Name: Raccolta e disaggregazione: un passo trascurato nella ricerca sui metodi di biofilm (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 25 s
Description: Scopri tre tecniche di raccolta e disaggregazione di biofilm per superfici in policarbonato, vetro borosilicato e tubi in silicone. Questo metodo ottimizza la riproducibilità e riduce i bias nella ricerca microbiologica.

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Desideriamo ringraziare Danielle Orr Goveia, Blaine Fritz, Jennifer Summers e Fei San Lee per i loro contributi a questo documento.

1. Vortice e sonicazione
<ol><li>Coltivare un biofilm maturo di P. aeruginosa ATCC 15442 coltivato secondo lo standard ASTM E25622.</li>
	<li>Alla fine del periodo di crescita di 48 ore, preparati a trattare il biofilm e i coupon campione secondo lo standard ASTM E28718
</li>
	<li>Inserire asetticamente paraspruzzi autoclavati in tubi conici sterili da 50 ml utilizzando pinze sterilizzate a fiamma. Ripetere per tutti i tubi che riceveranno il trattamento. I tubi per i coupon di controllo non hanno bisogno di un paraspruzzi.</li>
	<li>Rimuovere asetticamente un'asta selezionata casualmente dal reattore a biofilm CDC. Risciacquare i tagliandi per rimuovere le cellule attaccate liberamente immergendo delicatamente l'asta in 30 ml di acqua tamponata sterile.</li>
	<li>Tenere l'asta parallela al piano di lavoro, su un tubo conico vuoto e sterile da 50 ml e utilizzando una chiave a brugola sterilizzata a fiamma, allentare la vite per far cadere un coupon rivestito di biofilm nel tubo. Ripeti per il numero desiderato di coupon. Rimuovere i paraspruzzi e metterli in un contenitore separato per la sterilizzazione.</li>
	<li>Utilizzando una pipetta sierologica da 5 ml, pipettare lentamente 4 mL del trattamento o del controllo nei tubi in modo che il liquido scorra lungo l'interno della parete del tubo.</li>
	<li>Picchiettare delicatamente il fondo del tubo in modo che eventuali bolle d'aria sotto il coupon vengano spostate. Consentire 30 - 60 s tra ogni aggiunta.</li>
	<li>Alla fine del tempo di contatto specificato, pipettare 36 mL di neutralizzatore nei tubi nello stesso ordine in cui è stato applicato il trattamento (o il controllo). NOTA: Il volume finale del trattamento combinato e del neutralizzatore è importante per determinare con precisione la densità del log del biofilm.</li>
	<li>Vortice ogni tubo sull'impostazione più alta per 30 ± 5 s. Assicurarsi che si raggiunga un vortice completo. NOTA: Si deve prestare attenzione quando si vorticolano tagliandi pesanti come l'acciaio inossidabile in flaconcini di vetro in cui potrebbe verificarsi la rottura.</li>
	<li>Determinare il numero ottimale di provette per bagno e il posizionamento all'interno del rack della provetta prima di elaborare i campioni effettivi. Se si elaborano più campioni, verificare che la temperatura dell'acqua nel bagno sonicante sia di 21 ± 2 oC.</li>
	<li>Posizionare i tubi nella cremagliera sospesa nel sonicatore degassato in modo tale che il livello dell'acqua nel bagno sia uguale al livello del liquido nei tubi. Sonicate a 45 kHz, potenza al 100% e funzione normale per 30 ± 5 s. Ripeti i cicli di vortice e sonicazione e poi termina con un vortice finale (5 cicli totali). NOTA: Questi tubi con il biofilm raccolto e disaggregato sono la diluizione 100 o 0.</li>
	<li>Campione diluito in serie in acqua tamponata. Piastra su agar R2A utilizzando il metodo di placcatura appropriato. Incubare a 36 ± 2 oC per 24 ore. Contare le colonie in base al metodo di placcatura utilizzato e registrare i dati.</li>
</ol>2. Raschiatura e omogeneizzazione
<ol><li>Coltivare un biofilm maturo di P. aeruginosa ATCC 15442 secondo lo standard ASTM E264713.</li>
	<li>Impostare la stazione di campionamento per includere il pannello di campionamento, l'etanolo al 95% in un becher, il bruciatore di alcol, gli emostati, lo strumento di rimozione dei coupon, i becher con acqua di diluizione sterile e i tubi di diluizione per il risciacquo dei coupon.</li>
	<li>Spegnere la pompa. Rimuovere una copertura del canale e utilizzare uno strumento sterile per la rimozione del coupon e gli emostati per rimuovere il coupon, facendo attenzione a non disturbare il biofilm.</li>
	<li>Risciacquare la cedola immergendola delicatamente, con un movimento fluido, in 45 ml di acqua di diluizione sterile (contenuta in un tubo centrifuga da 50 ml). Invertire immediatamente il movimento per rimuovere il coupon.</li>
