Name: Cattura assistita da resina accoppiata con etichettatura isobarica Tandem Mass Tag per la quantificazione multiplexata dellossidazione del tiolo proteico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Scopri un metodo di proteomica redox per identificare e quantificare residui di cisteina ossidati in modo reversibile. Utilizza cattura assistita da resina, etichettatura isobarica TMT e spettrometria di massa per analisi sito-specifiche.

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Tutte le procedure descritte nel protocollo relative a campioni/tessuti animali o umani sono state approvate e hanno seguito le linee guida istituzionali del comitato etico per la ricerca umana e animale.
1. Omogeneizzazione/lisi del campione
<ol><li>Campioni di tessuto congelati<ol><li>Tritare il tessuto congelato (~ 30 mg) su un vetrino da microscopio su ghiaccio secco usando una lama di rasoio prerefrigerata e una pinza. Trasferire il tessuto tritato in un tubo di polistirene a fondo tondo da 5 mL prerefrigerato contenente 700 μL di tampone A (vedi Tabella 1) e incubare su ghiaccio per 30 minuti, al riparo dalla luce.</li>
		<li>Interrompere il tessuto per 30 secondi o fino a completa omogeneizzazione con un omogeneizzatore di tessuto portatile. Posizionare i campioni sul ghiaccio e lasciare che la schiuma si plachi per altri 10 minuti. NOTA: Una teglia in alluminio posta su ghiaccio secco fornisce una superficie di lavoro stabile e una piattaforma per la lavorazione iniziale / tritatura del tessuto.</li>
	</ol></li>
	<li>In alternativa, utilizzare colture cellulari aderenti in piatti di coltura da 100 mm come materiale di partenza.<ol><li>Tenere le cellule sul ghiaccio e utilizzare una pipetta sierologica per sciacquare le cellule due volte con 10 ml di PBS ghiacciato contenente 100 mM NEM.</li>
		<li>Lisare le cellule aggiungendo 1 mL di tampone di omogeneizzazione/lisi a freddo e raschiando vigorosamente con un raschietto cellulare rigido. Trasferire il lisato in una provetta da centrifuga da 2 mL utilizzando una micropipetta. NOTA: Il tampone di risciacquo e il tampone di lisi possono essere scalati di conseguenza a recipienti di coltura di dimensioni diverse. In genere, sono necessarie 2-5 milioni di cellule; Tuttavia, questo varia a seconda dell'efficienza della lisi e della resa proteica per specifici tipi di cellule. Il tampone di omogeneizzazione può essere preparato senza NEM per i campioni analizzati per i tioli totali.</li>
	</ol></li>
	<li>Trasferire l'omogenato risultante (fase 1.1.2 o 1.2.2) in una provetta da centrifuga da 2 mL utilizzando una micropipetta e centrifugare a piena velocità (≥16.000 × g) a 4 °C per 10 minuti.</li>
	<li>Trasferire il surnatante (~700 μL o ~1 mL per la coltura cellulare) utilizzando una micropipetta in una provetta conica da microcentrifuga da 5 mL e incubare per 30 minuti a 55 °C al buio agitando a 850 giri/min.</li>
	<li>Utilizzando una pipetta sierologica di vetro, aggiungere 4 ml di acetone ghiacciato ai campioni e incubare a -20 °C per una notte per la precipitazione delle proteine e la rimozione dell'eccesso di N-etilmaleimide.</li>
</ol>2. Cattura assistita da resina
<ol><li>Lavare due volte i pellet proteici precipitati con acetone centrifugando a 20.500 × g a 4 °C per 10 minuti, travasando l'acetone, rimuovendo l'acetone rimanente con una micropipetta e aggiungendo 3 ml di acetone fresco ghiacciato utilizzando una pipetta sierologica di vetro. Capovolgere più volte per mescolare. Dopo il secondo lavaggio, lasciare asciugare il pellet all'aria per 1-2 minuti, facendo attenzione a non asciugare eccessivamente poiché la risospensione potrebbe diventare difficile.</li>
	<li>Utilizzando una micropipetta, aggiungere 1 mL di tampone B (vedere Tabella 1) e solubilizzare la proteina usando una sonicazione ripetuta per 15-30 s alla volta usando un sonicatore da bagno con una potenza di 250 W e un breve vortice. Misurare la concentrazione proteica utilizzando il test dell'acido bicinconinico (BCA) secondo il protocollo del produttore.</li>
	<li>Per standardizzare le concentrazioni proteiche tra i campioni per un'ulteriore elaborazione e garantire la rimozione completa di NEM, trasferire 500 μg di proteine in un filtro centrifugo da 0,5 mL 10 kDa utilizzando una micropipetta e regolare a un volume finale di 500 μL con tampone di risospensione.</li>
	<li>Centrifugare a 14.000 × g a temperatura ambiente fino a quando il volume nel filtro centrifugo è inferiore a 100 μL. Raccogliere i campioni capovolgendo il filtro in una provetta di raccolta. Centrifugare a 1.000 × g per 2 minuti e regolare fino a un volume finale di 500 μL utilizzando il tampone C (vedere Tabella 1).</li>
	<li>Ridurre i tioli proteici aggiungendo 20 μL di ditiotreitolo (DTT) da 500 mM utilizzando una micropipetta a una concentrazione finale di 20 mM e incubando i campioni per 30 minuti a 37 °C agitando a 850 giri/min.</li>
