Name: Generazione di organoidi del cervello umano per la modellazione della malattia mitocondriale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Scopri come generare organoidi cerebrali da iPSC umani per modellare malattie mitocondriali senza bioreattori costosi. Questo protocollo semplificato consente analisi bioenergetiche e identificazione di target terapeutici.

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Ringraziamo Miriam Bünning per il supporto tecnico. Riconosciamo il sostegno della Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (PR1527/5-1 ad A.P.), Spark and Berlin Institute of Health (BIH) (BIH Validation Funds to A.P.), della United Mitochondrial Disease Foundation (UMDF) (Leigh Syndrome International Consortium Grant to A.P.), dell'University Hospital Duesseldorf (Forschungskommission UKD to A.P.) e del Ministero Federale Tedesco dell'Istruzione e della Ricerca (BMBF) (e: Bio giovane investigatore concede AZ 031L0211 ad A.P.). Il lavoro nel laboratorio del C.R.R. è stato sostenuto dal DFG (FOR 2795 "Synapses under stress", Ro 2327/13-1).

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<li>Inak, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+metabolic+programming+impairs+early+neuronal+morphogenesis+in+neural+cultures+and+an+organoid+model+of+Leigh+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Defective metabolic programming impairs early neuronal morphogenesis in neural cultures and an organoid model of Leigh syndrome.</a> Nature Communications. 12 (1), 1929(2021).</li>
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<li>Pfiffer, V., Prigione, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+the+bioenergetic+profile+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Assessing the bioenergetic profile of human pluripotent stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1264, 279-288 (2015).</li>
<li>Ludikhuize, M. C., Meerlo, M., Burgering, B. M. T., Colman, R. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+to+profile+the+bioenergetics+of+organoids+using+Seahorse%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocol to profile the bioenergetics of organoids using Seahorse.</a> STAR Protocols. 2 (1), 100386(2021).</li>
<li>Menacho, C., Prigione, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tackling+mitochondrial+diversity+in+brain+function%3A+from+animal+models+to+human+brain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biochemestry+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tackling mitochondrial diversity in brain function: from animal models to human brain organoids.</a> International Journal of Biochemestry & Cell Biology. 123, 105760(2020).</li>
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Gli autori non dichiarano interessi finanziari o non finanziari concorrenti.

Questo articolo descrive la generazione riproducibile di organoidi cerebrali umani derivati da iPSC e il loro uso per la modellazione della malattia mitocondriale. Il protocollo qui descritto viene modificato sulla base di un lavoro pubblicato in precedenza20. Uno dei principali vantaggi del presente protocollo è che non richiede l'incorporamento manuale di ciascun organoide in una matrice di impalcatura. Infatti, la soluzione della matrice viene semplicemente disciolta nel terreno di coltura cell...

