a> Journal of Immunology. 193 (5), 2135-2146 (2014).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Anesthesia+and+analgesia+in+laboratory+animals%22">Anesthesia and analgesia in laboratory animals</a>. Fish, R., Danneman, P. J., Brown, M., Karas, A. , Academic Press. (2011).</li>
<li>Clark, S. A., Borland, K. M., Sherman, S. D., Rusack, T. C., Chick, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staining+and+in+vitro+toxicity+of+dithizone+with+canine%2C+porcine%2C+and+bovine+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Staining and in vitro toxicity of dithizone with canine, porcine, and bovine islets.</a> Cell Transplantation. 3 (4), 299-306 (1994).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Monette, R., Small, D. L., Mealing, G., Morley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence+confocal+assay+to+assess+neuronal+viability+in+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Protocols%22%5BJournal%5D)">A fluorescence confocal assay to assess neuronal viability in brain slices.</a> Brain Research Protocols. 2 (2), 99-108 (1998).</li>
<li>Gál, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+in+situ+approach+to+studying+pancreatic+ducts+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">A novel in situ approach to studying pancreatic ducts in mice.</a> Frontiers in Physiology. 10, 938(2019).</li>
<li>Stožer, A., Dolenšek, J., Rupnik, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose-stimulated+calcium+dynamics+in+islets+of+Langerhans+in+acute+mouse+pancreas+tissue+slices%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Glucose-stimulated calcium dynamics in islets of Langerhans in acute mouse pancreas tissue slices.</a> PloS One. 8 (1), 54638(2013).</li>
<li>Stožer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+connectivity+in+islets+of+Langerhans+from+mouse+pancreas+tissue+slices%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional connectivity in islets of Langerhans from mouse pancreas tissue slices.</a> PLoS Computational Biology. 9 (2), 1002923(2013).</li>
<li>Früh, E., Elgert, C., Eggert, F., Scherneck, S., Rustenbeck, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucagonotropic+and+glucagonostatic+effects+of+KATP+channel+closure+and+potassium+depolarization%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Glucagonotropic and glucagonostatic effects of KATP channel closure and potassium depolarization.</a> Endocrinology. 162 (1), 136(2021).</li>
<li>Satin, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+mechanisms+for+sulfonylurea+control+of+insulin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine%22%5BJournal%5D)">New mechanisms for sulfonylurea control of insulin secretion.</a> Endocrine. 4 (3), 191-198 (1996).</li>
<li>Ren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+oscillations+of+KATP+conductance+in+mouse+pancreatic+islets+provide+support+for+electrical+bursting+driven+by+metabolic+oscillations%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Slow oscillations of KATP conductance in mouse pancreatic islets provide support for electrical bursting driven by metabolic oscillations.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 305 (7), 805-817 (2013).</li>
<li>Marciniak, A., Selck, C., Friedrich, B., Speier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+pancreas+tissue+slice+culture+facilitates+long-term+studies+of+exocrine+and+endocrine+cell+physiology+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mouse pancreas tissue slice culture facilitates long-term studies of exocrine and endocrine cell physiology in situ.</a> PLoS One. 8 (11), 78706(2013).</li>
<li>Dzhagalov, I. L., Melichar, H. J., Ross, J. O., Herzmark, P., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of the immune system.</a> Current Protocols in Cytometry. , Chapter 12, Unit 12.26 (2012).</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.

L'obiettivo di questo protocollo è quello di spiegare la generazione di fette di pancreas e le procedure necessarie per impiegare le fette in studi funzionali e immunologici. Ci sono molti vantaggi nell'uso di fette pancreatiche vive. Tuttavia, ci sono diversi passaggi critici che sono essenziali affinché il tessuto rimanga vitale e utile durante i protocolli di esperimento descritti. È imperativo lavorare rapidamente. Il periodo di tempo tra l'iniezione del pancreas e la generazione delle fette sul vibratoma dovrebbe es...

