Rilevazione diretta delle isolevuglandine nei tessuti utilizzando una proteina di fusione della fosfatasi alcalina D11 scFv e immunofluorescenza

Le isolevuglandine sono state implicate in diverse malattie, in particolare nelle malattie cardiovascolari. Questo protocollo è stato sviluppato per rilevare isolevuglandine nei tessuti con proteina di fusione della fosfatasi alcalina D11 e immunofluorescenza. Gli attuali metodi di rilevamento sono costosi o richiedono un anticorpo secondario per un E-tag.

Trovare un anticorpo secondario affidabile è difficile, ma questo protocollo rimuove la fase anticorpale secondaria. Immergere i vetrini di topi e tessuti incorporati in paraffina umana in xilene tre volte per cinque minuti per deparrafinizzare i tessuti. Per reidratare il tessuto, lavare i tessuti due volte con etanolo al 95%, seguiti da due lavaggi con etanolo al 70% e poi due volte con etanolo al 50% preparato in acqua.

Lavare i vetrini in soluzione salina tris-buffered con 0,1%Tween 20 tre volte riempiendo il portavetrino con TBST. Quindi scartare il TBST. Posizionare i vetrini in tampone di citrato di sodio preriscaldato e incubare in una pentola a pressione impostata a quattro minuti ad alta pressione, per un tempo totale di recupero dell'antigene di 20 minuti.

Al termine dell'incubazione, rimuovere i vetrini dalla pentola a pressione e lasciarli raffreddare per 20 minuti a temperatura ambiente. Dare tre lavaggi rapidi alle diapositive con TBST come dimostrato. Blocca le diapositive aggiungendo il 2% di BSA disciolto in TBST.

Coprire i vetrini con nastro di paraffina e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti. Dopo l'incubazione, eliminare il buffer di blocco. Aggiungere 200 microlitri di fosfatasi alcalina D11 preparata in TBST ai vetrini e coprire i vetrini con nastro di paraffina.

Dopo aver incubato i vetrini in una camera umidificata per tre ore a temperatura ambiente, lavare i vetrini tre volte con TBST. Sviluppare i vetrini con uno sviluppatore calorimetrico di fosfatasi alcalina per immunoistochimica o uno sviluppatore di fosfatasi alcalina fluorescente per immunofluorescenza. Lavare i vetrini una volta con TBST per rimuovere lo sviluppatore in eccesso e prevenire ulteriori sviluppi del colore.

Controcolorare i vetrini con un microgrammo per millilitro di colorazione nucleare HEX preparata in PBS per immunofluorescenza. Quindi lavare i vetrini una volta con TBST per rimuovere eventuali contromacchie in eccesso. Utilizzare il supporto di montaggio per posizionare la linguetta di copertura sulle guide sviluppate.

Osservare i vetrini sotto un microscopio a luce invertita per l'immunoistochimica o un microscopio fluorescente confocale per l'immunofluorescenza. Quattro esperimenti di controllo negativo possono essere eseguiti per confermare la specificità della colorazione AP D11 per isolevuglandina. Nel primo esperimento di controllo negativo, incubare i tessuti con D11 AP diluito in TBST, o TBST da solo.

Quindi incubare i tessuti con D11 AP diluito ed estratto pariplasmatico batterico diluito in TBST senza il linker D11 AP. Per il test competitivo, preparare isoLG e isoLG addotti all'albumina sierica di topo con un rapporto molare di otto a uno. Diluire D11 AP da uno a 10 in TBST.

Quindi incubare l'AP D11 diluito con 50 microgrammi per millilitro di MSA addotto con isolevuglandina o MSA non addotto per un'ora a temperatura ambiente. Aggiungere D11 AP con isolevuglandina MSA o D11 AP con MSA non addotto ai tessuti per la colorazione. Utilizzare un anticorpo variabile D20 per colorare i tessuti per il set di controllo negativo finale.

L'immunofluorescenza dell'aorta in topi ipertesi e normotesi è stata studiata utilizzando questo protocollo. La colorazione con D11 AP ha indicato un aumento della concentrazione di isoLG nell'aorta dei topi con ipertensione indotta da angiotensina II rispetto ai topi di controllo. L'AP D11 è stato utilizzato per rilevare le isolevuglandine presenti nei tessuti intestinali di pazienti umani con ipertensione e normotensi.

I tessuti dei pazienti con ipertensione avevano concentrazioni elevate di isolevuglandine. I tessuti sono stati colorati con estratto pariplasmatico e senza D11 AP. La colorazione più brillante è stata osservata nel tessuto colorato con D11 AP rispetto al tessuto colorato con estratto pariplasmatico, confermando che la colorazione non era dovuta alla fosfatasi alcalina batterica non coniugata presente nell'estratto pariplasmatico. Nel test competitivo, il tessuto colorato con D11 AP pre-incubato con il concorrente isoLG ha mostrato una colorazione ridotta, simile alla colorazione osservata nei tessuti con D11 AP, che mostra specificità a D11 AP a isolevuglandins.

Nel controllo negativo, la colorazione dell'aorta del topo con D11 AP ha provocato una forte colorazione rispetto a D20, indicando la specificità di D11 AP alle isolevuglandine nell'aorta ipertensiva. È importante inattivare qualsiasi fosfatasi alcalina endogena presente nei tessuti per limitare la colorazione di fondo.