Le malattie mitocondriali rappresentano la più grande classe di errori congeniti del metabolismo1. Sono causati da mutazioni genetiche che interrompono diversi processi mitocondriali, tra cui la fosforilazione ossidativa (OXPHOS)2, l'assemblaggio della catena respiratoria, la dinamica mitocondriale e la trascrizione o la replicazione del DNA mitocondriale3. I tessuti con fabbisogno energetico sono particolarmente colpiti dalla disfunzione mitocondriale4. Di conseguenza, i pazienti con malattie mitocondriali sviluppano tipicamente manifestazioni neurologiche ad esordio precoce.
Attualmente non sono disponibili trattamenti per i bambini affetti da malattie mitocondriali5. Uno dei principali ostacoli allo sviluppo di farmaci per le malattie mitocondriali è la mancanza di modelli efficaci che ricapitolino il decorso della malattia umana6. Molti dei modelli animali attualmente studiati non presentano i difetti neurologici presenti nei pazienti7. Quindi, i meccanismi alla base della patologia neuronale delle malattie mitocondriali non sono ancora completamente compresi.
Studi recenti hanno generato iPSC da pazienti affetti da malattie mitocondriali e hanno utilizzato queste cellule per ottenere cellule neuronali specifiche del paziente. Ad esempio, è stato scoperto che i difetti genetici associati alla malattia mitocondriale, la sindrome di Leigh, causano aberrazioni nella bioenergetica cellulare8,9, nella sintesi proteica10 e nell'omeostasi del calcio9,11. Questi rapporti hanno fornito importanti indizi meccanicistici sulla compromissione neuronale che si verifica nelle malattie mitocondriali, aprendo la strada alla scoperta di farmaci per queste malattie incurabili12.
Le culture bidimensionali (2D), tuttavia, non consentono lo studio della complessità architettonica e dell'organizzazione regionale degli organi 3D13. A tal fine, l'uso di organoidi cerebrali 3D derivati da iPSC specifiche del paziente14 può consentire ai ricercatori di ottenere ulteriori informazioni importanti e quindi aiutare a sezionare come le malattie mitocondriali influenzano lo sviluppo e la funzione del sistema nervoso15. Gli studi che impiegano organoidi cerebrali derivati da iPSC per studiare le malattie mitocondriali stanno iniziando a scoprire i componenti dello sviluppo neurologico delle malattie mitocondriali. 
Gli organoidi del midollo spinale portatori di mutazioni associate alla malattia mitocondriale, all'encefalopatia mitocondriale, all'acidosi lattica e alla sindrome da episodi simili a ictus (MELAS), hanno mostrato neurogenesi difettosa e differenziazione ritardata dei motoneuroni16. Gli organoidi corticali derivati da pazienti con malattia mitocondriale, sindrome di Leigh, hanno mostrato dimensioni ridotte, difetti nella generazione di gemme epiteliali neurali e perdita dell'architettura corticale17. Gli organoidi cerebrali dei pazienti con sindrome di Leigh hanno dimostrato che i difetti della malattia iniziano a livello delle cellule progenitrici neurali, che non possono impegnarsi nel metabolismo mitocondriale, causando aberranti ramificazioni neuronali e morfogenesi18. Pertanto, i progenitori neurali possono rappresentare un bersaglio terapeutico cellulare per le malattie mitocondriali e le strategie che promuovono la loro funzione mitocondriale possono supportare lo sviluppo funzionale del sistema nervoso.
L'uso di organoidi cerebrali potrebbe aiutare a scoprire i componenti dello sviluppo neurologico delle malattie mitocondriali. Le malattie mitocondriali sono considerate principalmente come neurodegenerazione ad esordio precoce5. Tuttavia, i difetti dello sviluppo neurologico sono presenti anche nei pazienti affetti da malattie mitocondriali, tra cui ritardo dello sviluppo e deterioramento cognitivo19. Gli organoidi cerebrali specifici del paziente possono aiutare ad affrontare questi aspetti e chiarire come le malattie mitocondriali possono avere un impatto sullo sviluppo del cervello umano. La disfunzione mitocondriale potrebbe anche svolgere un ruolo patogenetico in altre malattie neurologiche più comuni, come il morbo di Alzheimer, il morbo di Parkinson e la malattia di Huntington4. Quindi, chiarire l'impatto dei difetti mitocondriali nel neurosviluppo usando organoidi cerebrali potrebbe anche essere strumentale per lo studio di tali malattie. Questo documento descrive un protocollo dettagliato per la generazione di organoidi cerebrali riproducibili che possono essere utilizzati per condurre la modellazione delle malattie mitocondriali.

