Isolamento e coltura in vitro di macrofagi derivati dal midollo osseo per lo studio della biologia NO-Redox
31 maggio 2022
Questo protocollo è stato stabilito per coltivare macrofagi murini primari carenti di tetraidrobiopterina (BH4) e ossido nitrico sintasi inducibile (iNOS) per studiare la biologia no-redox. Lo studio si concentra sulla riduzione della potenziale contaminazione di BH4 e di altri artefatti trovati nei metodi tradizionali di isolamento e coltura che possono confondere i risultati sperimentali e l'interpretazione dei risultati.
Questo protocollo aiuta a coltivare macrofagi derivati dal midollo osseo da topi carenti di iNOS o BH4 utilizzando mezzi e siero accuratamente definiti con bassi livelli di BH4 e nitrato per evitare interferenze con i meccanismi redox. Controllando attentamente i livelli di potenziali contaminanti nel processo di coltura, possiamo limitare l'interferenza dell'ossido nitrico, garantendo l'accuratezza e la riproducibilità del sistema modello. Questo metodo consente misurazioni accurate di biopterine, ossido nitrico e qualsiasi fattore a valle correlato a questi composti essenziali.
A dimostrare la procedura sarà il Dr.Thomas Nichol, un ricercatore post-dottorato del nostro laboratorio. Per iniziare, posizionare le gambe in etanolo al 70% per due minuti per lavare via qualsiasi pelliccia o residuo. Quindi, trasferire le gambe in una capsula di Petri batteriologica pulita e sterile.
Raschiare con cura lungo la lunghezza delle ossa con la lama, tagliando i tendini e rimuovendo il muscolo dall'osso. Una volta che le ossa sono state ripulite dal muscolo, tagliare l'epifisi nella parte superiore della tibia, appena sotto il ginocchio. La tibia può essere tagliata all'estremità inferiore, appena sopra l'intersezione con il perone.
Infine, tagliare l'epifisi alle due estremità del femore, appena sotto le articolazioni del ginocchio e dell'anca. Per lavare il midollo osseo, riempire una siringa da 10 millilitri con 10 millilitri di PBS e attaccarla a un ago. Quindi inserire l'ago nella cavità midollare dell'osso.
Lavare delicatamente con uno o due millilitri di PBS, facendo scorrere l'ago su e giù. Quindi, estrarre la sospensione da cinque a dieci volte dentro e fuori da una siringa da un millilitro per disaggregare. Raccogliere la sospensione in una siringa da un millilitro e passarla attraverso un filtro a celle da 70 micrometri in un tubo di centrifuga pulito da 50 millilitri.
Infine, posizionare i campioni sul ghiaccio. Per congelare il midollo osseo per un uso successivo, centrifugare le cellule a 1000 G per cinque minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante e risospesciare il pellet rosso in due millilitri di antigelo.
Quindi, incubarlo a 80 gradi Celsius durante la notte. Se congelato, scongelare rapidamente la sospensione a 37 gradi Celsius. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo sterile pulito contenente tre millilitri di supporti DMEM/F-12.
Successivamente, pellet le celle per centrifugazione. Scartare il surnatante e risospesciare il pellet in tre millilitri del supporto DMEM/F-12 preparato. Contare le cellule e placcarle in oggetti di plastica non rivestiti di TC nel supporto DMEM / F-12 preparato.
Quindi, incubare le cellule a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Il quinto giorno, alimenta le cellule aggiungendo il 50% del volume originale di supporti DMEM/F-12. Il sesto giorno, stimolare le cellule aggiungendo GM-CSF preparato a una concentrazione finale di 50 nanogrammi per microlitro direttamente sul terreno di coltura cellulare.
Il settimo giorno, rimuovi tutti i supporti dalle celle. Quindi, lavare brevemente le cellule con PBS preriscaldato e aggiungere mezzi DMEM / F-12 contenenti il 2% di endotossina FBS bassa, 1X penicillina o streptomicina, L-glutammina, 25 nanogrammi per microlitro M-CSF e 50 nanogrammi per microlitro GM-CSF. Infine, incubare le cellule durante la notte nei mezzi per attivare i macrofagi al fenotipo M0.