	<li>Inserire il coupon in un becher contenente 45 ml di acqua di diluizione sterile. Raschiare la superficie della cedola ricoperta di biofilm in direzione verso il basso per circa 15 s, usando una spatola sterile o un raschietto. Risciacquare la spatola o il raschietto mescolandolo nel becher. Ripetere il processo di raschiatura e risciacquo 3-4 volte, garantendo la copertura completa della superficie del coupon.</li>
	<li>Risciacquare la cedola tenendola con un angolo di 60° sul becher sterile e pipettare 1 mL di acqua di diluizione sterile sulla superficie della cedola. Ripetere l'operazione per un totale di 5 risciacqui. Il volume finale nel becher è di 50 ml. NOTA: Il volume finale del trattamento combinato e del neutralizzatore è importante per determinare con precisione la densità del log del biofilm.</li>
	<li>Sostituisci ogni copertina del canale man mano che i coupon vengono rimossi.</li>
	<li>Lavorando nell'armadio di biosicurezza, omogeneizzare il campione di biofilm raschiato. Collegare una sonda omogeneizzatore sterile all'omogeneizzatore, posizionare la punta della sonda nel liquido, accendere l'omogeneizzatore e rampare fino a 20.500 giri / min.</li>
	<li>Omogeneizzare il campione per 30 s. Abbassare gli RPM e spegnere l'omogeneizzatore.</li>
	<li>Sanificare la sonda tra i campioni di biofilm omogeneizzando un vuoto di diluizione sterile di 9 ml a 20.500 giri / min per 30 s come descritto sopra. Omogeneizzare un tubo da 9 ml di etanolo al 70% per 30 s, staccare la sonda e lasciare riposare il tubo di etanolo per 1 minuto. Omogeneizzare due spazi vuoti di diluizione aggiuntivi. NOTA: per ogni campione può essere utilizzata una sonda omogeneizzatore monouso.</li>
	<li>Diluire in serie i campioni in acqua tamponata. Piastra su agar R2A utilizzando il metodo di placcatura appropriato. Incubare le piastre a 36 ± 2oC per 24 ore, contare le colonie come appropriato al metodo di placcatura utilizzato e registrare i dati.</li>
</ol>3. Raschiatura, vortice e sonicazione
<ol><li>Coltivare un biofilm maturo Escherichia coli ATCC 53498 in tubo catetere siliconico10.</li>
	<li>Preparare i materiali di campionamento: tubi di risciacquo, tubo centrifugo sterile, piastra di Petri sterile vuota, emostato e forbici in acciaio inossidabile sterilizzato a fiamma, timer e righello.</li>
	<li>Con la pompa in pausa, utilizzare il 70% di etanolo per pulire l'esterno del tubo. Misurare 2 cm dall'estremità, evitando l'area attaccata al connettore, e contrassegnare il tubo per determinare le posizioni di taglio.</li>
	<li>Con le forbici sterilizzate a fiamma, tagliare il tubo sul segno di 2 cm e posizionare il segmento in una capsula di Petri sterile vuota. Pulire il tubo con etanolo al 70% e ricollegare l'estremità distale al tubo di scarico.</li>
	<li>Risciacquare il segmento del tubo per rimuovere le cellule planctoniche. Con una pinza sterilizzata a fiamma, immergere delicatamente il segmento del tubo in 20 ml di acqua di diluizione sterile e quindi rimuovere immediatamente. Posizionare il segmento in 10 ml di neutralizzatore.</li>
	<li>Con una pinza sterilizzata a fiamma, tenere premuto il segmento del tubo e raschiare con un bastoncino applicatore di legno sterile fino a quando tutte le aree interne del tubo sono state raschiate. Risciacquare occasionalmente il bastoncino nei 10 ml di neutralizzatore e riposizionare il segmento nella provetta del campione. Il segmento dei tubi raschiati è la diluizione 100 o 0. NOTA: Il volume finale del trattamento combinato e del neutralizzatore è importante per determinare con precisione la densità del log del biofilm.</li>
	<li>Vortice ogni tubo sull'impostazione più alta per 30 ± 5 s. Posizionare il tubo nel rack del tubo sospeso nel sonicatore in modo tale che il livello dell'acqua nel bagno sia uguale al livello del liquido nei tubi. Sonicate a 45 kHz, potenza al 100% e funzione normale per 30 ± 5 secondi. Ripeti i cicli di vortice e sonicazione, quindi termina con un vortice finale. NOTA: Questo tubo con il biofilm raccolto e disaggregato è la diluizione 100 .</li>
	<li>Diluire in serie i campioni in acqua tamponata. Piastra su Tryptic Soy Agar utilizzando il metodo di placcatura appropriato.</li>
	<li>Incubare le piastre a 36 ± 2 oC per 24 ore. Contare le colonie in base al metodo di placcatura utilizzato, registrare i dati e calcolare la media aritmetica.</li>
</ol>