<table><tbody><tr><td>2-mercaptoetanolo</td><td>Gibco</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>Affinity Designer</td><td>Serif (Europe) Ltd</td><td></td><td>Software di layout; Editor di grafica vettoriale</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 asino anti-porcellino d'India</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SAB4600033-250UL</td><td>1:300</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 asino anti-topo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-31571</td><td>1:300</td></tr><tr><td>Antimicina A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1397-94-0</td><td></td></tr><tr><td>Anti-&beta;-Tubulina III (TUJ-1)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8578</td><td>1:2000</td></tr><tr><td>Laser ad argon</td><td>Melles Griot</td><td></td><td>Qualsiasi altro laser, ad esempio i laser a diodi che emettono 488 va bene, anche</td></tr> acido <tr><td>ascorbico</td><td>Sigma</td><td>A92902</td><td></td></tr><tr><td>B-27 con vitamina A</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td>3% in PBS, conservare la soluzione a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-0811</td><td></td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma</td><td>D0627</td><td></td></tr><tr><td>Cell Star coltura cellulare piastra a 6 pozzetti</td><td>Greiner-Bio-One</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>Concentrato lipidico chimicamente definito</td><td>Gibco</td><td>11905031</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a scansione laser confocale C1</td><td>Nikon Microscopio</td><td></td><td>Soluzioni Microscopio confocale modulare Corning</td></tr><tr><td>Matrigel Fattore di crescita ridotto (GFR) Matrice della membrana basale, senza rosso fenolo, senza LDEV</td><td>Componente della matrice</td><td>Corning</td><td>356231</td></tr><tr><td>Kit per il saggio di proliferazione cellulare CyQUANT</td><td>Thermo Fisher</td><td>C7026</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>ThermoFisher</td><td>31330038</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2660-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Asino anti-capra Cy3</td><td>Merck Millipore</td><td>AP180C</td><td>1:300</td></tr><tr><td>Asino anti-topo Cy3</td><td>Merck Millipore</td><td>AP192C</td><td>1:300</td></tr><tr><td>Asino anti-coniglio Cy3</td><td>Merck Millipore</td><td>AP182C</td><td>1:300</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>DS-Q1Mc fotocamera</td><td>Nikon Microscopio</td><td></td><td></td></tr> Soluzioni <tr><td>Microscopio verticale Eclipse 90i Microscopio</td><td>Nikon Soluzioni</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio verticale Eclipse E 600FN</td><td>Microscopio Nikon Solutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertito Eclipse Ts2</td><td>Nikon Microsope Solutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EZ-C1 Silver Version 3.91</td><td>Nikon Microscope Solutions</td><td></td><td>Software di imaging per microscopio confocale</td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>370-86-5</td><td></td></tr><tr><td>Siero bovino fetale</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>GDNF</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-291</td><td></td></tr><tr><td>Glasgow MEM</td><td>Gibco</td><td>11710-035</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta in vetro Pasteur</td><td>Marca</td><td>747715</td><td>Glutamax invertito</td></tr><tr><td></td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Laser elio-neon</td><td>Melles Griot</td><td></td><td>Ogni altro laser, ad esempio i laser a diodi che emettono 594 va bene, anche</td></tr><tr><td>Eparina</td><td>Merck</td><td>H3149-25KU</td><td></td></tr><tr><td>HERACell 240i CO2 Incubatore</td><td>Thermo Scientific</td><td>51026331</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>1:2500</td></tr><tr><td>Immagine J 1.53c</td><td>Wayne Rasband National Institute of Health</td><td></td><td>Software di elaborazione delle immagini</td></tr><tr><td>Injekt Solo 10 mL/ Luer</td><td>Braun</td><td>4606108V</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Siero di Ricambio</td><td>Gibco</td><td>10828010</td><td></td></tr><tr><td>Laser (407 nm)</td><td>Coerente</td><td></td><td>Qualsiasi altro laser, ad esempio i laser a diodi che emettono 407, va bene, anche</td></tr><tr><td>Map2</td><td>Synaptic Systems</td><td>No. 188004</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Maxisafe 2030i</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEM NEAA</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR Plus</td><td>Proteina Stemcell Technology</td><td>85850</td><td>iPSC medium</td></tr><tr><td>Centrifuga Multifuge X3R</td><td>Thermo Scientific</td><td>10325804</td><td></td></tr><tr><td>Kit di rilevamento del micoplasma MycoAlert</td><td>Lonza</td><td># LT07-218</td><td></td></tr><tr><td>N2 Supplemento</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Ago per uso singolo (23G x 1" TW)</td><td>Neoject</td><td>10016</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements Aadvanced Research 3.2</td><td>Nikon</td><td></td><td>Imaging software</td></tr><tr><td>Oligomicina A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>75351</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore orbitale Heidolph Unimax 1010</td><td>Heidolph</td><td>543-12310-00</td><td></td></tr><tr><td>PAP Pen</td><td>Sigma</td><td>Z377821-1EA</td><td>Per disegnare una barriera idrofobica sui vetrini.