Per il fenotipo M1, stimolare le cellule con 100 nanogrammi per microlitro LPS e 10 nanogrammi per microlitro IFN-gamma. Per il fenotipo M2, stimolare le cellule con 100 nanogrammi per microlitro IL-4. Incubare le cellule durante la notte.
L'ottavo giorno, le cellule sono pronte per la raccolta o la lavorazione a valle in base alle esigenze del ricercatore. I media integrati con il 10% di FBS avevano nitriti e tetraidrobiopterina simili, indipendentemente da M-CSF e GM-CSF o LCM. Ma i livelli totali di biopterina erano più alti nei mezzi integrati LCM.
Tuttavia, è stata osservata una maggiore variabilità tra i diversi lotti di LCM. La PCR ha mostrato un prodotto a coppia di basi 1030 in topi wild type, mentre i topi knockout GCH hanno prodotto un prodotto a coppia di basi 1392, confermando l'escissione degli esoni critici. Il trattamento con tamoxifene ha abolito la proteina GCH nelle cellule knockout.
Le cellule knockout e di controllo producevano ancora iNOS, dopo la stimolazione LPS e IFN. I BMDM coltivati da topi knockout GCH condizionali hanno mostrato una significativa diminuzione della tetraidrobiopterina e una diminuzione dei nitriti. Le stesse cellule coltivate in terreni LCM non avevano espressione di GCH1.
Tuttavia, le cellule producono quantità significative di tetraidrobiopterina e nitriti dopo knockout. L'ottavo giorno, non ci sono state differenze significative nella morfologia tra il controllo non attivato e i BMDM knockout GCH a diverse concentrazioni di Tamoxifene. I BMDM mostrano le caratteristiche che ci si aspetta dai macrofagi non stimolati, con cellule aderenti rotonde e estremità allungate.
Quando si lavora con cellule primarie come questa, è imperativo sterilizzare a fondo tutti i tessuti e le attrezzature. Inoltre, la scelta del giusto mezzo e integratore è importante per mantenere un ambiente basso di ossido nitrico e BH4. I pellet e i mezzi cellulari possono essere utilizzati per varie applicazioni a valle, con particolare attenzione al ruolo dell'ossido nitrico, della biopterina o dello stato redox cellulare.
Può includere HPLC, qPCR e Western blot, tra gli altri.
Panoramica
Questo protocollo descrive la coltivazione di macrofagi murini primari carenti di tetraidrobiopterina (BH4) e di ossido nitrico sintasi inducibile (iNOS). L'attenzione è rivolta a ridurre al minimo contaminazioni e artefatti nei metodi tradizionali di coltura, al fine di migliorare l'accuratezza sperimentale.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Biologia del redox
Sfondo
- I macrofagi derivati dal midollo osseo sono fondamentali per lo studio della biologia dell'ossido nitrico.
- I metodi tradizionali di isolamento possono introdurre contaminanti che influenzano i risultati.
- Una selezione accurata del mezzo di coltura è essenziale per mantenere bassi i livelli di BH4 e nitrato.
- Comprendere i meccanismi redox è fondamentale per ottenere risultati sperimentali accurati.
Scopo dello studio
- Sviluppare un protocollo affidabile per la coltura di macrofagi da topi geneticamente modificati.
- Ridurre le interferenze da ossido nitrico nei modelli sperimentali.
- Facilitare misurazioni accurate di biopterine e ossido nitrico.
Metodi Utilizzati
- Isolamento del midollo osseo da topi deficienti di iNOS o BH4.
- Utilizzo di mezzi definiti con bassi livelli di BH4 e nitrati.
- Coltura cellulare e stimolazione per ottenere fenotipi M0, M1 ed M2.
- Analisi dei livelli di biopterina e ossido nitrico mediante diversi saggi.
Risultati principali
- Condizioni di coltura controllate hanno prodotto modelli riproducibili di macrofagi.
- Sono state osservate differenze significative nei livelli di biopterina e nitrito tra cellule knockout e cellule di controllo.
- La morfologia cellulare è rimasta costante in diversi trattamenti.
- È stata ottenuta un'efficace attivazione dei macrofagi mediante stimolazione specifica con citochine.
Conclusioni
- Il protocollo fornisce un metodo robusto per lo studio della biologia redox dell'NO.
- Il mantenimento di livelli bassi di contaminanti è fondamentale per ottenere risultati accurati.
