Sondare le proprietà strutturali e dinamiche delle nanostrutture subcellulari di traffico mediante spettroscopia di fluttuazione spaziotemporale

L'Imaging the Right Mean Square Displacement Method è in grado di estrarre simultaneamente sia la struttura che le proprietà medie dinamiche di un oggetto biologico bersaglio in un campione vivente. Imaging the Right Mean Square Displacement, è una procedura veloce e robusta, senza la necessità di estrarre traiettorie di singoli oggetti e senza bisogno di etichette complesse. Richiede solo una configurazione ottica standard e un oggetto di interesse etichettato fluorescentemente.

Il metodo apre la strada allo screening quantitativo su larga scala delle alterazioni strutturali e dinamiche riscontrate a livello di nanostrutture subcellulari in diverse condizioni patologiche, come il cancro, il diabete o le malattie neurodegenerative. A dimostrare la procedura sarà Fabio Azzarello, dottorando del mio laboratorio. Per iniziare la sottocoltura delle cellule, iniziare lavando un piatto di 10 centimetri trattato con coltura tissutale di cellule hela confluenti, due volte, con PBS molare 0,01.

Quindi, aggiungere 1 millilitro di 0,05% di tripsina-EDTA e incubare il piatto a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per cinque minuti. Sospendere nuovamente le cellule staccate in 9 millilitri di mezzo DMEM completo e raccogliere 10 millilitri di mezzo totale con tripsina nel tubo della centrifuga. Seminare circa 0,2 milioni di cellule in ogni piatto da 35 millimetri per 10 millimetri con il volume medio finale di 1 millilitro, quindi incubare le cellule.

A seconda della struttura subcellulare di interesse, è necessario un metodo di etichettatura specifico e, una volta che la soluzione di etichettatura è pronta, lavare le cellule due volte con 0,01 PBS molare. Dopo aver sostituito PBS con il reagente colorante contenente il mezzo, incubare il piatto a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica, secondo la raccomandazione del produttore. Alla fine dell'incubazione, lavare le cellule due volte con un mezzo fresco prima dell'esperimento.

Prima di eseguire l'acquisizione della serie time-lapsed, accendere il sistema di controllo dell'incubatore del microscopio e lasciare che il microscopio si equilibri a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica, per circa due ore. Utilizzare un laser argon a 488 nanometri per l'eccitazione di EGFP in cellule trasfettate e macropinesomi marcati con fluorescene e raccogliere l'emissione di fluorescenza tra 500 e 600 nanometri, utilizzando un rilevatore a tubo fotomolatore standard. Utilizzare un laser al neon ad elio da 543 nanometri per eccitare il colorante fluorescente e raccogliere l'emissione tra 555 e 655 nanometri.

Impostare il diametro del foro stenopeico di rilevamento sulla dimensione di un Eri. E, per ogni acquisizione, raccogli una serie di 1000 fotogrammi sequenziali. Impostare il tempo di permanenza dei pixel su 2 microsecondi per pixel per un tempo di fotogramma di 129 millisecondi.

Per inizializzare correttamente i parametri strumentali per le acquisizioni, aprire iMSD. M con l'editor di testo del software. Impostare i parametri digitando i valori per N'as il numero di fotogrammi nella serie temporale, la dimensione dei pixel in micrometri e f'as la risoluzione temporale in secondi.

Inoltre, impostare l'input di correzione dello sfondo del filtro su zero, per elaborare le immagini non elaborate o uno, per eseguire una sottrazione di sfondo basata su soglia. Quindi, imposta la soglia di pedaggio AV per la correzione in background. Se il valore del filtro è impostato come uno, i pixel con un'intensità inferiore al valore di soglia verranno impostati su zero.

Quindi, impostare bit come numero intero che determina il campionamento dell'intensità. Salvare ed eseguire l'iMSD modificato. File di script M.

Controllare l'esecuzione dello script nella finestra di comando e, in caso di problemi, verrà visualizzato il messaggio di avviso interrotto. Dopo aver eseguito correttamente lo script, importare lo stack di immagini e sottrarre lo sfondo, se necessario. Quindi, calcola la funzione di correlazione spazio-temporale, usando il metodo di Fourier.

Adatta la funzione di correlazione spazio-temporale con una funzione gaussiana 2D. Quindi, controllare l'output grafico con la curva IMSD e le curve di raccordo corrispondenti, visualizzate in tre pannelli separati per i diversi tipi di equazione di raccordo utilizzata. I valori R-quadrati sono forniti nella legenda del grafico.

Quindi, controlla l'output del testo. L'acquisizione di immagini del lisosoma come organello di prova, è stata eseguita in cellule vive alla risoluzione temporale appropriata e a una risoluzione temporale molto bassa. La deformazione artefattuale del lisosoma dovuta al movimento degli organelli, era visibile nell'immagine a bassa risoluzione.

Il profilo di intensità dello spot è stato derivato utilizzando uno strumento di linea nel software di analisi delle immagini. Quindi, è stata eseguita la stima del diametro dello spot, tracciando e interpolando l'intensità da una funzione gaussiana. L'acquisizione ad alta velocità, ha prodotto una dimensione media della struttura comparabile vicina al campione fisso.

Invece, l'acquisizione a bassa velocità, ha aumentato le dimensioni della struttura, a causa delle dinamiche naturali della struttura durante l'imaging. Le proprietà strutturali e dinamiche dei macropinesomi sono state osservate durante il traffico. Le osservazioni hanno rivelato una diminuzione delle dimensioni medie dei macropinosomi.

Il concomitante aumento del moto sub-diffusivo, è stato indicato da una diminuzione dei valori alfa' Per ogni acquisizione, è stato osservato l'aumento del numero di macropenesomi con il tempo. Al contrario, misurazioni simili eseguite sugli ISG, hanno suggerito un comportamento molto diverso di questi ultimi organelli rispetto ai macropinesomi.

In effetti, i granuli di insulina mostrano proprietà strutturali o dinamiche invariate, medie, suggerendo che sono stati sondati in uno stato stazionario. Il metodo può essere facilmente applicato in modalità a doppio colore, se due distinti organelli subcellulari sono etichettati in modo diverso. In questo caso, l'analisi di correlazione incrociata evidenzierà potenziali interazioni dinamiche dei due oggetti all'interno della cellula.