</td></tr><tr><td>Kit del sistema di dissociazione della papaina</td><td>Worthington</td><td>LK003150</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Merck</td><td>818715</td><td>4% in PBS, conservare la soluzione a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Pipetta Pasteur 7mL</td><td>VWR</td><td>612-1681</td><td>Graduata fino a 3 mL</td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Plan Apo VC 20x / 0.75 aria DIC N2&nbsp; &infin;/0.17 WD 1.0</td><td>Nikon Microscope Solutions</td><td></td><td>Obiettivo per microscopio a secco</td></tr><tr><td>Plan Apo VC 60x / 1.40 olio DIC N2 &infin;/0.17 WD 0.13</td><td>Soluzioni per microscopio</td><td></td> <td>NikonMicroscopio a immersione in olio Obiettivo</td></tr><tr><td>Piastra di Petri in polistirene (100 mm)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>664161</td><td></td></tr><tr><td>Tubo in polistirene a fondo tondo con tappo per filtro cellulare (5 mL)</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Roth</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Glass Antifade Moutant</td><td>Invitrogen</td><td>P36980</td><td></td></tr><tr><td>Carta da filtro qualitativa</td><td>VWR</td><td>516-0813</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore di roccia</td><td>Merck</td><td>SCM075</td><td></td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma</td><td>83-794</td><td></td></tr><tr><td>S100&beta;</td><td>Abcam</td><td>Ab11178</td><td>1:600</td></tr><tr><td>SB-431542</td><td>Cayman Chemical Company</td><td>13031</td><td></td></tr><tr><td>Lame per bisturi</td><td>Heinz Herenz Hamburq</td><td>1110918</td><td></td></tr><tr><td>SMI312</td><td>Biolegend</td><td>837904</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio</td><td>Merck/Sigma</td><td>31437-1kg-M</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td></td><td>Roth 3957</td><td></td></tr><tr><td>Sodio diidrogeno fosfato</td><td>Applichem</td><td>131965</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Piruvato</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>SOX2</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>Sc-17320</td><td>1:100</td></tr><tr><td>StemPro Accutase Reagente di dissociazione cellulare</td><td>Gibco/StemPro</td><td>A1110501</td><td>Reagente A</td></tr><tr><td>Super Glue Gel</td><td>UHU</td><td>63261</td> gel <td>adesivo</td></tr><tr><td>SuperFrost Plus</td><td>VWR</td><td>631-0108</td><td></td></tr><tr><td>Siringa per uso singolo (1 mL)</td><td>BD Plastipak</td><td>300015</td><td></td></tr><tr><td>TB2 Thermoblock</td><td>Biometra</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TC Piastra a 24 pozzetti</td><td>Sarstedt</td><td>83.3922</td><td></td></tr><tr><td>Piastra TC a 6 pozzetti</td><td>Sarstedt</td><td>83.392</td><td></td></tr><tr><td>TGFbeta3</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-007</td><td></td></tr><tr><td>Cappa</td> <td>per coltura tissutaleThermoFisher</td><td>51032711</td><td></td></tr><tr><td>TOM20</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-11415</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Merck</td><td>X100-5ML</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0.5M EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome Microm HM 650 V</td><td>Thermo Scientific Production</td><td></td><td>terminato, anche qualsiasi altro microtomo regolabile va bene.</td></tr><tr><td>Vibratome Wilkinson Classic Razor Blade</td><td>Wilkinson Sword</td><td>70517470</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Benchkote</td><td>Merck/Sigma</td><td>28418852</td><td></td></tr><tr><td>Wnt Antagonista I</td><td>EMD Millipore Corp</td><td>3378738</td><td></td></tr><tr><td>XF 96 analizzatore di flusso extracellulare</td><td>Cavalluccio marino</td><td>Bioscience 100737-101</td><td></td></tr><tr><td>XF Assay DMEM</td><td>Cavalluccio marino</td> medio <td>Bioscience 103680-100</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione calibrante XF</td><td>Cavalluccio marino Bioscience</td><td>100840-000</td><td></td></tr><tr><td>XFe96 FluxPak (micropiastra a 96 pozzetti)</td><td>Cavalluccio marino</td><td>Bioscience 102416-100</td><td></td></tr></tbody></table>