<ol><li>Donlan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+microbial+life+on+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Biofilms: microbial life on surfaces.</a> Emerging Infectious Diseases. 8 (9), 881-890 (2002).</li>
<li>ASTM International. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ASTM+Standard+E2562%2C+2017%2C+Standard+Test+Method+for+Quantification+of+Pseudomonas+aeruginosa+Biofilm+Grown+with+High+Shear+and+Continuous+Flow+using+CDC+Biofilm+Reactor%5BTitle%5D)+AND+%22ASTM+International%22%5BJournal%5D)">ASTM Standard E2562, 2017, Standard Test Method for Quantification of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Grown with High Shear and Continuous Flow using CDC Biofilm Reactor.</a> ASTM International. , West Conshohocken, PA. (2017).</li>
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<li>Stiefel, P., Schmidt-Emrich, S., Manuira-Weber, K., Ren, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+aspects+of+using+bacterial+cell+viability+assays+with+the+fluorophores+SYTO9+and+propidium+iodide%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide.</a> BMC Microbiology. , (2015).</li>
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<li>Elma GmbH & Co. KG TI-H Ultrasonic Cleaning Units: Operating Instructions. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Elma+GmbH+%26+Co%22">Elma GmbH & Co</a>. , Singen, Germany. (2009).</li>
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<li>Suslick, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sonochemistry.</a> Science. 247 (4949), (1990).</li>
</ol>

Gli autori non hanno divulgazioni.

Informazioni minime per i metodi di raccolta e disaggregazione Per creare dati riproducibili sul biofilm in tutta la comunità scientifica, è imperativo che gli autori includano il maggior numero possibile di dettagli su ciascuna delle fasi di crescita, trattamento, campionamento e analisi di un metodo di biofilm. La standardizzazione dei metodi del biofilm ha aiutato in questo sforzo in quanto consente al ricercatore di fare riferimento a un metodo specifico e ad eventuali modifiche rilevanti. Tuttavi...