Il coinvolgimento del pancreas è patognomonico a malattie come pancreatite, T1D e T2D1,2,3. Lo studio della funzione in isole isolate di solito comporta la rimozione delle isole dal loro ambiente circostante4. Il metodo della fetta di tessuto pancreatico vivo è stato sviluppato per consentire lo studio del tessuto pancreatico mantenendo intatti i microambienti delle isole ed evitando l'uso di stressanti procedure di isolamento delle isole5,6,7. Le fette di tessuto pancreatico da tessuto di donatore umano sono state utilizzate con successo per studiare il T1D e hanno dimostrato processi di perdita e disfunzione delle cellule beta oltre all'infiltrazione delle cellule immunitarie8,9,10,11,12,13. Il metodo della fetta di tessuto pancreatico vivo può essere applicato sia al tessuto pancreatico di topo che a quello umano5,6,8. Le fette di tessuto pancreatico umano da tessuti di donatori di organi sono ottenute attraverso una collaborazione con la Rete per i donatori di organi pancreatici con diabete (nPOD). Le fette di topo possono essere generate da una varietà di diversi ceppi di topo.
Questo protocollo si concentrerà sul gene-1-nullo attivante la ricombinazione diabetica non obesa (NOD). Rag1-/-) e il recettore delle cellule T transgenico (AI4) (NOD. Rag1-/-. Ceppi di topo AI4 α/β). ANNUIRE. I topi Rag1-/- non sono in grado di sviluppare cellule T e B a causa di un'interruzione del gene 1 (Rag1)14 che attiva la ricombinazione. ANNUIRE. Rag1-/-. I topi AI4 α/β sono utilizzati come modello per il diabete di tipo 1 accelerato perché producono un singolo clone di cellule T che prende di mira un epitopo di insulina, con conseguente infiltrazione costante delle isole e rapido sviluppo della malattia15. Il protocollo qui descritto descrive le procedure per studi funzionali e immunologici che utilizzano fette pancreatiche umane e di topo vive attraverso l'applicazione di approcci di microscopia confocale. Le tecniche qui descritte includono valutazioni di vitalità, identificazione e localizzazione delle isole, registrazioni citosoliche di Ca2+ , nonché colorazione e identificazione delle popolazioni di cellule immunitarie.