generazione di organoidi del cervello umano per la modellazione della malattia mitocondriale

Generation of Human Brain Organoids for Mitochondrial Disease Modeling

Le malattie mitocondriali rappresentano la più grande classe di errori congeniti del metabolismo e sono attualmente incurabili. Queste malattie causano difetti dello sviluppo neurologico i cui meccanismi sottostanti rimangono da chiarire. Un importante ostacolo è la mancanza di modelli efficaci che ricapitolino la compromissione neuronale ad esordio precoce osservata nei pazienti. I progressi nella tecnologia delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) consentono la generazione di organoidi cerebrali tridimensionali (3D) che possono essere utilizzati per studiare l'impatto delle malattie sullo sviluppo e l'organizzazione del sistema nervoso. I ricercatori, compresi questi autori, hanno recentemente introdotto organoidi del cervello umano per modellare i disturbi mitocondriali. Questo documento riporta un protocollo dettagliato per la robusta generazione di organoidi cerebrali umani derivati da iPSC e il loro uso nella profilazione bioenergetica mitocondriale e nelle analisi di imaging. Questi esperimenti consentiranno l'uso di organoidi cerebrali per studiare le disfunzioni metaboliche e dello sviluppo e possono fornire informazioni cruciali per sezionare la patologia neuronale delle malattie mitocondriali.