La definizione di biofilm si è evoluta negli ultimi decenni e comprende l'associazione microbica con una varietà di superfici biologiche e/o non biologiche, l'inclusione di componenti noncellulari1 che mostrano una crescita e un'espressione genetica diverse2 all'interno di una matrice. Il biofilm fornisce protezione dagli stress ambientali come l'essiccazione e può rendere l'azione dei disinfettanti chimici meno efficace con conseguente sopravvivenza dei microbi. I sopravvissuti all'interno di un biofilm possono potenzialmente fornire una fonte di microrganismi patogeni che sono un problema di salute pubblica3.
I metodi di biofilm sono composti da quattro fasi: crescita, trattamento, campionamento (raccolta e disaggregazione) e analisi. La crescita, il primo passo, in cui l'utente determina le condizioni di crescita dell'organismo, la temperatura, i mezzi, ecc., È il più considerato e riportato nella letteratura sui biofilm4,5,6,7. La fase di trattamento valuta gli antimicrobici (ad esempio, disinfettanti) per determinarne l'efficacia contro un biofilm maturo3,8,9 o l'antimicrobico può essere incorporato nella superficie per determinare la capacità del prodotto di prevenire o ridurre la crescita del biofilm10. La terza fase, il campionamento, include passaggi per raccogliere il biofilm dalla superficie su cui stava crescendo e per disaggregare i grumi rimossi3,8,11. La quarta fase, l'analisi, può includere conteggi cellulari vitali, microscopia, misurazioni di fluorescenza, esiti molecolari e/o una valutazione dei componenti della matrice8,9. La valutazione dei dati fornisce informazioni sull'esito di un esperimento. Dei quattro, il campionamento è spesso il passaggio più trascurato perché presume che la tecnica di raccolta e/o disaggregazione del biofilm scelta sia efficace al 100%, spesso senza verifica11.
Le sospensioni planctoniche di batteri, spesso considerate omogenee, richiedono un semplice vortice prima dell'analisi. I biofilm, invece, sono comunità complesse composte da microrganismi (procariotici e/o eucariotici), esopolisaccaridi, proteine, lipidi, DNA extracellulare e cellule ospiti12. Sono necessari passi oltre i tradizionali metodi di coltura microbiologica planctonica per raccogliere adeguatamente il biofilm da una superficie e quindi disaggregarlo in una sospensione monocellulare omogenea. Un'ampia rassegna della letteratura (informazioni non incluse in questa pubblicazione) ha dimostrato che la scelta della tecnica di rimozione e disaggregazione dipende da una serie di fattori, tra cui le specie presenti nel biofilm, la superficie a cui è attaccato il biofilm (non porosa o porosa), l'accessibilità alle superfici di crescita (cedola facilmente rimovibile o distruzione fisica dell'apparato in cui il biofilm sta crescendo), geometria della superficie (area e forma), densità del biofilm sulle superfici di crescita e attrezzature di laboratorio disponibili.
Quando il biofilm viene raccolto da una superficie, la sospensione cellulare risultante è eterogenea. Se questa sospensione non uniforme deve essere enumerata con precisione, deve essere disaggregata in singole celle. I conteggi delle piastre vitali presuppongono che un'unità formante una colonia provenga da un batterio. Se gli aggregati di biofilm sono posizionati sul terreno di crescita, è impossibile distinguere le singole cellule che potrebbero portare a stime imprecise. Ad esempio, durante i test di efficacia del disinfettante, se un trattamento rimuove il biofilm in modo molto efficace da una superficie rispetto al controllo, la riduzione del log potrebbe apparire artificialmente grande rispetto al controllo. D'altra parte, un disinfettante chimico che fissa il biofilm su una superficie rispetto al controllo sembrerà avere una riduzione del log inferiore11. Questo tipo di scenario potrebbe portare a un'interpretazione distorta dei dati sperimentali.
In preparazione alla pubblicazione, una revisione della letteratura ha determinato che gli approcci comuni alla raccolta e alla disaggregazione del biofilm includono raschiatura, tampone, sonicazione, vortice o una combinazione di questi. La raschiatura è definita come la rimozione fisica del biofilm dalle superfici con un bastone sterile, una spatola o un altro strumento. Il tampone si riferisce alla rimozione del biofilm dalle superfici con un bastoncino con punta di cotone o altro materiale assorbente fisso. La sonicazione si riferisce alla rottura del biofilm dalle superfici tramite onde ultrasoniche distribuite attraverso l'acqua. Il vortice si riferisce all'uso di un miscelatore per ottenere un vortice liquido del campione all'interno di un tubo. L'omogeneizzazione utilizza lame rotanti per tagliare i grumi di biofilm raccolti in una sospensione a singola cellula. In questo articolo, presentiamo tre metodi di raccolta e disaggregazione per due diversi tipi di superficie, dura / non porosa e porosa.
Viene fornito un elenco di informazioni minime raccomandate che i ricercatori dovrebbero includere nelle sezioni sui metodi delle pubblicazioni. Speriamo che l'inclusione di queste informazioni consenta ad altri ricercatori di riprodurre il loro lavoro. Non esiste un metodo di raccolta e disaggregazione perfetto, pertanto vengono fornite anche raccomandazioni su come controllare la tecnica.
Tre metodi comuni per raccogliere e disaggregare il biofilm da superfici di crescita comuni sono dimostrati in questo articolo. Queste informazioni consentiranno ai ricercatori di comprendere meglio la precisione complessiva e la distorsione di un metodo di prova del biofilm. I metodi descritti sono i seguenti: (1) Un biofilm pseudomonas aeruginosa coltivato su cedole di policarbonato (superficie dura non porosa) sotto elevato taglio fluido nel reattore a biofilm CDC viene raccolto e disaggregato seguendo una combinazione in cinque fasi di vortice e sonicazione per ottenere la raccolta e la disaggregazione del biofilm (2) A P. aeruginosa il biofilm coltivato su cedole di vetro borosilicato (superficie dura non porosa) nel reattore a flusso di gocciolamento sotto basso taglio fluido viene raccolto e disaggregato utilizzando raschiatura e omogeneizzazione (3) Un biofilm di Escherichia coli coltivato in tubi di silicone (superficie porosa) viene raccolto e disaggregato usando raschiatura, seguito da sonicazione e vortice.