<table><tbody><tr><td>#3 Manico per bisturi stile</td><td>Fisherbrand</td><td>12-000-163</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP299-100</td><td>Tampone HEPES, soluzione 1M</td></tr><tr><td>Piatto di coltura non trattato 10 cm</td><td>Corning</td><td>430591</td><td></td></tr><tr><td>Siringa Luer-Lok da 10 ml Siringa</td><td>BD</td><td>301029</td><td>BD con punte Luer-Lok</td></tr><tr><td>Ago da 27 g</td><td>BD</td><td>BD 305109</td><td>Aghi ipodermici BD per uso generale e PrecisionGlide</td></tr><tr><td>Piastra di Petri da 35 mm con fondo in vetro</td><td>Ibidi</td><td>81156</td><td>&micro;-Piastra da 35 mm, alta</td></tr><tr><td>50 mL Siringa</td><td>BD</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>Coverglass a 8 pozzetti</td><td>Ibidi</td><td>80826</td><td>&micro;-Slide 8 Well</td></tr><tr><td>APC anti-topo CD8a anticorpo</td><td>Biolegend</td><td>100712</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fisher Scientific</td><td>199898</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>Sigma</td><td>C5670</td><td>CaCl2</td></tr><tr><td>Cloruro di calcio diidrato</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td>CaCl2 (diidrato)</td></tr><tr><td>Rocker digitale compatto</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88880020</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale a scansione laser</td><td>Leica</td><td>SP8</td><td>Pinhole&thinsp;= 1,5-2 unità ariose; acquisito con apertura numerica 10x/0,40 HC PL APO CS2 dry e 20x/0,75 con apertura numerica HC PL APO CS2 dry a 512&thinsp; &volte; &sottile; Risoluzione 512 pixel</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucosio</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td>C6H12O6</td></tr><tr><td>ddiH2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ditizone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5130-10G</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Invitrogen</td><td>D12345</td><td>Dimetilsolfossido</td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Decon Laboratories</td><td>2805</td><td></td></tr><tr><td>Piatto per coltura tissutale Falcon da 35 mm</td><td>Corning</td><td>353001</td><td>Piastre per coltura tissutale Falcon Easy-Grip FBS</td></tr><tr><td></td><td>Gibco</td><td></td> 10082147 <td></td></tr><tr><td>Feather No. 10 Surgical Blade</td><td>Microscopia elettronica</td><td>Scienze 7204410</td><td></td></tr><tr><td>fluo-4-AM</td><td>Invitrogen</td><td>F14201</td><td>Indicatore Ca2+ permeabile</td></tr><tr><td>alle cellule Gel Control Super Glue</td><td>Loctite</td><td>45198</td><td></td></tr><tr><td>Graefe Forcipe</td><td>Strumenti per la scienza fine</td><td>11049-10</td><td></td></tr><tr><td>Forbici fini temprate</td><td>Strumenti per la scienza fine</td><td>14090-09</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco 14025092</td><td></td><td>Matasse Soluzione salina bilanciata</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td>C8H18N2O4S</td></tr><tr><td>Secchiello per il ghiaccio</td><td>Fisherbrand</td><td>03-395-150</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Patterson Veterinario</td><td>NDC 14043-704-05</td><td></td></tr><tr><td>Johns Hopkins Bulldog Morsetto</td><td>Roboz Negozio chirurgico</td><td>RS-7440</td><td>&nbsp; Diritto; 500-900 grammi di pressione; 1,5" di lunghezza</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>34705</td><td>Kimtech Science&trade; Kimwipes&commercio; Tergicristalli per attività delicate,</td></tr><tr><td>kit di vitalità/citotossicità a 2 strati LIVE/DEAD</td><td>Invitrogen</td><td>L3224</td><td>Questo kit contiene il colorante per cellule vive calcein-AM.</td></tr><tr><td>DMEM a basso contenuto di glucosio</td><td>Corning</td><td>10-014-CV</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio esaidrato</td><td>Sigma</td><td>M9272</td><td>MgCl2 (esaidrato)</td></tr><tr><td>Solfato di magnesio eptaidrato</td><td>Sigma</td><td>M2773</td><td>MgSO4 (eptaidrato)</td></tr><tr><td>Piattaforma riscaldata magnetica</td><td>Warner Instruments</td><td>PM-1</td><td>Piattaforma per camera di imaging per stimolazione dinamica registrazioni</td></tr><tr><td>Microonde</td><td>GE</td><td>JES1460DSWW</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Filtro per siringa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>726-2520</td><td></td></tr><tr><td>No.4 Paintbrush</td><td>Michaels</td><td>10269140</td><td></td></tr><tr><td>Camera di imaging a bagno di diamante aperto</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26</td><td>Camera di imaging per registrazioni di stimolazione dinamica</td></tr><tr><td>Oregon Green 488 BAPTA-1-AM</td><td>Invitrogen</td><td>Indicatore</td><td>Ca2+ permeabile alle cellule</td></tr><tr><td>Okolab</td><td>H201-LG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20012050</td><td>Per produrre agarosio per la generazione di</td></tr><tr><td>fette Tetramero insulina marcato con PE</td><td>Emory Tetramer Research</td><td>YAIENYLEL</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina Streptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td>KCl</td></tr><tr><td>Fosfato di potassio monobasico</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td>KH2PO4</td></tr><tr><td>Razor Blades Scienze</td> di <td>microscopia elettronica</td><td>71998</td><td>per vibratomo; Acciaio inossidabile a doppio bordo, non rivestito</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>SeaPlaque agarosio a basso punto di fusione</td><td>Lonza</td><td>50101</td><td>Per produrre agarosio per la generazione di fette</td></tr><tr><td>Ancoraggio a fette</td><td>Warner Instruments</td><td>64-1421</td><td></td></tr><tr><td>Ancoraggio a fette (imaging dinamico)</td><td>Warner Instruments</td><td>640253</td><td>Ancoraggio a fette per camera</td></tr> <tr><td>di imaging dinamicoBicarbonato di sodio</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>NaHCO3</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Fosfato di sodio monoidrato</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td>NaH2PO4 (monoidrato)</td></tr><tr><td>Inibitore della tripsina di soia</td><td>Sigma</td><td>T6522-1G</td><td>Inibitore della tripsina da Glycine max (soia)</td></tr><tr><td>Stadio Adattatore</td><td>Warner Instruments</td><td>SA-20MW-AL</td><td>Per adattarsi alla camera di imaging per le registrazioni di stimolazione dinamica sul tavolino del microscopio</td></tr><tr><td>Incubatore da palco</td><td>Stereoscopio Okolab</td><td>H201</td><td></td></tr><tr><td>Leica</td><td></td><td>IC90 E MSV266</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Colorazione blu a cellule morte</td><td>Invitrogen</td><td>S34857</td><td>colorazione fluorescente blu per acido nucleico</td></tr><tr><td>Trasferimento Pipet</td><td>Falcon</td><td>357575</td><td>Falco & commercio; Pipette di trasferimento monouso in plastica</td></tr><tr><td>Sistema di controllo della valvola</td><td>Warner Instruments</td><td>VCS-8</td><td>Sistema per registrazioni di stimolazione dinamica</td></tr><tr><td>Vibratome VT1000 S</td><td>Leica</td><td>VT1000 S Bagnomaria</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>FSGPD02</td><td>Fisherbrand Isotemp Bagnomaria Deluxe per uso generico GPD 02</td></tr></tbody></table>

