Fluorimetria a scansione nano-differenziale per lo screening nella scoperta di piombo basata su frammenti

Questo protocollo è utile per le campagne di scoperta dei lead su base frammentata come strumento aggiuntivo per selezionare frammenti promettenti come candidati al calore. Nano DSO per lo screening dei frammenti utilizza una quantità limitata di campione proteico non etichettato e può essere utilizzato di routine per quasi tutti i bersagli proteici. Questo metodo può essere utilizzato per esaminare qualsiasi raccolta di ligandi.

o per verificare i riscaldamenti dagli altri metodi. Estrai una piastra di frammenti dal congelatore meno 20 o meno 80 gradi Celsius e lasciala scongelare a temperatura ambiente con un leggero scuotimento su uno shaker da banco. Centrifugare la piastra a 500 volte G per 30 secondi per raccogliere eventuali gocce attaccate al lato dei pozzi.

Prendere una piastra di cristallizzazione MRC a 2 pozzetti e pipettare 15 microlitri della soluzione proteica in ogni sotto-pozzo usando una pipetta multicanale. Per controllare le definizioni di frammenti e piastre proteiche sulla zanzara, accendere il nano dispenser e assicurarsi che non ci siano ostacoli intorno ai componenti in movimento. Aprire l'interfaccia utente grafica, cliccare sulla scheda Setup e sotto Deck Configuration verificare se il tipo di piastra in cui vengono forniti i compound e quella in cui viene trasferita la proteina sono già presenti nell'elenco delle piastre disponibili.

In caso contrario, fate clic su Opzioni (Options), quindi su Piastre (Plates) e create una nuova definizione di piastra compilando i valori corretti per il tipo di proprietà. Nella scheda Impostazione, specificare le posizioni delle piastre in Configurazione deck. Utilizzando il menu a discesa, scegliere la piastra inferiore Grainier U per la posizione uno e la piastra MRC a 2 fori per la posizione due e salvare il protocollo.

Posizionare la piastra di frammento in posizione uno e la piastra proteica in posizione due del ponte. Nella scheda protocollo, fare clic su File e scegliere il protocollo salvato nel passaggio precedente per l'erogazione dei frammenti. Definire il volume dei frammenti da erogare come 0,3 microlitri.

Per una piastra tipica in cui le colonne uno e 12 non contengono frammenti, definire la posizione iniziale alla colonna due e la posizione finale alla colonna 11. In alcune piastre, se le colonne due o 11 sono vuote, utilizzare le colonne tre e 10 come valori iniziali e finali. Fare clic su Esegui per avviare il programma.

Dopo aver completato l'erogazione, che richiede circa due minuti, rimuovere le piastre proteiche e frammentarie dal robot e sigillarle con una pellicola sigillante adesiva. Centrifugare brevemente la piastra proteica a 500 volte G per 30 secondi per raccogliere eventuali gocce che si attaccano ai lati dei pozzi prima di procedere al passaggio successivo. Ispezionare visivamente i pozzetti della piastra proteica per le precipitazioni che potrebbero essersi verificate a causa dell'aggiunta dei frammenti.

Se si osserva la precipitazione in molti pozzi, ridurre la concentrazione dei frammenti e ripetere l'esperimento. Accendere lo strumento Prometheus. Sul touch screen, premere Apri cassetto per accedere al modulo di caricamento capillare dello strumento.

Rimuovere la striscia magnetica dal modulo di carico e pulire lo specchio con etanolo per rimuovere eventuali particelle di polvere. Per trasferire una soluzione dalla piastra dei frammenti proteici ai capillari, posizionare la piastra proteica e i capillari accanto allo strumento per un facile accesso al modulo di carico capillare. Prendi un capillare tenendolo a un'estremità e tocca la soluzione nella piastra proteica con l'altra estremità del capillare per trasferire il campione.

Indossare sempre i guanti e assicurarsi di non toccare il capillare nel mezzo poiché le impurità dei guanti influenzerebbero la misurazione. Posizionare il capillare nella posizione designata del supporto, assicurandosi che sia correttamente allineato e centrato, ripetere questi passaggi per riempire tutte le posizioni nel modulo di carico. Alla fine, posizionare la striscia magnetica sopra i capillari per tenerli in posizione e premere Chiudi cassetto per avviare l'esperimento Nano-DSF.

Aprire l'applicazione Prometheus PR. ThermControl e creare un nuovo progetto facendo clic su Avvia nuova sessione. Innanzitutto, esegui una scansione di scoperta per rilevare la fluorescenza dei campioni. Alterare il segnale fluorescente dei campioni regolando la potenza di eccitazione del laser.

Per una denaturazione termica, fare clic sulla scheda Scansione di fusione, impostare la temperatura iniziale a 20 gradi Celsius, la temperatura finale a 95 gradi Celsius e la pendenza della temperatura a un grado Celsius al minuto. Quindi fare clic su Avvia misurazione. La distribuzione in frequenza dello spostamento e della temperatura di fusione per l'esterno, la cinetica o altamente espressa nel cancro una proteina, il dominio di ripetizione tetratricopeptidica regolatorio della chinasi 1 del fuso monopolare e la proteasi simile a SARS-CoV-2 3c sono mostrati qui.

Valori negativi indicano una riduzione della temperatura di fusione in presenza di un frammento, mentre un valore positivo indica un aumento della temperatura di fusione. Per Nsp5, tutti i frammenti hanno un effetto destabilizzante, mentre per Hec1 e Mps1 si osservano sia colpi stabilizzanti che destabilizzanti. Questo è un metodo economico e veloce per schermare le librerie di frammenti.

Altri metodi come la NMR o la cristallografia a raggi X possono mostrare l'esatto legame dei frammenti e sono anche disponibili attraverso la scoperta inX. I risultati con la proteasi del coronavirus hanno contribuito a proporre nuovi composti che possono essere sviluppati in farmaci contro COVID-19.