<table><tbody><tr><td>Fiale coniche da 50 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>becher in vetro da 100 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB102100</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sierologiche da 5 mL Fisher</td><td>Scientific</td><td>13-678-12D</td><td>Per l'aggiunta del trattamento alle fiale contenenti coupon.</td></tr><tr><td>Pipette sierologiche da 50 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-14C</td><td>Per l'aggiunta di neutralizzante alle fiale al termine del tempo di contatto del trattamento.</td></tr><tr><td>Bastoncini applicatori</td><td>Puritan</td><td>807</td><td></td></tr><tr><td>Emostatici</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-115</td><td></td></tr><tr><td>Spatola metallica</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-373</td><td></td></tr><tr><td>Poliziotti in PTFE</td><td>Saint-Gobain</td><td>06369-04</td><td></td></tr><tr><td>S 10 N - 10 G - ST Strumento di dispersione</td><td>IKA</td><td>4446700</td><td>Per l'omogeneizzazione di campioni di biofilm.</td></tr><tr><td>Forbici</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-951-20</td><td></td></tr><tr><td>Catetere di Foley in silicone, misura 16 French</td><td>Medline Industries</td><td>DYND11502</td><td></td></tr><tr><td>Tubo in silicone, misura 16</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW96400-16</td><td></td></tr><tr><td>Splash Guards</td><td>BioSurface Technologies, Inc.</td><td>CBR 2232</td><td></td></tr><tr><td>T 10 dispersore basico ULTRA-TURRAX</td><td>IKA</td><td>3737001</td><td>Per l'omogeneizzazione di campioni di biofilm.</td></tr><tr><td>Connettori per tubi</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW02023-86</td><td></td></tr><tr><td>Pulitore ad ultrasuoni</td><td>Elma</td><td>TI-H15</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2 Supporto per provette verticale da 50 mL</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-V506</td><td></td></tr></tbody></table>

raccolta e disaggregazione: un passo trascurato nella ricerca sui metodi di biofilm

Harvesting and Disaggregation: An Overlooked Step in Biofilm Methods Research

I metodi del biofilm consistono in quattro fasi distinte: far crescere il biofilm in un modello pertinente, trattare il biofilm maturo, raccogliere il biofilm dalla superficie e disaggregare i ciuffi e analizzare il campione. Delle quattro fasi, la raccolta e la disaggregazione sono le meno studiate, ma comunque critiche quando si considera il potenziale di distorsione dei test. Questo articolo dimostra le tecniche di raccolta e disaggregazione comunemente usate per il biofilm coltivato su tre diverse superfici. Le tre tecniche di raccolta e disaggregazione del biofilm, raccolte da un'ampia revisione della letteratura, includono vortice e sonicazione, raschiatura e omogeneizzazione e raschiatura, vortice e sonicazione. Vengono considerati due tipi di superficie: duro non poroso (policarbonato e vetro borosilicato) e poroso (silicone). Inoltre, forniamo raccomandazioni per le informazioni minime che dovrebbero essere incluse quando si segnala la tecnica di raccolta seguita e un metodo di accompagnamento per verificare la presenza di pregiudizi.

Validazione/Conferma di un metodo di raccolta Diversi studi condotti nel nostro laboratorio hanno esaminato la capacità del vortice e della sonicazione di raccogliere efficacemente il biofilm coltivato nel reattore a biofilm (ASTM E2562)2 utilizzando il metodo a tubo singolo (ASTM E2871)8.
Un biofilm P. aeruginosa ATCC 15442 è stato coltivato secondo ASTM E25622 su tagliandi di vetro borosilicato.</s...

Questo documento descrive i metodi che dimostrano tre comuni tecniche di raccolta e disaggregazione del biofilm su due tipi di superficie, test di robustezza di un metodo di raccolta e informazioni minime da considerare quando si scelgono e ottimizzano le tecniche di raccolta e disaggregazione per aumentare la riproducibilità.

Raccolta e disaggregazione: un passo trascurato nella ricerca sui metodi di biofilm

Biofilm methods consist of four distinct steps: growing the biofilm in a relevant model, treating the mature biofilm, harvesting the biofilm from the ...

