Scambio idrogeno/deuterio basato sull'elettroforesi capillare per la caratterizzazione conformazionale di proteine con spettrometria di massa top-down

Questo metodo consente di separare le specie proteiche coesistenti, inclusi diversi conformatori o varianti e di completare online le loro differenze di struttura di ordine superiore in un'unica misurazione CEMS. Utilizza l'effetto elettroforetico per fornire un ambiente di durata quasi del 100% per le reazioni HDX e la separazione ortogonale delle specie proteiche coesistenti durante l'HDX per l'analisi della SM dall'alto verso il basso. Inizia con il precondizionamento dell'elettroforesi capillare, dello scambio di idrogeno deuterio o della configurazione CE HDX.

Utilizzando l'ultrasonicazione in una miscela di 50% metanolo, 49% acqua e 1% acido formico, pulire il flusso attraverso l'interfaccia microviale CE-MS per almeno 30 minuti a temperatura ambiente. Montare il capillare modificato HPC sull'elettroferesi capillare o sullo strumento CE. Risciacquare il capillare con soluzione di elettrolita di fondo o BGE per 10 minuti utilizzando il campionatore automatico e lasciarlo riempire con il BGE.

Utilizzare una lunghezza appropriata di tubo capillare di silice fusa non modificato come tubo di infusione per la soluzione modificatrice. Utilizzare un'unione e un manicotto appropriato per collegare il tubo modificatore a una siringa di vetro a tenuta di gas con una temperatura smussata e risciacquare il tubo con la soluzione modificatore per almeno 10 minuti utilizzando una pompa per infusione. Inserire le uscite del capillare e del tubo modificatore CE codificato HPC caricato con le soluzioni corrispondenti nell'interfaccia CE-MS pulita.

Far avanzare la siringa con le pompe per infusione in modo che la soluzione modificatrice raggiunga la punta dell'interfaccia. Montare l'interfaccia CE-MS assemblata su una sorgente di ionizzazione a spruzzo nanoelettronico che ospita uno spettrometro di massa. Applicare una tensione di spruzzatura di 3-5 kilovolt all'interfaccia CE-MS.

Infondere la soluzione modificatrice con la pompa infusore a una portata compresa tra 0,1-10 microlitri al minuto e garantire un elettrospruzzatore stabile sulla punta dell'interfaccia CE-MS. Posizionare il flaconcino del campione contenente il BGE e il campionatore automatico, che verrà utilizzato in seguito per acquisire elettroferogrammi vuoti e spettri di massa in bianco. Stimare il volume di iniezione utilizzando la relazione tra volume di iniezione e parametri di iniezione.

E iniettare la soluzione campione utilizzando il campionatore automatico a due PSI per una durata appropriata. Avviare la separazione CE applicando una tensione elettroforetica di 20 kilovolt in una pressione di infusione compresa tra 0-2 PSI e acquisire l'elettroferogramma. Nel frattempo, acquisire i dati MS in modalità cromatografica in cui il grafico a corrente ionica viene acquisito in funzione del tempo e le corrispondenti scansioni MS non vengono automaticamente combinate in un unico spettro.

Salvate l'elettroferogramma vuoto e gli spettri di massa come riferimenti. Posizionare i flaconcini campione contenenti le concentrazioni desiderate delle soluzioni campione proteiche nell'autocampionatore e acquisire gli elettroferogrammi e gli spettri MS1 delle specie proteiche elettroforeticamente separate ed etichettate con deuterio. Eseguire misurazioni in tandem Ms.per le specie di interesse, dopo aver acquisito gli spettri MS1 all'interno della stessa corsa o in una successiva corsa separata.

Dopo ogni misurazione, lavare il capillare con BGE ad una pressione di 20 PSI per almeno 10 minuti. Pulire l'interfaccia CEMS e tutti i tubi per lo stoccaggio al termine degli esperimenti. Acquisire un set di dati del campione di endpoint HDX con SM in modalità infusione diretta.

Una bassa pressione di infusione ha portato a una migliore separazione dei picchi CE, ma ha portato ad un aumento sia del tempo di migrazione che della durata dell'esperimento. Un tempo di reazione HDX più lungo ha comportato un livello più elevato di dedurazione degli analiti proteici. La varianza A e B delle beta immunoglobuline o beta IG, che differiscono solo per due residui di amminoacidi nella loro sequenza, ha dato origine a due picchi adeguatamente separati nell'elettroferogramma derivato dall'EIC.

La varianza differenziale marcata con deuterio ha portato a una distribuzione di massa distinta degli ioni. Un numero inferiore in abbondanza relativa di ioni Z rispetto agli ioni C è stato osservato a causa dell'unico legame disofiato nella conferma di beta IG che limita l'efficienza di frammentazione tra CS 82 e CS 176. La maggior parte degli ioni frammento prodotti da beta IGA e beta IGB mostrano un'estensione simile di assorbimento del deuterio.

Tuttavia, i segmenti più grandi che coprono i siti di variazione della sequenza da beta IGA sono stati dedurati in misura significativamente maggiore rispetto al beta IGB. Il pH di BGE viene regolato in base al punto isoelettrico del campione per prevenire l'aggregazione proteica e facilitare la separazione mantenendo il complesso.