Raccolta e disaggregazione: un passo trascurato nella ricerca sui metodi di biofilm

L'obiettivo generale di queste procedure è quello di raccogliere e disaggregare i biofilm in modo ottimale in modo da aumentare la riproducibilità. Tre tecniche saranno dimostrate in questo video, ognuna incentrata sulla raccolta e la disaggregazione da un diverso tipo di superficie. Questo video dimostrerà le tecniche appropriate per uno, vortice e sonicazione biofilm da una superficie dura non porosa come un coupon in policarbonato dal reattore a biofilm CDC.

Due, la raschiatura e l'omogeneizzazione del biofilm dalla superficie di vetro borosilicato duro non poroso che si trova comunemente nel reattore a flusso a goccia. E tre, il raschiamento, il vortice e la sonicazione del biofilm da una superficie porosa del tubo di silicone che si trova comunemente nel modello di catetere. Ciao, mi chiamo Kelly Buckingham-Meyer qui al Standardized Biofilm Methods Lab.

Nel nostro laboratorio, suddividiamo i metodi del biofilm in quattro componenti: crescita, trattamento, campionamento e analisi. Nella letteratura peer-reviewed, i dettagli su come i biofilm vengono campionati o raccolti e disaggregati da una superficie sono in genere scarsi. Questo è il motivo di questo video.

Poiché il nostro laboratorio sviluppa e testa metodi standardizzati di biofilm, abbiamo condotto un'ampia revisione della letteratura in cui sono stati identificati i tre metodi più comuni di raccolta e disaggregazione del biofilm. Questi metodi sono il vortice e la sonicazione del biofilm da un coupon in policarbonato, la raschiatura e l'omogeneizzazione del biofilm da un coupon di vetro borosilicato e la raschiatura, il vortice e la sonicazione del biofilm da tubi in silicone. Mentre i metodi scritti su carta sono potenti, speriamo che il video con i dettagli tecnici presentati dalla mia collega Lindsey Miller e da me sarà utile.

Per iniziare, coltivare il biofilm maturo Pseudomonas aeruginosa 15442 secondo lo standard ASTM E2562, il metodo di prova standard per la quantificazione del biofilm pseudomonas aeruginosa coltivato con taglio elevato e flusso continuo utilizzando il reattore a biofilm CDC. Alla fine del periodo di crescita di 48 ore, preparati a trattare e campionare i coupon secondo lo standard ASTM E2871, il metodo di prova standard per determinare l'efficacia del disinfettante contro il biofilm coltivato nel reattore a biofilm CDC utilizzando il metodo a tubo singolo. Quindi inserire asetticamente paraspruzzi autoclavati in tubi conici sterili da 50 millilitri utilizzando pinze sterilizzate a fiamma.

Ripetere per tutti i tubi che riceveranno il trattamento. I tubi per i coupon di controllo non hanno bisogno di un paraspruzzi. Rimuovere asetticamente un'asta dal reattore a biofilm CDC e risciacquarla in 30 millilitri di acqua di diluizione sterile.

Questo rimuoverà le cellule liberamente attaccate dal biofilm. Tenere l'asta parallela al piano di lavoro sopra i tubi del campione con paraspruzzi. Utilizzando una chiave a brugola sterilizzata a fiamma, allentare le viti impostate per far cadere un coupon rivestito di biofilm nel tubo.

Ripeti per il numero desiderato di coupon. Rimuovere i paraspruzzi e posizionare i paraspruzzi in un contenitore separato per la sterilizzazione. Utilizzando una pipetta sierologica da cinque millilitri, pipettare lentamente quattro millilitri di trattamento o controllo nei tubi in modo che il liquido scorra lungo l'interno della parete del tubo.

Ruotare delicatamente il fondo del tubo in modo che eventuali bolle d'aria sotto la cedola vengano spostate. Attendere da 30 a 60 secondi tra ogni aggiunta. Alla fine del tempo di contatto specificato, pipettare 36 millilitri di neutralizzatore nei tubi nello stesso ordine in cui è stato applicato il trattamento o il controllo.

Ruota ogni tubo sull'impostazione più alta per 30 più o meno cinque secondi e assicurati che si raggiunga un vortice completo. Posizionare i tubi nella cremagliera sospesa nel sonicatore degassato in modo tale che il livello dell'acqua nella vasca da bagno sia uguale al livello dell'acqua nei tubi. Sonicare i campioni a 45 kilohertz, potenza al 100% e funzione normale per 30 più o meno cinque secondi.

Ripeti i cicli di vortice e sonicazione e termina con un vortice finale, per un totale di cinque cicli. Infine, diluire in serie il campione, placcare la diluizione su agar R2A e incubare le piastre per 24 ore a 36 gradi Celsius. Contare le colonie come appropriato al metodo di placcatura e registrare i dati.