L'obiettivo generale di queste procedure è quello di raccogliere e disaggregare i biofilm in modo ottimale in modo da aumentare la riproducibilità. Tre tecniche saranno dimostrate in questo video, ognuna incentrata sulla raccolta e la disaggregazione da un diverso tipo di superficie. Questo video dimostrerà le tecniche appropriate per uno, vortice e sonicazione biofilm da una superficie dura non porosa come un coupon in policarbonato dal reattore a biofilm CDC.Due, la raschiatura e l'omogeneizzazione del biofilm dalla superficie di vetro borosilicato duro non poroso che si trova comunemente nel reattore a flusso a goccia. E tre, il raschiamento, il vortice e la sonicazione del biofilm da una superficie porosa del tubo di silicone che si trova comunemente nel modello di catetere. Ciao, mi chiamo Kelly Buckingham-Meyer qui al Standardized Biofilm Methods Lab.Nel nostro laboratorio, suddividiamo i metodi del biofilm in quattro componenti: crescita, trattamento, campionamento e analisi. Nella letteratura peer-reviewed, i dettagli su come i biofilm vengono campionati o raccolti e disaggregati da una superficie sono in genere scarsi. Questo è il motivo di questo video.Poiché il nostro laboratorio sviluppa e testa metodi standardizzati di biofilm, abbiamo condotto un'ampia revisione della letteratura in cui sono stati identificati i tre metodi più comuni di raccolta e disaggregazione del biofilm. Questi metodi sono il vortice e la sonicazione del biofilm da un coupon in policarbonato, la raschiatura e l'omogeneizzazione del biofilm da un coupon di vetro borosilicato e la raschiatura, il vortice e la sonicazione del biofilm da tubi in silicone. Mentre i metodi scritti su carta sono potenti, speriamo che il video con i dettagli tecnici presentati dalla mia collega Lindsey Miller e da me sarà utile.Per iniziare, coltivare il biofilm maturo Pseudomonas aeruginosa 15442 secondo lo standard ASTM E2562, il metodo di prova standard per la quantificazione del biofilm pseudomonas aeruginosa coltivato con taglio elevato e flusso continuo utilizzando il reattore a biofilm CDC. Alla fine del periodo di crescita di 48 ore, preparati a trattare e campionare i coupon secondo lo standard ASTM E2871, il metodo di prova standard per determinare l'efficacia del disinfettante contro il biofilm coltivato nel reattore a biofilm CDC utilizzando il metodo a tubo singolo. Quindi inserire asetticamente paraspruzzi autoclavati in tubi conici sterili da 50 millilitri utilizzando pinze sterilizzate a fiamma.Ripetere per tutti i tubi che riceveranno il trattamento. I tubi per i coupon di controllo non hanno bisogno di un paraspruzzi. Rimuovere asetticamente un'asta dal reattore a biofilm CDC e risciacquarla in 30 millilitri di acqua di diluizione sterile.Questo rimuoverà le cellule liberamente attaccate dal biofilm. Tenere l'asta parallela al piano di lavoro sopra i tubi del campione con paraspruzzi. Utilizzando una chiave a brugola sterilizzata a fiamma, allentare le viti impostate per far cadere un coupon rivestito di biofilm nel tubo.Ripeti per il numero desiderato di coupon. Rimuovere i paraspruzzi e posizionare i paraspruzzi in un contenitore separato per la sterilizzazione. Utilizzando una pipetta sierologica da cinque millilitri, pipettare lentamente quattro millilitri di trattamento o controllo nei tubi in modo che il liquido scorra lungo l'interno della parete del tubo.Ruotare delicatamente il fondo del tubo in modo che eventuali bolle d'aria sotto la cedola vengano spostate. Attendere da 30 a 60 secondi tra ogni aggiunta. Alla fine del tempo di contatto specificato, pipettare 36 millilitri di neutralizzatore nei tubi nello stesso ordine in cui è stato applicato il trattamento o il controllo.Ruota ogni tubo sull'impostazione più alta per 30 più o meno cinque secondi e assicurati che si raggiunga un vortice completo. Posizionare i tubi nella cremagliera sospesa nel sonicatore degassato in modo tale che il livello dell'acqua nella vasca da bagno sia uguale al livello dell'acqua nei tubi. Sonicare i campioni a 45 kilohertz, potenza al 100% e funzione normale per 30 più o meno cinque secondi.Ripeti i cicli di vortice e sonicazione e termina con un vortice finale, per un totale di cinque cicli. Infine, diluire in serie il campione, placcare la diluizione su agar R2A e incubare le piastre per 24 ore a 36 gradi Celsius. Contare le colonie come