	<li>Dopo la riduzione, trasferire i campioni utilizzando una micropipetta a 0,5 mL di filtri centrifughi da 10 kDa e centrifugare per 15 minuti a 14.000 × g a temperatura ambiente o fino a quando il volume nel filtro centrifugo è inferiore a 100 μL. Aggiungere il tampone D (vedere Tabella 1) per portare il volume nel filtro centrifugo a 500 μL.<ol><li>Ripetere la centrifugazione e l'aggiunta a 500 μL nel punto 2.6 tre volte e, dopo la quarta centrifugazione, raccogliere i campioni invertendo il filtro in una provetta di raccolta e centrifugando a 1.000 × g per 2 minuti.</li>
	</ol></li>
	<li>Misurare la concentrazione proteica utilizzando il test BCA secondo il protocollo del produttore.</li>
	<li>Durante questo scambio tampone, preparare la resina di affinità tiolica pesando la quantità appropriata di resina (30 mg/campione) utilizzando una microbilancia e trasferendola in una provetta da centrifuga da 50 ml. Quindi, utilizzando una pipetta sierologica, aggiungere acqua per una concentrazione finale di 30 mg/ml di resina e incubare a temperatura ambiente per 1 ora agitando per una corretta idratazione della resina. NOTA: La resina di affinità tiolo sopra menzionata è stata interrotta dal produttore. Un possibile sostituto di questa resina di affinità tiolica è disponibile in commercio. Tuttavia, questa sostituzione ha una capacità di rilegatura quasi 5 volte inferiore (vedere Informazioni supplementari). In alternativa, la resina di affinità tiolica può essere sintetizzata utilizzando 2-(piridilditio) etilammina cloridrato e resina attivata con N-idrossisuccinimide (vedere Informazioni supplementari).<ol><li>Dopo l'idratazione della resina, posizionare le colonne di rotazione su un collettore a vuoto e trasferire 500 μL del liquame di resina utilizzando una micropipetta su ciascuna colonna. Applicare il vuoto per la rimozione dell'acqua; Ripetere questo passaggio una volta per ottenere un totale di 30 mg di resina per colonna. In alternativa, centrifugare a 1.000 × g per 2 minuti invece di utilizzare il collettore sottovuoto per questo e tutte le fasi di lavaggio ed eluizione della resina. NOTA: tagliare l'estremità di una punta di pipetta da 1000 μL per aumentare la dimensione del foro aiuta con il trasferimento della resina. È importante triturare tra un pipettaggio e l'altro per garantire che la resina rimanga sospesa e che quantità omogenee e uguali di resina vengano trasferite a ciascuna colonna.</li>
		<li>Lavare la resina aggiungendo 500 μL di acqua ultrapura con una micropipetta e applicando il vuoto per la rimozione dell'acqua; Ripeti questa operazione 5 volte. Quindi, lavare la resina 5 volte con 500 μL di tampone E (vedere Tabella 1). NOTA: In alternativa, è possibile utilizzare la centrifugazione a 1.000 x g per 2 minuti al posto di un collettore a vuoto per tutte le fasi di lavaggio successive. Tutte le fasi di lavaggio vengono eseguite con un volume di 500 μL. Quando si aggiungono tamponi di lavaggio alla colonna, aggiungere con attenzione con forza sufficiente a risospendere completamente la resina evitando schizzi e perdita di resina; Ciò consente un lavaggio completo ed efficiente della resina.</li>
	</ol></li>
	<li>Utilizzando una micropipetta, trasferire 150 μg di proteine da ciascun campione ridotto a una nuova provetta e regolare a un volume finale di 120 μL di tampone C (vedere Tabella 1). Trasferire la soluzione proteica utilizzando una micropipetta su una colonna di centrifuga ostruita contenente la resina, posizionare il tappo sulla colonna e incubare per 2 ore a temperatura ambiente agitando a 850 giri/min.</li>
	<li>Lavare la resina cinque volte con 25 mM HEPES, pH 7,0; 8 M urea; seguito da cinque volte con 2 M NaCl; seguito da cinque volte con l'80% di acetonitrile (ACN) con lo 0,1% di acido trifluoroacetico (TFA); e infine cinque volte con 25 mM HEPES, pH 7,7, come descritto al punto 2.8.2 e sostituire la spina. NOTA: I campioni possono essere eluiti qui per l'analisi a livello proteico (ad esempio, elettroforesi su gel di poliacrilammide SDS (SDS-PAGE), western blot) come descritto al punto 4.1.</li>
</ol>3. Digestione triptica su resina ed etichettatura TMT
<ol><li>Preparare una quantità sufficiente di soluzione di tripsina modificata sequenziale per 6-8 μg per campione solubilizzandola ad una concentrazione di 0,5 μg/μL nel tampone C (vedere Tabella 1) in modo che il volume finale consenta almeno 120 μL per campione. Utilizzando una micropipetta, aggiungere 120 μL di questa soluzione di tripsina ai campioni e incubare per una notte a 37 °C agitando a 850 giri/min. NOTA: Per aumentare l'efficienza della digestione, un ulteriore passaggio di digestione può essere incluso il giorno successivo rimuovendo la soluzione di tripsina e sostituendola con soluzione fresca e continuando la digestione per 2 ore.</li>
	<li>Lavare la resina cinque volte con 25 mM HEPES, pH 7,0; seguito da cinque volte 2 M NaCl; seguito da cinque volte con l'80% ACN con lo 0,1% TFA; seguito da tre volte con 25 mM HEPES, pH 7,7. Infine, lavare la resina due volte con tampone bicarbonato trietilammonico da 50 mM (TEAB) e sostituire il tappo.</li>