- Applicazioni future potrebbero includere diverse analisi a valle relative all'ossido nitrico e alla biopterina.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo protocollo consente un controllo preciso dell'ambiente redox del monossido di azoto in colture primarie di macrofagi, affrontando una sfida fondamentale nella ricerca sull'immunometabolismo e sulle malattie infiammatorie. Minimizzando componenti non definiti che interferiscono con le misurazioni di BH4 e di NO, esso supporta studi meccanicistici riproducibili, essenziali per la validazione degli obiettivi nei programmi di immuno-oncologia e di malattie autoimmuni. L'uso di modelli geneticamente definiti e di terreni definiti aumenta l'affidabilità predittiva nei flussi di lavoro della fase iniziale della scoperta.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi dei percorsi di segnalazione redox mediati dal NO nei macrofagi, utilizzando modelli privi di BH4 e di iNOS, per ridurre i rischi associati alle ipotesi terapeutiche.
- Valore operativo: Riduce la variabilità sperimentale derivante da sieri non definiti e da mezzi condizionati, migliorando la riproducibilità del saggio tra diversi laboratori.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Fornisce un modello standardizzato di macrofagi per lo screening di composti che modulano la produzione di ossido nitrico o il metabolismo dei biopterini.
- Valore operativo: Consente letture quantitative come i livelli di nitrito e biopterina mediante HPLC, permettendo analisi di risposta dose-dipendente nello screening di composti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Facilita lo studio dei meccanismi immunometabolici in sistemi pertinenti alle malattie, collegando la funzione immunitaria innata alla biologia redox.
- Valore operativo: Permette una validazione coerente del fenotipo (M0, M1, M2) mediante stimolazione con citochine definite, sostenendo la riproducibilità nei modelli preclinici.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nei flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta fornendo una fonte affidabile di macrofagi primari per l'analisi dell'interazione con il bersaglio e delle vie metaboliche prima dell'identificazione del composto leader.
- Biologia della scoperta: Supporta la riduzione del rischio meccanicistica dei percorsi dipendenti dal NO nell'infiammazione mediata dai macrofagi e nella regolazione immunitaria.
- Screening: Fornisce un sistema cellulare riproducibile per valutare gli effetti dei composti sui livelli di ossido nitrico e dei cofattori redox.
- Analisi: Permette una quantificazione accurata di biopterina e nitrito, biomarcatori chiave per valutare la modulazione del bersaglio in percorsi sensibili allo stato redox.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati ottenuti in vitro alla continuità preclinica attraverso un'attivazione dei macrofagi e una caratterizzazione del fenotipo costanti.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per lo studio dell'immunometabolismo e dei meccanismi redox in diverse aree terapeutiche.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva riducendo l'ambiguità meccanicistica nella segnalazione del monossido di azoto e delle biopterine.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione e la scalabilità grazie a modelli genetici e mezzi definiti, minimizzando la variabilità tra un lotto e l'altro.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione fornendo dati affidabili sulla modulazione del percorso bersaglio in cellule fisiologicamente rilevanti.
- Impatto sul portafoglio: Consente la priorizzazione dei composti mirati ai percorsi immunometabolici e infiammatori in base alla gestione del rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'isolamento di cellule primarie, nella manipolazione asettica dei tessuti e nelle tecniche di coltura dei macrofagi.
- Presuppone l'accesso a modelli murini geneticamente modificati (ad esempio, privi di GCH) e a strumentazione per il lavaggio del midollo osseo e la filtrazione cellulare.
- Necessita di una preparazione standardizzata dei mezzi di coltura con livelli bassi di BH4 e nitrati per mantenere il controllo sperimentale.
- Comporta considerazioni di adattamento qualora il protocollo venga esteso ad altre fonti di macrofagi o a diverse condizioni di stimolazione.
- Comprende limitazioni pratiche, come la necessità di reagenti privi di endotossine e una titolazione accurata delle citochine per evitare un'eccessiva attivazione.
Domande frequenti sul biopharma
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:53
Isolation of Bone Marrow Cells
2:14
Selection, Differentiation, and Stimulation of BMDMs
4:24
Results: Comparison of Nitrite and Tetrahydrobiopterin Levels in Media Supplemented with LCM or Recombinant GM-CSF and M-CSF
5:54
Conclusion