Questa prossima tecnica di raccolta e disaggregazione del biofilm è utile per i coupon rigidi non porosi che sono lo standard nel reattore a flusso di gocciolamento. Coltivare un biofilm pseudomonas aeruginosa 15442 maturo secondo lo standard ASTM E2647 il metodo di prova standard per la quantificazione del biofilm pseudomonas aeruginosa coltivato utilizzando il reattore a biofilm a flusso a goccia con basso taglio e flusso continuo. Impostare la stazione di campionamento per includere una scheda di campionamento, etanolo al 95% in un becher, un bruciatore di alcol, emostati, uno strumento di rimozione dei coupon, bicchieri con acqua di diluizione sterile e tubi di diluizione per il risciacquo dei coupon.

Spegnere la pompa, rimuovere il coperchio del canale e utilizzare lo strumento di rimozione del coupon sterile e gli emostati per rimuovere il coupon, facendo attenzione a non disturbare il biofilm. Risciacquare la cedola immergendola delicatamente con un movimento fluido in 45 millilitri di acqua di diluizione sterile contenuta in un tubo di centrifuga da 50 millilitri. Invertire immediatamente il movimento per rimuovere il coupon.

Posizionare il coupon in un becher contenente 45 millilitri di acqua di diluizione sterile. Raschiare la superficie del coupon ricoperta di biofilm in direzione verso il basso per circa 15 secondi usando una spatola sterile o un raschietto. Risciacquare la spatola o il raschietto mescolandolo nel becher.

Ripetere il processo di raschiatura e risciacquo tre o quattro volte assicurando la copertura completa della superficie del coupon. Risciacquare il coupon tenendolo con un angolo di 60 gradi sopra il becher sterile e pipettare un millilitro di acqua di diluizione sterile sulla superficie del coupon. Ripetere l'operazione per un totale di cinque risciacqui.

Il volume finale nel becher è ora di 50 millilitri. Lavorando nell'armadio di biosicurezza, omogeneizzare il campione di biofilm raschiato. Collegare una sonda omogeneizzatore sterile all'omogeneizzatore.

Posizionare la punta della sonda nel liquido e accendere l'omogeneizzatore e rampare fino a 20.500 giri / min. Omogeneizzare il campione per 30 secondi. Abbassare l'RPM e spegnere l'omogeneizzatore.

Sanificare la sonda tra i campioni di biofilm omogeneizzando in nove millilitri di diluizione sterile in bianco a 20.500 RPM per 30 secondi come descritto sopra. Omogeneizzare un tubo da nove millilitri di etanolo al 70% per 30 secondi e staccare la sonda e lasciarla riposare nel tubo di etanolo per un minuto. Omogeneizzare due spazi vuoti di diluizione aggiuntivi.

Inoltre, per ogni campione può essere utilizzata una sonda omogeneizzatore monouso sterile. Diluire in serie il campione omogeneizzato, placcare le diluizioni su R2A utilizzando il metodo di placcatura appropriato e incubare le piastre per 24 ore a 36 gradi Celsius. Conta le colonie e registra i dati.

Questa tecnica finale di raccolta e disaggregazione del biofilm è utile per il biofilm coltivato in tubi porosi come il tubo in silicone utilizzato nel modello di catetere. Per iniziare questa procedura, coltivare un biofilm E.coli 53498 maturo in tubi catetere siliconici. Preparare i materiali di campionamento: tubi risciacquati, un tubo centrifugo sterile, una capsula di Petri sterile vuota, emostati in acciaio inossidabile sterilizzati a fiamma, forbici, timer e un righello.

Con la pompa in pausa, utilizzare il 70% di etanolo per pulire l'esterno del tubo. Misurare due centimetri dall'estremità, evitando l'area attaccata al connettore, e contrassegnare i tubi per determinare le posizioni di taglio. Con le forbici sterilizzate a fiamma, tagliare il tubo sul segno di due centimetri.

Risciacquare il segmento del tubo per rimuovere le cellule planctoniche. Con una pinza sterilizzata a fiamma, immergere delicatamente il segmento del tubo in 20 millilitri di acqua di diluizione sterile, quindi rimuovere immediatamente. Posizionare il segmento in 10 millilitri di neutralizzatore.

Con una pinza sterilizzata a fiamma, tenere il segmento del tubo e raschiare con un bastoncino applicatore sterile in legno fino a quando tutte le aree interne del tubo non sono state raschiate. Risciacquare occasionalmente il bastoncino nei 10 millilitri di neutralizzatore e riposizionare il segmento nella provetta del campione. Il segmento dei tubi raschiati è ora la diluizione da 10 a zero o zero.