	<li>Preparare i reagenti di etichettatura TMT prima lasciandoli riscaldare a temperatura ambiente prima di centrifugare brevemente utilizzando una centrifuga a 16.000 × g. Aggiungere 150 μL di ACN anidro a ciascun flaconcino di reagente di etichettatura TMT utilizzando una micropipetta. Incubare i flaconcini a temperatura ambiente su un termomiscelatore impostato a 850 rpm per 5 minuti per solubilizzare completamente il reattivo. Brevemente vortice e spin verso il basso a 16.000 × g per raccogliere il reagente.</li>
	<li>Utilizzando una micropipetta, aggiungere 40 μL di 100 mM TEAB alla resina lavata, quindi aggiungere 70 μL del reagente TMT disciolto e incubare per 1 ora a temperatura ambiente agitando a 850 giri/min. Conservare il reagente TMT rimanente a -80 °C. NOTA: Prendere nota delle singole etichette TMT assegnate a ciascun campione biologico (Figura 1).</li>
	<li>Lavare la resina cinque volte con ACN all'80% con TFA allo 0,1%, tre volte con tampone bicarbonato di ammonio (ABC) da 100 mM, pH 8,0 e due volte con acqua come descritto in precedenza e sostituire il tappo.</li>
</ol>4. Eluizione peptidica
<ol><li>Eluire i peptidi marcati aggiungendo 100 μL di 20 mM DTT in 100 mM ABC, pH 8,0, a ciascuna colonna utilizzando una micropipetta e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti su un termomixer impostato a 850 rpm. NOTA: Dopo l'aggiunta di DTT, la resina si aggregherà. La resina può essere interrotta con una punta di pipetta per rompere i grumi e garantire la completa eluizione dei peptidi.</li>
	<li>Dopo questa incubazione, posizionare la colonna su un collettore sottovuoto destinato all'estrazione in fase solida (SPE), applicare il vuoto ed eluire i campioni in una provetta da microcentrifuga da 5 ml. Ripetere questo passaggio una volta.</li>
	<li>Infine, aggiungere 100 μL di ACN all'80% con TFA allo 0,1%, incubare per 10 minuti a temperatura ambiente ed eluire nella stessa provetta da centrifuga da 5 ml. Raccogliere tutte le frazioni nella stessa provetta da microcentrifuga da 5 ml. NOTA: Per evitare la perdita del campione, è necessario utilizzare provette a basso legame per l'eluizione e i volumi devono essere mantenuti pari o inferiori a un volume di 4,0 ml per una singola provetta da 5 ml.</li>
	<li>Porre i campioni eluiti in un concentratore di vuoto fino a quando non sono asciutti. Conservare i peptidi secchi a -80 °C e risospenderli in seguito. NOTA: I campioni possono anche essere eluiti separatamente e un'aliquota può essere rimossa e analizzata da SDS-PAGE per l'analisi a livello peptidico prima di combinare i campioni.</li>
</ol>5. Alchilazione peptidica e desalinizzazione/pulizia
<ol><li>Risospendere i peptidi essiccati aggiungendo un piccolo volume di tampone ABC da 100 mM, pH 8,0 (non superiore a 500 μL), utilizzando una micropipetta. Utilizzare la sonicazione ripetuta per 15-30 s alla volta utilizzando un sonicatore da bagno con un'uscita di 250 W e vortice per solubilizzare e trasferire in un tubo da 2 ml. NOTA: Il volume di 100 mM ABC, pH 8,0 da aggiungere si basa sul volume necessario per risospendere il DTT a una molarità di 150 mM. Gli utenti dovranno determinare la quantità di DTT presente nel loro campione in base a quanto originariamente aggiunto nel passaggio 4.1.</li>
	<li>Aggiungere una quantità sufficiente di soluzione madre concentrata (600 mM) di iodoacetammide (IAA) disciolta in ABC utilizzando una micropipetta per ottenere un rapporto molare 1:4 di DTT:IAA e incubare i campioni a RT per 1 ora agitando a 850 giri/min.</li>
	<li>Acidificare i campioni a pH < 3 aggiungendo TFA concentrato (10%) utilizzando una micropipetta ed eseguire la desalinizzazione del campione utilizzando la pulizia in fase inversa secondo le istruzioni del produttore.</li>
	<li>Mettere i peptidi puliti in un concentratore sottovuoto fino a quando non sono asciutti. Conservare i peptidi secchi a -80 °C fino a ulteriori analisi.</li>
</ol>6. Cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem
<ol><li>Risospendere i peptidi essiccati mediante sonicazione ripetuta per 15-30 s alla volta utilizzando un sonicatore da bagno con una potenza di 250 W e vortice in 20-40 μL di acqua contenente il 3% di ACN. Determinare la concentrazione del peptide eseguendo un test BCA secondo il protocollo del produttore.</li>
	<li>Separare i campioni per fase inversa LC e MS/MS come precedentemente descritto6 e registrare gli spettri MS1 nell'intervallo m/z di 400-2000. Assicurarsi che la dissociazione collisionale ad alta energia (HCD) venga utilizzata per ottenere informazioni sull'intensità degli ioni reporter per l'analisi di peptidi marcati isobaricamente. Si vedano le sezioni dei metodi dei rapporti precedenti per maggiori dettagli sulle condizioni di funzionamento dello strumento 27,30 e l'analisi dei dati MS27,31. NOTA: Diversi sistemi o impostazioni LC-MS/MS possono essere utilizzati per analizzare i campioni di peptidi. La copertura e la sensibilità dell'identificazione dei peptidi dipenderanno dal particolare sistema e dalle impostazioni utilizzate.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse, finanziari o di altro tipo.