appropriato al metodo di placcatura e registrare i dati.Questa prossima tecnica di raccolta e disaggregazione del biofilm è utile per i coupon rigidi non porosi che sono lo standard nel reattore a flusso di gocciolamento. Coltivare un biofilm pseudomonas aeruginosa 15442 maturo secondo lo standard ASTM E2647 il metodo di prova standard per la quantificazione del biofilm pseudomonas aeruginosa coltivato utilizzando il reattore a biofilm a flusso a goccia con basso taglio e flusso continuo. Impostare la stazione di campionamento per includere una scheda di campionamento, etanolo al 95% in un becher, un bruciatore di alcol, emostati, uno strumento di rimozione dei coupon, bicchieri con acqua di diluizione sterile e tubi di diluizione per il risciacquo dei coupon.Spegnere la pompa, rimuovere il coperchio del canale e utilizzare lo strumento di rimozione del coupon sterile e gli emostati per rimuovere il coupon, facendo attenzione a non disturbare il biofilm. Risciacquare la cedola immergendola delicatamente con un movimento fluido in 45 millilitri di acqua di diluizione sterile contenuta in un tubo di centrifuga da 50 millilitri. Invertire immediatamente il movimento per rimuovere il coupon.Posizionare il coupon in un becher contenente 45 millilitri di acqua di diluizione sterile. Raschiare la superficie del coupon ricoperta di biofilm in direzione verso il basso per circa 15 secondi usando una spatola sterile o un raschietto. Risciacquare la spatola o il raschietto mescolandolo nel becher.Ripetere il processo di raschiatura e risciacquo tre o quattro volte assicurando la copertura completa della superficie del coupon. Risciacquare il coupon tenendolo con un angolo di 60 gradi sopra il becher sterile e pipettare un millilitro di acqua di diluizione sterile sulla superficie del coupon. Ripetere l'operazione per un totale di cinque risciacqui.Il volume finale nel becher è ora di 50 millilitri. Lavorando nell'armadio di biosicurezza, omogeneizzare il campione di biofilm raschiato. Collegare una sonda omogeneizzatore sterile all'omogeneizzatore.Posizionare la punta della sonda nel liquido e accendere l'omogeneizzatore e rampare fino a 20.500 giri / min. Omogeneizzare il campione per 30 secondi. Abbassare l'RPM e spegnere l'omogeneizzatore.Sanificare la sonda tra i campioni di biofilm omogeneizzando in nove millilitri di diluizione sterile in bianco a 20.500 RPM per 30 secondi come descritto sopra. Omogeneizzare un tubo da nove millilitri di etanolo al 70% per 30 secondi e staccare la sonda e lasciarla riposare nel tubo di etanolo per un minuto. Omogeneizzare due spazi vuoti di diluizione aggiuntivi.Inoltre, per ogni campione può essere utilizzata una sonda omogeneizzatore monouso sterile. Diluire in serie il campione omogeneizzato, placcare le diluizioni su R2A utilizzando il metodo di placcatura appropriato e incubare le piastre per 24 ore a 36 gradi Celsius. Conta le colonie e registra i dati.Questa tecnica finale di raccolta e disaggregazione del biofilm è utile per il biofilm coltivato in tubi porosi come il tubo in silicone utilizzato nel modello di catetere. Per iniziare questa procedura, coltivare un biofilm E.coli 53498 maturo in tubi catetere siliconici. Preparare i materiali di campionamento: tubi risciacquati, un tubo centrifugo sterile, una capsula di Petri sterile vuota, emostati in acciaio inossidabile sterilizzati a fiamma, forbici, timer e un righello.Con la pompa in pausa, utilizzare il 70% di etanolo per pulire l'esterno del tubo. Misurare due centimetri dall'estremità, evitando l'area attaccata al connettore, e contrassegnare i tubi per determinare le posizioni di taglio. Con le forbici sterilizzate a fiamma, tagliare il tubo sul segno di due centimetri.Risciacquare il segmento del tubo per rimuovere le cellule planctoniche. Con una pinza sterilizzata a fiamma, immergere delicatamente il segmento del tubo in 20 millilitri di acqua di diluizione sterile, quindi rimuovere immediatamente. Posizionare il segmento in 10 millilitri di neutralizzatore.Con una pinza sterilizzata a fiamma, tenere il segmento del tubo e raschiare con un bastoncino applicatore sterile in legno fino a quando tutte le aree interne del tubo non sono state raschiate. Risciacquare occasionalmente il bastoncino nei 10 millilitri di neutralizzatore e riposizionare il segmento nella provetta del campione. Il segmento dei tubi raschiati