osservare la funzione delle isole e le interazioni isolo-cellule immunitarie nelle fette di tessuto pancreatico vivo

Observing Islet Function and Islet-Immune Cell Interactions in Live Pancreatic Tissue Slices

Le fette di tessuto pancreatico vivo consentono lo studio della fisiologia e della funzione delle isole nel contesto di un microambiente di isole intatte. Le fette sono preparate da tessuto pancreatico umano e di topo vivo incorporato nell'agarosio e tagliate usando un vibratoma. Questo metodo consente al tessuto di mantenere la vitalità e la funzione oltre a preservare patologie sottostanti come il diabete di tipo 1 (T1D) e di tipo 2 (T2D). Il metodo slice consente nuove direzioni nello studio del pancreas attraverso il mantenimento delle strutture complesse e delle varie interazioni intercellulari che comprendono i tessuti endocrini ed esocrini del pancreas. Questo protocollo dimostra come eseguire la colorazione e la microscopia time-lapse di cellule immunitarie endogene vive all'interno di fette pancreatiche insieme a valutazioni della fisiologia delle isole. Inoltre, questo approccio può essere perfezionato per discernere le popolazioni di cellule immunitarie specifiche per gli antigeni delle cellule insulari utilizzando i principali reagenti multimero complesso di istocompatibilità.

Questo protocollo produrrà fette di tessuto pancreatico vivo adatte sia per studi di funzionalità che per registrazioni di cellule immunitarie. L'aspetto delle sezioni sia in campo luminoso che sotto la luce riflessa è mostrato nella Figura 1A,B. Come discusso, le isole possono essere trovate in fette usando la luce riflessa a causa della loro maggiore granularità che si verifica a causa del loro contenuto di insulina (Figura 1C) e sono chiarame...

Questo studio presenta l'applicazione di fette di tessuto pancreatico vivo allo studio della fisiologia delle isole e delle interazioni isolotto-cellula immunitaria.

Osservare la funzione delle isole e le interazioni isolo-cellule immunitarie nelle fette di tessuto pancreatico vivo

Live pancreatic tissue slices allow for the study of islet physiology and function in the context of an intact islet microenvironment. Slices are prepared ...