La cattura assistita da resina è stata utilizzata in una varietà di tipi di campioni e sistemi biologici per lo studio delle modificazioni ossidative dei residui di cisteina25,29,30. Questo metodo consente la valutazione di campioni a più livelli e letture, comprese proteine e peptidi utilizzando SDS-PAGE e analisi western blot, nonché singoli siti di cisteina utilizzando la spettrometria di massa. Indipendentemente dal tipo di ...

In condizioni omeostatiche, le cellule generano specie reattive di ossigeno, azoto o zolfo che aiutano a facilitare i processi, come il metabolismo e la segnalazione 1,2,3, estendendosi sia ai procarioti che agli eucarioti. I livelli fisiologici di queste specie reattive sono necessari per il corretto funzionamento cellulare, noto anche come "eustress"1,4. Al contrario, un aumento degli ossidanti che porta a uno squilibrio tra ossidanti e antiossidanti può causare stress ossidativo, o "distress"1, che porta a danni cellulari. Gli ossidanti trasducono i segnali ai percorsi biologici modificando diverse biomolecole, tra cui proteine, DNA, RNA e lipidi. In particolare, i residui di cisteina delle proteine sono siti altamente reattivi inclini all'ossidazione a causa del gruppo tiolo sulla cisteina, che è reattivo verso diversi tipi di ossidanti5. Ciò dà origine a una vasta gamma di modificazioni post-traduzionali reversibili a base redox (PTM) per la cisteina, tra cui nitrosilazione (SNO), glutationilazione (SSG), solfenilazione (SOH), persolfurazione (SSH), polisolfurazione (SSnH), acilazione e disolfuri. Le forme irreversibili di ossidazione della cisteina includono la sulfinilazione (SO2H) e la sulfonilazione (SO3H).
Le modificazioni ossidative reversibili dei residui di cisteina possono svolgere ruoli protettivi che impediscono un'ulteriore ossidazione irreversibile o servire come molecole di segnalazione per le vie cellulari a valle 6,7. La reversibilità di alcuni PTM redox tiolici consente ai siti della cisteina di funzionare come "interruttori redox"8,9, in cui i cambiamenti nello stato redox di questi siti alterano la funzione proteica per regolare il loro ruolo nei processi transitori. Gli effetti modulatori dei PTM redox10 sono stati osservati in molti aspetti della funzione proteica 11, tra cui la catalisi 12, le interazioni proteina-proteina 13, il cambiamento di conformazione 14, la coordinazione degli ioni metallici 15 o il legame dell'inibitore farmacologico 16. Inoltre, i PTM redox sono coinvolti nei siti di cisteina delle proteine che regolano percorsi come la trascrizione 17, la traduzione18 o il metabolismo19. Dato l'impatto che i PTM redox hanno sulla funzione proteica e sui processi biologici, è importante quantificare l'entità dell'ossidazione che un sito di cisteina subisce in risposta a una perturbazione dello stato redox.
L'identificazione di siti di cisteina con stati redox alterati è focalizzata sul confronto dello stato di ossidazione a livello sito-specifico tra condizioni normali e perturbate. Le misurazioni del cambiamento di piega sono spesso utilizzate per determinare quali siti sono significativamente alterati in quanto ciò aiuta gli utenti a interpretare quali siti di cisteina possono essere fisiologicamente significativi per lo studio. In alternativa, le misurazioni stechiometriche dell'ossidazione tiolicica reversibile in un tipo specifico di campione forniscono un quadro generale dello stato fisiologico rispetto all'ossidazione cellulare, una misura importante che viene spesso trascurata e sottoutilizzata. La stechiometria di modifica si basa sulla quantificazione della percentuale di tiolo modificato in rapporto al tiolo proteico totale (modificato e non modificato)20,21. Di conseguenza, le misurazioni stechiometriche offrono una misurazione più precisa rispetto al cambio di piega, specialmente quando si utilizza la spettrometria di massa. Il significato dell'aumento dell'ossidazione può essere più facilmente accertato utilizzando la stechiometria per determinare l'occupazione PTM di un particolare sito di cisteina. Ad esempio, un aumento di 3 volte dell'ossidazione del tiolo potrebbe derivare da una transizione da un minimo dell'1% al 3% o dal 30% al 90%. Un aumento di 3 volte dell'ossidazione per un sito che è solo all'1% di occupazione può avere un impatto minimo sulla funzione di una proteina; Tuttavia, un aumento di 3 volte per un sito con un'occupazione del 30% allo stato di riposo può essere influenzato in modo più sostanziale. Le misure stechiometriche, quando eseguite tra tioli ossidati totali e specifiche modificazioni ossidative, tra cui la glutationilazione proteica (SSG) e la nitrosilazione (SNO), possono rivelare rapporti e informazioni quantitative rispetto a specifici tipi di modificazione.