Ruota ogni tubo sull'impostazione più alta per 30 più o meno cinque secondi. Posizionare i tubi nella cremagliera sospesa nel bagno sonicatore, in modo tale che il livello dell'acqua nella vasca sia uguale al livello del liquido nei tubi. Sonicare a 45 kilohertz, potenza del 100% e funzione normale per 30 più o meno cinque secondi.

Ripeti questo vortice e il ciclo di sonicazione, quindi termina con il vortice finale. Diluire in serie i campioni in acqua tamponata. Piastra su agar di soia triptica utilizzando il metodo di placcatura appropriato e quindi incubare i tubi a 36 più o meno due gradi Celsius per 24 ore.

Contare le colonie in base al metodo di placcatura utilizzato e registrare i dati per calcolare la media aritmetica. Queste quattro immagini scattate da Danielle Or e Blaine Fritz aiutano a illustrare l'importanza di questa procedura di raccolta e disaggregazione. Tutti e quattro questi coupon sono stati colorati con viola cristallo per aiutare a visualizzare la quantità di biofilm pseudomonas aeruginosa presente sui coupon prima e dopo il vortice e il processo di sonicazione.

Il coupon A è completamente coperto da biofilm, mentre i coupon B, C e D hanno tutti sostanzialmente meno biofilm sulla loro superficie. I tagliandi B, C e D sono stati tutti sottoposti al vortice e al processo di sonicazione descritto in precedenza. Queste due immagini scattate da Lindsey Miller su un microscopio confocale con ingrandimento 12,5X raffigurano un biofilm pseudomonas aeruginosa che è stato trattato con la macchia viva / morta di retroilluminazione.

L'immagine a sinistra è stata sonicata a 45 kilohertz e 10% di potenza, mentre l'immagine a destra è stata sonicata a 45 kilohertz e 100% di potenza. Chiaramente, il coupon a sinistra ha molto più biofilm che rimane sulla sua superficie rispetto al coupon a destra. Questa figura finale mostra come la manipolazione di diversi parametri di sonicazione influisce sulla quantità di biofilm di Pseudomonas aeruginosa rimosso dalla superficie della cedola.

Tutti questi coupon sono stati sonicati a 45 kilohertz, potenza del 100% e impostazione normale per 30 più o meno cinque secondi. Queste immagini sono state scattate con un ingrandimento di 12,5 volte da Lindsey Miller. I tagliandi nella prima fila sono stati sonicati in acqua di diluizione, mentre i tagliandi nella seconda fila sono stati sonicati in brodo neutralizzante DE.

Sembra che ci sia meno biofilm rimanente sui tagliandi che sono stati sonicati in brodo DE che contiene un tensioattivo rispetto all'acqua di diluizione. I tagliandi A, B, E e F sono stati tutti sonicati in un volume di 10 millilitri, mentre i coupon C, D, G e H sono stati sonicati in 40 millilitri di soluzione. C'è chiaramente meno biofilm sui coupon che sono stati sonicati nei volumi più piccoli.

I tagliandi A, C, E e G sono stati sonicati nella vasca da bagno con tre tubi contemporaneamente, mentre i coupon B, D, F e H sono stati sonicati in un bagno con 12 tubi contemporaneamente. Sembra che i campioni sonicati con meno tubi abbiano mostrato una raccolta di biofilm superiore. In definitiva, ridurre al minimo il volume nei tubi, ridurre il numero di tubi sonicati contemporaneamente e l'uso di brodo neutralizzante DE sembrano tutti contribuire a migliorare la raccolta di biofilm.

Non esiste un metodo perfetto per raccogliere e disaggregare il biofilm, ma alcuni approcci sono migliori per diverse superfici e / o applicazioni. Le tecniche dimostrate in questo video sono i tre metodi più comuni secondo una revisione della letteratura. Queste tre tecniche possono fornire un punto di partenza per i ricercatori.

È importante prendersi il tempo necessario per convalidare il metodo di raccolta e disaggregazione scelto. Tutte le apparecchiature sono leggermente diverse, quindi anche se il metodo è stato standardizzato, è comunque prudente confermare il processo per l'attrezzatura utilizzata. La ricerca ha dimostrato che scelte improprie possono portare a risultati di test distorti.

Dopo aver visto questo video, si spera che queste informazioni aiuteranno i ricercatori a prendere decisioni più informate su quale metodo utilizzare e forniranno indicazioni su come migliorare la riproducibilità per i tre tipi di superficie e le tecniche complementari di raccolta e disaggregazione.