Il nostro protocollo aiuterà a rispondere all'impatto che le interazioni delle cellule immunitarie hanno sulla funzionalità delle isole. Il metodo della fetta di tessuto pancreatico vivo consente di studiare la fisiologia e la funzione delle isole mantenendo i tessuti alla base delle patologie e del microambiente nativo. Questo metodo potrebbe fornire informazioni sui processi patologici delle malattie pancreatiche, come la pancreatite, il diabete di tipo I e il diabete di tipo II.Per iniziare, disporre i blocchi sul supporto del campione in modo tale che non superino la larghezza della lama, assicurando che la lama possa spostarsi in avanti la minor distanza possibile quando il vibratoma si muove lentamente. Applicare una linea di super colla sul supporto del campione, creando uno strato sottile utilizzando l'estremità del distributore di colla, quindi capovolgere i blocchi di tessuto sulla colla in modo che il lato vicino al tessuto sia rivolto verso l'alto. Spingere delicatamente verso il basso i blocchi e lasciare asciugare la colla per tre minuti.Quindi, fissare la piastra al vibratoma con una vite e regolare l'altezza e la distanza della lama percorse in modo che la lama si muova sulla lunghezza dei blocchi e appena sopra di essi. Spingere delicatamente i blocchi con la pinza per verificare che la colla si sia asciugata, quindi riempire il vassoio del vibratoma con una soluzione extracellulare refrigerata fino a quando la lama non è coperta. Impostare il vibratoma per fare fette di 120 micrometri di spessore e avviarlo, quindi osservare le fette che escono dai blocchi di tessuto.Sollevare le fette quando galleggiano fuori dal blocco posizionando un pennello o una pinza sotto di esse e posizionare le fette in un tampone di bicarbonato Krebs-Ringer contenente tre D-glucosio millimolare e inibitore della tripsina. Posizionare le piastre contenenti le fette su un bilanciere e incubare a temperatura ambiente per un'ora a 25 RPM. Se le fette devono essere conservate più a lungo, posizionare le fette in 15 millilitri di terreno di coltura a fette e posizionare il piatto in un'incubatrice.Incubare le fette preparate a 37 gradi Celsius per studi nello stesso giorno o trasferire le fette coltivate a 24 gradi Celsius durante la notte a 37 gradi Celsius per almeno un'ora prima dell'esperimento. Accendere il microscopio almeno un'ora prima della registrazione ed equilibrare l'incubatore superiore del palco a 37 gradi Celsius. Fissare la capsula di Petri con fondo di vetro di copertura contenente la fetta sul palco.Focalizzare il microscopio impostando l'obiettivo 10X in modalità campo luminoso e individuare le isole utilizzando la modalità campo luminoso cercando ovali di colore marrone arancione all'interno della fetta. Passare il microscopio all'imaging confocale premendo il pulsante CS sul controller touch screen del microscopio. Per visualizzare gli isolotti utilizzando la riflettanza, accendere il rilevatore laser 638 e il rilevatore PMT.Impostare la potenza del laser tra uno e il 2% e spegnere i filtri notch. Utilizzare il laser a 405 nanometri e il rilevatore PMT per osservare la macchia di acido nucleico. Il rivelatore ibrido per il rilevamento degli anticorpi CD8 e il laser a 488 nanometri e il rilevatore ibrido per visualizzare il tetramero dell'insulina.Centra l'isolotto di interesse nel campo visivo usando le manopole X e Y del controller dello stage. Una volta individuato un isolotto di interesse, passa all'obiettivo 20X e ingrandisci in modo che l'isolotto occupi la maggior parte dell'inquadratura. Prendi una z-stack dell'isolotto, quindi trova le migliori sezioni ottiche in cui le cellule sono vive e tutte le cellule immunitarie circostanti sono a fuoco.Impostare il microscopio per registrare in modalità XYZT e ottimizzare le impostazioni per registrare uno z-stack dei passaggi selezionati ogni 20 minuti per un periodo di diverse ore. Le isole in una fetta di tessuto pancreatico sono state visualizzate utilizzando la microscopia a campo luminoso e a luce riflessa. L'insulina nelle isole aumenta la granularità e provoca l'assorbimento di grandi quantità di luce riflessa, aumentando la visibilità delle isole.La vitalità di una fetta di tessuto pancreatico umano vivo è stata valutata mediante colorazione. Le cellule vive sono indicate in verde e le cellule morte in blu. Un altro indicatore positivo per la vitalità è l'attività basale osservabile.Quando una fetta pancreatica viva è stata caricata con un indicatore di calcio permeabile alle cellule, la stimolazione del glucosio è stata osservata sia nelle fette pancreatiche di topo che in quelle umane. È stata anche quantificata la fluorescenza delle singole cellule durante la stimolazione del glucosio. Isole intatte e malate sono state osservate utilizzando la colorazione del ditizone e la microscopia a luce riflessa.Le isole malate iniziano a perdere granularità a causa dell'infiltrazione delle cellule immunitarie e della morte cellulare. Le popolazioni di cellule immunitarie possono essere identificate utilizzando anticorpi CD8 e colorazione del tetramero dell'insulina. La co-colorazione indica che le cellule sono cellule T effettrici che mirano specificamente all'antigene dell'insulina.La cosa più critica da ricordare in questa procedura è mantenere le fette in soluzioni inibitore della proteasi in ogni momento. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire numerose funzionalità negli esperimenti sulle cellule immunitarie che consentono di studiare l'effetto delle interazioni delle cellule immunitarie e della funzione delle isole.