Poiché l'ossidazione reversibile del tiolo è tipicamente una modifica post-traduzionale a bassa abbondanza, sono stati sviluppati diversi approcci per l'arricchimento di proteine contenenti queste modifiche da campioni biologici. Un primo approccio ideato da Jaffrey e altri, chiamato biotina switch technique (BST)22, prevede più passaggi in cui i tioli non modificati sono bloccati attraverso l'alchilazione, i tioli modificati in modo reversibile sono ridotti a tioli liberi nascenti, i tioli liberi nascenti sono etichettati con biotina e le proteine marcate sono arricchite dal pulldown dell'affinità streptavidina. Questa tecnica è stata utilizzata per profilare SNO e SSG in molti studi e può essere adattata per sondare altre forme di ossidazione reversibile del tiolo23,24. Mentre la BST è stata utilizzata per sondare diverse forme di ossidazione reversibile del tiolo, una preoccupazione con questo approccio è che l'arricchimento è influenzato dal legame non specifico delle proteine non biotinilate alla streptavidina. Un approccio alternativo sviluppato nel nostro laboratorio, denominato cattura assistita da resina (RAC)25,26 (Figura 1), aggira il problema dell'arricchimento dei gruppi tiolici attraverso il sistema biotina-streptavidina.
In seguito alla riduzione dei tioli ossidati in modo reversibile, le proteine con tioli liberi nascenti vengono arricchite dalla resina di affinità tiolica, che cattura covalentemente i gruppi tiolici liberi, consentendo un arricchimento più specifico delle proteine contenenti cisteina rispetto alla BST. L'accoppiamento di RAC con il potere multiplexante dei recenti progressi nella marcatura isobarica e nella spettrometria di massa crea un flusso di lavoro robusto e sensibile per l'arricchimento, l'identificazione e la quantificazione di residui di cisteina ossidati in modo reversibile a livello di proteoma. I recenti progressi nella spettrometria di massa hanno permesso una profilazione molto più profonda del proteoma redox del tiolo, aumentando la comprensione sia della causa che dell'effetto dell'ossidazione del tiolo proteico27. Le informazioni ottenute dai dati quantitativi sito-specifici consentono ulteriori studi sugli impatti meccanicistici e sugli effetti a valle delle modificazioni ossidative reversibili28. L'utilizzo di questo flusso di lavoro ha fornito informazioni sugli impatti fisiologici dell'ossidazione reversibile della cisteina rispetto ai normali eventi fisiologici come l'invecchiamento, in cui i livelli di SSG differivano rispetto all'età. Gli effetti dell'invecchiamento su SSG sono stati parzialmente invertiti utilizzando SS-31 (elamipretide), un nuovo peptide che migliora la funzione mitocondriale e riduce i livelli di SSG nei topi anziani, causando loro un profilo SSG più simile ai topi giovani29.
È stato dimostrato che le condizioni fisiopatologiche attribuite all'esposizione alle nanoparticelle coinvolgono SSG in un modello di macrofago murino. Utilizzando RAC accoppiato con spettrometria di massa, gli autori hanno dimostrato che i livelli di SSG erano direttamente correlati al grado di stress ossidativo e compromissione della funzione fagocitaria dei macrofagi. I dati hanno anche rivelato differenze specifiche del percorso in risposta a diversi nanomateriali ingegnerizzati che inducono diversi gradi di stress ossidativo30. Il metodo ha anche dimostrato la sua utilità nelle specie procariotiche, dove è stato applicato per studiare gli effetti dei cicli diurni nei cianobatteri fotosintetici rispetto all'ossidazione del tiolo. Sono stati osservati ampi cambiamenti nell'ossidazione del tiolo in diversi processi biologici chiave, tra cui il trasporto di elettroni, la fissazione del carbonio e la glicolisi. Inoltre, attraverso la validazione ortogonale, è stato confermato che diversi siti funzionali chiave sono stati modificati, suggerendo ruoli regolatori di queste modificazioni ossidative6.
Qui descriviamo i dettagli di un flusso di lavoro standardizzato (Figura 1), dimostrando l'utilità dell'approccio RAC per l'arricchimento di tioli totali ossidati di cisteina delle proteine e la loro successiva marcatura e quantificazione stechiometrica. Questo flusso di lavoro è stato implementato in studi sullo stato redox in diversi tipi di campioni, comprese le colture cellulari27,30 e tessuti interi (ad esempio, muscolo scheletrico, cuore, polmone)29,31,32,33. Sebbene non incluso qui, il protocollo RAC è anche facilmente adattabile per lo studio di forme specifiche di modificazioni redox reversibili, tra cui SSG, SNO e S-acilazione, come precedentemente menzionato25,29,34.