è ora la diluizione da 10 a zero o zero.Ruota ogni tubo sull'impostazione più alta per 30 più o meno cinque secondi. Posizionare i tubi nella cremagliera sospesa nel bagno sonicatore, in modo tale che il livello dell'acqua nella vasca sia uguale al livello del liquido nei tubi. Sonicare a 45 kilohertz, potenza del 100% e funzione normale per 30 più o meno cinque secondi.Ripeti questo vortice e il ciclo di sonicazione, quindi termina con il vortice finale. Diluire in serie i campioni in acqua tamponata. Piastra su agar di soia triptica utilizzando il metodo di placcatura appropriato e quindi incubare i tubi a 36 più o meno due gradi Celsius per 24 ore.Contare le colonie in base al metodo di placcatura utilizzato e registrare i dati per calcolare la media aritmetica. Queste quattro immagini scattate da Danielle Or e Blaine Fritz aiutano a illustrare l'importanza di questa procedura di raccolta e disaggregazione. Tutti e quattro questi coupon sono stati colorati con viola cristallo per aiutare a visualizzare la quantità di biofilm pseudomonas aeruginosa presente sui coupon prima e dopo il vortice e il processo di sonicazione.Il coupon A è completamente coperto da biofilm, mentre i coupon B, C e D hanno tutti sostanzialmente meno biofilm sulla loro superficie. I tagliandi B, C e D sono stati tutti sottoposti al vortice e al processo di sonicazione descritto in precedenza. Queste due immagini scattate da Lindsey Miller su un microscopio confocale con ingrandimento 12,5X raffigurano un biofilm pseudomonas aeruginosa che è stato trattato con la macchia viva / morta di retroilluminazione.L'immagine a sinistra è stata sonicata a 45 kilohertz e 10% di potenza, mentre l'immagine a destra è stata sonicata a 45 kilohertz e 100% di potenza. Chiaramente, il coupon a sinistra ha molto più biofilm che rimane sulla sua superficie rispetto al coupon a destra. Questa figura finale mostra come la manipolazione di diversi parametri di sonicazione influisce sulla quantità di biofilm di Pseudomonas aeruginosa rimosso dalla superficie della cedola.Tutti questi coupon sono stati sonicati a 45 kilohertz, potenza del 100% e impostazione normale per 30 più o meno cinque secondi. Queste immagini sono state scattate con un ingrandimento di 12,5 volte da Lindsey Miller. I tagliandi nella prima fila sono stati sonicati in acqua di diluizione, mentre i tagliandi nella seconda fila sono stati sonicati in brodo neutralizzante DE.Sembra che ci sia meno biofilm rimanente sui tagliandi che sono stati sonicati in brodo DE che contiene un tensioattivo rispetto all'acqua di diluizione. I tagliandi A, B, E e F sono stati tutti sonicati in un volume di 10 millilitri, mentre i coupon C, D, G e H sono stati sonicati in 40 millilitri di soluzione. C'è chiaramente meno biofilm sui coupon che sono stati sonicati nei volumi più piccoli.I tagliandi A, C, E e G sono stati sonicati nella vasca da bagno con tre tubi contemporaneamente, mentre i coupon B, D, F e H sono stati sonicati in un bagno con 12 tubi contemporaneamente. Sembra che i campioni sonicati con meno tubi abbiano mostrato una raccolta di biofilm superiore. In definitiva, ridurre al minimo il volume nei tubi, ridurre il numero di tubi sonicati contemporaneamente e l'uso di brodo neutralizzante DE sembrano tutti contribuire a migliorare la raccolta di biofilm.Non esiste un metodo perfetto per raccogliere e disaggregare il biofilm, ma alcuni approcci sono migliori per diverse superfici e / o applicazioni. Le tecniche dimostrate in questo video sono i tre metodi più comuni secondo una revisione della letteratura. Queste tre tecniche possono fornire un punto di partenza per i ricercatori.È importante prendersi il tempo necessario per convalidare il metodo di raccolta e disaggregazione scelto. Tutte le apparecchiature sono leggermente diverse, quindi anche se il metodo è stato standardizzato, è comunque prudente confermare il processo per l'attrezzatura utilizzata. La ricerca ha dimostrato che scelte improprie possono portare a risultati di test distorti.Dopo aver visto questo video, si spera che queste informazioni aiuteranno i ricercatori a prendere decisioni più informate su quale metodo utilizzare e forniranno indicazioni su come migliorare la riproducibilità per i tre tipi di superficie e le tecniche complementari di raccolta e disaggregazione.

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