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Presentiamo qui un protocollo per l'isolamento delle isole dal modello murino di diabete di tipo 2, Leprdb e i dettagli di un test su cellule vive per la misurazione della secrezione di insulina da isole intatte che utilizza la microscopia a 2 fotoni.

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Ex vivo dell'isolotto pancreatico studi sono importanti per la ricerca sul diabete. Le tecniche esistenti per studiare isolotti coltivati nella loro architettura 3-dimensionale nativo sono che richiede tempo, inefficiente e utilizzati raramente. Questo lavoro descrive un metodo nuovo, semplice ed efficiente per la generazione di sezioni di paraffina di alta qualità di isolotti tutta coltivati.

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Qui presentiamo un protocollo per l'imaging e la quantificazione della dinamica del calcio in popolazioni cellulari eterogenee, come le cellule delle isolotiche pancreatiche. I reporter fluorescenti vengono consegnati nello strato periferico delle cellule all'interno dell'isolotto, che viene poi immobilizzato e immagine, e viene eseguita l'analisi per cellula della dinamica dell'intensità della fluorescenza.

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L'obiettivo di questo protocollo è quello di monitorare continuamente le dinamiche del processo di innesto dell'isolotto pancreatico umano e delle cellule che contribuiscono tra l'ospite e il donatore. Ciò si ottiene trapiantando isolotti umani nella camera anteriore dell'occhio (ACE) di un NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-destinatario del mouse seguito da ripetute immagini a 2 fotoni.

Longitudinale in Vivo Imaging e quantificazione dell'isolotto pancreatico umano Innesto e contribuendo cellule ospitanti nella camera occhio anteriore

Presentiamo la preparazione di fette di tessuto pancreatico acuto e il loro utilizzo nella microscopia a scansione laser confocale per studiare la dinamica del calcio contemporaneamente in un gran numero di cellule vive, per lunghi periodi di tempo e con alta risoluzione spaziotemporale.

Microscopia a scansione laser confocale della dinamica del calcio in fette di tessuto pancreatico di topo acuto

L'imaging ad alta risoluzione in vivo del pancreas è stato facilitato con la finestra di imaging intravitale pancreatico.

Visualizzazione longitudinale stabilizzata a livello cellulare in vivo del pancreas in un modello murino con una finestra di imaging intravitale pancreatico

Questo protocollo descrive come generare fette di pancreas umano da donatori di organi deceduti per studiare la funzione cellulare in condizioni quasi fisiologiche. Questo approccio innovativo consente lo studio di isole normali e strutturalmente danneggiate e l'intricata interazione tra compartimenti endocrini ed esocrini.

Generazione di fette di tessuto pancreatico umano per studiare la fisiologia del pancreas endocrino ed esocrino

Scopri la fisiologia delle isole pancreatiche e le interazioni con le cellule immunitarie utilizzando fette di tessuto pancreatico vivo. Questo metodo preserva il microambiente nativo per studiare patologie come il diabete.

Osservare la funzione delle isole e le interazioni isolo-cellule immunitarie nelle fette di tessuto pancreatico vivo

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