<table><tbody><tr><td>2-(Piridilditio)etilammina cloridrato</td><td>Med Chem Express</td><td>HY-101794</td><td>Reagente per la sintesi interna di resine</td></tr><tr><td>Provette da centrifuga LoBind da 2,0 mL Provette da centrifuga</td><td>Eppendorf</td><td>22431048</td><td></td></tr><tr><td>5,0 mL Provette da centrifuga LoBind</td><td>Eppendorf</td><td>30108310</td><td></td></tr><tr><td>5,0 mL</td><td>Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Fisher Scientific</td><td>A949-1</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34998</td><td></td></tr><tr><td>Tiolo attivato Sepharose&nbsp; 4B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8512</td><td>Potenziale sostituto della resina di affinità tiolica</td></tr><tr><td>Filtro centrifugo Amicon Ultra da 0,5 mL</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC5010BK</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di ammonio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>09830</td><td></td></tr><tr><td>Acido bicinconico (BCA)</td><td>Thermo Scientific</td><td>23227</td><td>Reagente per saggi proteici</td></tr><tr><td></td><td>Centrifuga Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitolo (DTT)</td><td>Thermo Scientific</td><td>20291</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Tampone HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Omogeneizzatore</td><td>BioSpec Prodotti</td><td>985370</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacetimide (IAA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>N-etilmaleimmide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>4259</td><td></td></tr><tr><td>NHS-Activated Sepharose 4 Fast Flow</td><td>Cytiva</td><td>17-0906-01</td><td>Reagente per la sintesi interna di resine</td></tr><tr><td>QIAvac 24 Plus collettore a vuoto</td><td>Qiagen</td><td>19413</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Sodio dodecil solfato (SDS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L6026</td><td></td></tr><tr><td>Sonicatore</td><td>Branson</td><td>1510R-MT</td><td></td></tr><tr><td>Colonne di rotazione</td><td>Thermo Scientific</td><td>69705</td><td></td></tr><tr><td>Colonne a fase inversa Strata C18-E</td><td>Phenomenex</td><td>8B-S001-DAK</td><td>Desalinizzazione dei peptidi</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>5355</td><td></td></tr><tr><td>Tiopropil Sefarosio 6B</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0420-01</td><td>Resina di affinità per i tioli; *La produzione della resina di tiopropil sefarosio 6B è stata interrotta dal produttore (vedere il protocollo per i dettagli).</td></tr><tr><td>Etichette isobariche TMT (16 plex)</td><td>Thermo Scientific</td><td>A44522</td><td>Reagente per marcatura di peptidi; disponibile in più formati</td></tr><tr><td>Tampone bicarbonato di trietilammonio (TEAB)Acido</td> trifluoroacetico <td>Sigma Aldrich</td><td>T7408</td><td></td></tr><tr><td>(TFA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6508</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Promega</td><td>V5820</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>Vacufuge Plus speedvac</td><td>Eppendorf</td><td>22820001</td><td>concentratore sottovuoto</td></tr><tr><td>Vortex mixer</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td></td></tr></tbody></table>