Il protocollo qui descritto facilita la robusta generazione di organoidi rotondi (Figura 1A). Gli organoidi generati contengono neuroni maturi che possono essere visualizzati utilizzando marcatori proteici specifici per assoni (SMI312) e dendriti (proteina 2 associata a microtubuli (MAP2)) (Figura 1B). Gli organoidi maturi contengono non solo cellule neuronali (MAP2-positive) ma anche cellule gliali (ad esempio,...

Descriviamo un protocollo dettagliato per la generazione di organoidi cerebrali derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo e il loro uso nella modellazione delle malattie mitocondriali.

Generazione di organoidi del cervello umano per la modellazione della malattia mitocondriale

Mitochondrial diseases represent the largest class of inborn errors of metabolism and are currently incurable. These diseases cause neurodevelopmental ...

Questo protocollo mira a utilizzare organoidi cerebrali per studiare le malattie mitocondriali. È stato sviluppato per generare organoidi cerebrali riproducibili nella valutazione delle loro proprietà mitocondriali. Questo metodo non richiede costosi bioreattori e lunghe procedure di incorporamento.Pertanto, è facile da implementare e aggiornare. Questo protocollo consente di generare organoidi cerebrali riproducibili e di testarne le proprietà mitocondriali. Ciò può portare all'identificazione di bersagli interventistici per le malattie dei mitocondri non curabili.Per iniziare, coltivare iPSC umani in condizioni prive di alimentatore in mezzo iPSC su piastre rivestite a sei pozzetti e tenerle in un incubatore di colture tissutali umidificate a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Passare le iPSC all'80% di confluenza utilizzando il mezzo di distacco privo di enzimi in rapporti che vanno da uno per quattro a uno per 12. Per aumentare la sopravvivenza cellulare, aggiungere 10 protein chinasi micromolari rho-associate o inibitore ROCK dopo ogni scissione.Dissociare l'80% delle iPSC al giorno zero. Preparare il mezzo di differenziazione corticale uno o CDM1 e preriscaldarlo a temperatura ambiente prima di aggiungerlo alle cellule. Lavare i pozzetti contenenti gli iPSC con PBS per rimuovere cellule morte e detriti.Aggiungere 500 microlitri di reagente A preriscaldato a ciascun pozzetto e incubare per cinque minuti a 37 gradi Celsius. Controllare al microscopio per garantire il distacco cellulare. Aggiungere un millilitro di mezzo iPSC per diluire il reagente A per neutralizzarne l'attività.Utilizzare una pipetta da 1.000 microlitri per dissociare le celle tubando su e giù e trasferire la sospensione cellulare in un tubo centrifugo da 15 millilitri. Centrifugare delicatamente le iPSC a 125 volte G per cinque minuti a temperatura ambiente, quindi aspirare accuratamente il surnatante per evitare di disturbare il pellet cellulare. Risospesciare il pellet con un millilitro di CDM1 per ottenere una sospensione a cella singola e contare il numero di cella.Preparare il terreno di semina con 9.000 iPSC per 100 microlitri in CDM1 integrati con 20 inibitori ROCK micromolari, tre inibitori micromolari della catenina WNT o IWR-1 e cinque micromolari SB-431542. Aggiungere 100 microlitri di terreno di semina per pozzetto a una piastra inferiore a V a 96 pozzetti. Tenere la piastra in un incubatore di colture tissutali umidificate a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica.Per generare neurosfere, il primo giorno, osserva che si stanno formando aggregati di cellule rotonde con bordi lisci definiti. Si notino le cellule morte intorno agli aggregati. Continuare a coltivare nell'incubatore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.Il terzo giorno, agitare la piastra toccando i lati tre volte per staccare le cellule morte, quindi aggiungere 100 microlitri di CDM1 integrati con 20 inibitori ROCK micromolari, tre micromolari IWR-1 e cinque micromolari SB-431542 a ciascun pozzetto. Tenere la piastra all'incubatore a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Il sesto giorno, rimuovere con cura 80 microlitri del mezzo surnatante da ciascun pozzetto.Evitare di toccare il fondo del pozzo. Aggiungere 100 microlitri di CDM1 integrati con tre micromolari IWR-1 e cinque micromolari SB-431542 a ciascun pozzetto e incubare la piastra. Ripetere il passaggio precedente ogni tre giorni fino al giorno 18.Il giorno 18, per trasferire le neurosfere, preparare CDM2 e aggiungere 10 millilitri a una piastra di coltura cellulare ad attacco ultra basso da 100 millimetri. Utilizzare una pipetta da 200 microlitri con la punta tagliata per trasferire le neurosfere rotonde dalla piastra a 96 pozzetti alla piastra di coltura cellulare ad attacco ultra basso da 100 millimetri. Rimuovere cinque millilitri di mezzo dalla piastra contenente le neurosfere e aggiungere cinque millilitri di CDM2 fresco.Posizionare la piastra su uno shaker orbitale a 70 rotazioni al minuto all'interno di un incubatore di colture tissutali umidificate a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Ogni tre giorni, aspirare accuratamente il mezzo surnatante e sostituirlo con CDM2 fresco. Lasciare una piccola quantità del mezzo per evitare che le neurosfere si secchino.Il giorno 35, prepara CDM3. Aspirare il mezzo dalla piastra e aggiungere 10 millilitri di CDM3 freddo. Dopo aver cambiato il mezzo, riposizionare la piastra su uno shaker orbitale a 70 rotazioni al minuto all'interno di un incubatore di colture tissutali umidificate a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica.Cambia il mezzo ogni tre o cinque giorni a seconda del tasso di crescita indicato dal colore del mezzo. Il giorno 70, preparare CDM4. Utilizzare il mezzo CDM4 fino al raggiungimento dell'età desiderata degli organoidi.Durante questo periodo, mantenere la piastra su uno shaker orbitale impostato a 70 rotazioni al minuto all'interno di un incubatore di colture tissutali umidificate a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Cambia il mezzo ogni tre o cinque giorni a seconda del tasso di crescita. Preparare la soluzione al 4% di PFA e posizionarla sotto un cappuccio di sicurezza.Raccogli gli organoidi cerebrali e trasferiscili delicatamente con una pipetta Pasteur di plastica da tre millilitri con punta smussata su una piastra a sei pozzetti piena di PFA. Conservare gli organoidi nella soluzione di PFA per un'ora a temperatura ambiente. Rimuovere con cura il PFA con una pipetta Pasteur in plastica da tre millilitri e lavare gli organoidi fissi tre volte utilizzando PBS.Conservare gli organoidi fissi a quattro gradi Celsius in PBS fino a nuovo utilizzo. Gli organoidi generati utilizzando questo protocollo contengono neuroni maturi che possono essere visualizzati utilizzando marcatori proteici specifici per assoni e dendriti. Gli organoidi maturi contengono non solo cellule neuronali, ma anche cellule gliali.Utilizzando l'analisi degli organoidi cerebrali affettati, è possibile monitorare gli assoni positivi SMI 312 e i dendriti MAP2 positivi o le cellule beta gliali S100. Inoltre, le immagini confocali aiutano a studiare la distribuzione dettagliata e l'organizzazione dei progenitori neurali positivi SOX2 rispetto ai neuroni beta-3 positivi alla tubulina. Gli organoidi cerebrali sono stati colorati per marcatori specifici dei mitocondri, come translocase della membrana esterna o TOM20.Il profilo bioenergetico degli organoidi cerebrali è stato eseguito misurando sia il metabolismo mitocondriale utilizzando il tasso di consumo di ossigeno, o OCR, sia il metabolismo glicolitico utilizzando il tasso di acidificazione extracellulare, o ECAR. L'oligomicina provoca un calo del profilo OCR e quindi identifica l'OCR necessario per la produzione di ATP. Dopo il trattamento con oligomicina, ci può anche essere un aumento compensatorio dell'ECAR suggerendo che le cellule possono sovraregolare la glicolisi per prevenire lo stress metabolico.Quando si trasferiscono le neurosfere dalla piastra a 96 pozzetti a una piastra di coltura o durante la procedura di fissaggio, è fondamentale maneggiare delicatamente gli organoidi per evitare di danneggiarli. Dopo la generazione di organoidi cerebrali, l'array multi-elettrodo o l'imaging del calcio sarebbero metodi ideali per testare la funzionalità degli organoidi.

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