cattura assistita da resina accoppiata con etichettatura isobarica tandem mass tag per la quantificazione multiplexata dell'ossidazione del tiolo proteico

Resin-Assisted Capture Coupled with Isobaric Tandem Mass Tag Labeling for Multiplexed Quantification of Protein Thiol Oxidation

Modificazioni ossidative reversibili sui tioli proteici sono recentemente emerse come importanti mediatori della funzione cellulare. Qui descriviamo la procedura dettagliata di un metodo di proteomica redox quantitativa che utilizza la cattura assistita da resina (RAC) in combinazione con la marcatura isobarica tandem mass tag (TMT) e la cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem (LC-MS / MS) per consentire la quantificazione stechiometrica multiplata dei tioli proteici ossidati a livello di proteoma. Le informazioni quantitative sito-specifiche sui residui di cisteina ossidati forniscono ulteriori informazioni sugli impatti funzionali di tali modifiche. 
Il flusso di lavoro è adattabile a molti tipi di campioni, comprese le cellule in coltura (ad esempio, mammiferi, procarioti) e interi tessuti (ad esempio, cuore, polmone, muscolo), che sono inizialmente lisati / omogeneizzati e con tioli liberi alchilati per prevenire l'ossidazione artificiale. I tioli proteici ossidati vengono quindi ridotti e catturati da una resina di affinità tiolica, che ottimizza e semplifica le fasi del flusso di lavoro consentendo l'esecuzione delle procedure di digestione, etichettatura e lavaggio senza ulteriore trasferimento di proteine / peptidi. Infine, i peptidi marcati vengono eluiti e analizzati da LC-MS/MS per rivelare cambiamenti stechiometrici completi relativi all'ossidazione del tiolo attraverso l'intero proteoma. Questo metodo migliora notevolmente la comprensione del ruolo della regolazione redox-dipendente negli stati fisiologici e fisiopatologici correlati all'ossidazione del tiolo proteico.

Il completamento del protocollo comporterà un arricchimento altamente specifico di peptidi precedentemente ossidati contenenti cisteina, spesso con specificità del &gt;95% 27,35,36. Tuttavia, diverse fasi chiave del protocollo richiedono un'attenzione speciale, ad esempio il blocco iniziale dei tioli liberi prima della lisi/omogeneizzazione del campione, che vieta l'ossidazione artificiale e l'arricchimento non specifico dei tio...

L'ossidazione del tiolo proteico ha implicazioni significative in condizioni fisiologiche e fisiopatologiche normali. Descriviamo i dettagli di un metodo di proteomica redox quantitativa, che utilizza la cattura assistita da resina, la marcatura isobarica e la spettrometria di massa, consentendo l'identificazione sito-specifica e la quantificazione dei residui di cisteina ossidati in modo reversibile delle proteine.

Cattura assistita da resina accoppiata con etichettatura isobarica Tandem Mass Tag per la quantificazione multiplexata dell'ossidazione del tiolo proteico

Reversible oxidative modifications on protein thiols have recently emerged as important mediators of cellular function. Herein we describe the detailed ...

Questo protocollo descrive un metodo che consente l'identificazione sito-specifica dei residui di cistina ossidati delle proteine. Il metodo consente di generare dati quantitativi e sito-specifici dei residui di cistina ossidati da vari tipi di campioni. Per iniziare la procedura di cattura assistita, lavare i pellet proteici precipitati due volte con acetone centrifugando a 20.500 G, in quattro gradi Celsius per 10 minuti.Quindi decantare l'acetone e rimuovere l'acetone rimanente con una micro pipetta. Utilizzando una pipetta sierologica di vetro aggiungere tre millilitri di acetone ghiacciato fresco al tubo e mescolare bene invertendo il tubo più volte. Dopo il secondo lavaggio, lasciare asciugare i pellet all'aria per uno o due minuti senza lasciarli asciugare troppo.Aggiungere un millilitro di tampone B al pellet proteico essiccato. Per solubilizzare la proteina, sonicare ripetutamente il pellet in un sonicatore da bagno con una potenza di 250 watt per 15-30 secondi alla volta, insieme a un breve vortice. Eseguire il test dell'acido bicinconinico o BCA per misurare la concentrazione proteica.Per standardizzare le concentrazioni proteiche, trasferire 500 microgrammi di campione proteico in un filtro centrifugo da 0,5 millilitri, 10 kilodalton, e aumentare il campione a 500 microlitri con tampone di risospensione. Centrifugare la miscela tampone proteica a 14.000 G a temperatura ambiente, fino a quando il volume nel filtro centrifugo è inferiore a 100 microlitri. Raccogliere il campione capovolgendo il filtro in una provetta di raccolta.Centrifugare il campione a 1000 G per due minuti e aggiungere tampone C per ottenere un volume finale di 500 microlitri. Per ridurre i tioli proteici, aggiungere 20 microlitri di ditiotreitolo 500 millimolare o DTT, al campione per ottenere una concentrazione finale di 20 millimolari e incubare i campioni per 30 minuti a 37 gradi Celsius con agitazione a 850 giri / min. Dopo la riduzione, centrifugare i campioni in filtri centrifughi da 0,5 millilitri da 10 kilodalton a 14.000 G a temperatura ambiente, fino a quando il volume nel filtro centrifugo è inferiore a 100 microlitri.Aggiungere il tampone D per portare il volume a 500 microlitri e ripetere la centrifugazione. Dopo la quarta centrifugazione, raccogliere i campioni capovolgendo il filtro in una provetta di raccolta per centrifugare a 1000 G per due minuti. Quindi misurare la concentrazione proteica utilizzando il test BCA.Quindi, posizionare le colonne di rotazione su un collettore a vuoto e, utilizzando una micro pipetta, trasferire 500 microlitri del liquame di resina di affinità tiolica appena preparato su ciascuna colonna. Applicare il vuoto per la rimozione dell'acqua. Ripetere la procedura una volta per ottenere 30 milligrammi di resina per colonna.Lavare la resina cinque volte con 500 microlitri di acqua ultrapura, applicando un vuoto per rimuovere l'acqua e poi cinque volte con 500 microlitri di tampone E.In una nuova provetta, aggiungere tampone C a 150 microgrammi del campione proteico ridotto fino a quando il volume finale è di 120 microlitri. Trasferire la soluzione proteica in una colonna di spin tappata contenente la resina. Posizionare il tappo sulla colonna e incubare per due ore a temperatura ambiente agitando a 850 giri / min.Lavare la resina come descritto nel manoscritto. Sostituire la spina. Per eseguire la digestione triptica su resina, aggiungere 120 microlitri di soluzione di tripsina appena preparata ai campioni e incubare la colonna durante la notte a 37 gradi Celsius, con agitazione a 850 giri / min.Il giorno successivo, lavare la resina più volte come descritto nel manoscritto e sostituire il tappo. Utilizzando una micro pipetta, aggiungere 40 microlitri di tampone bicarbonato di trietilammonio da 100 millimolari alla resina lavata. Quindi aggiungere 70 microlitri del tag di massa tandem disciolto o del reagente di etichettatura TMT e incubare per un'ora a temperatura ambiente agitando a 850 giri / min.Conservare il reagente TMT rimanente a meno 80 gradi Celsius. Lavare la resina e sostituire la spina. Eluire i peptidi marcati con TMT aggiungendo 100 microlitri di tampone bicarbonato di ammonio 100 millimolari a pH 8,0, contenente 20 millimolari DTT, alla colonna e incubando la colonna su un miscelatore termico a temperatura ambiente per 30 minuti a 850 RPM.Dopo l'incubazione, eseguire l'eluizione posizionando la colonna su un collettore sottovuoto, applicando il vuoto e facendo eluire i campioni in una provetta da microcentrifuga da cinque millilitri. Ripetere il passaggio una volta, quindi aggiungere 100 microlitri di 80% acetonitrile con acido trifluoroacetico allo 0,1% alla colonna. Dopo aver incubato la colonna per 10 minuti a temperatura ambiente, eluire il campione nella stessa provetta da centrifuga da cinque millilitri.Porre i campioni eluiti in un concentratore di vuoto fino a quando non sono asciutti. Quindi conservare i peptidi secchi a meno 80 gradi Celsius fino a un ulteriore utilizzo. L'analisi qualitativa dei campioni di peptidi da cellule RAW 264.7 è stata effettuata con SDS-PAGE, in cui i campioni sono stati confrontati determinando diversi livelli di ossidazione dovuti ai trattamenti.Le proteine separate sono state successivamente sondate da western blot per studiare ulteriormente i livelli di ossidazione delle singole proteine. Le intensità ioniche riportate dei peptidi contenenti cistina sono state analizzate mediante spettrometria di massa tandem per cromatografia liquida. Sono state quantificate la stechiometria di ossidazione tiolica di iTRAQ, peptidi arricchiti e ossidati marcati a livello di sito di cistina.Rimuovere con cura l'acetone senza disturbare il pellet proteico. Assicurarsi che il pellet proteico sia completamente solubilizzato e quantificato con precisione e che la resina sia accuratamente assegnata alle colonne di rotazione. Assicurarsi di risospendere la resina durante le fasi di lavaggio.Un'ulteriore valutazione di proteine e peptidi arricchiti può essere eseguita mediante SDS-PAGE e colorazione, western blotting e spettrometria di massa.

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Cattura assistita da resina accoppiata con etichettatura isobarica Tandem Mass Tag per la quantificazione multiplexata dellossidazione del tiolo proteico (Video) | JoVE Journal

Cattura assistita da resina accoppiata con etichettatura isobarica Tandem Mass Tag per la quantificazione multiplexata dell'ossidazione del tiolo proteico

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