Name: Saggi basati sulla chemiluminescenza per la rilevazione di ossido nitrico e suoi derivati da autoxidazione e composti nitrosi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Scopri i saggi basati sulla chemiluminescenza per rilevare l'ossido nitrico e i suoi metaboliti nei campioni biologici. Questo metodo sensibile consente di misurare variazioni minime senza personale dedicato sul posto.

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I protocolli riportati in questo manoscritto sono stati resi possibili dai contributi accumulati di precedenti borsisti del laboratorio di ricerca sull'anestesia in terapia intensiva del Dr. Warren Zapol, Dipartimento di Anestesia presso il Massachusetts General Hospital. Riconosciamo il contributo dei dottori Akito Nakagawa, Francesco Zadek, Emanuele Vassena, Chong Lei, Yasuko Nagasaka, Ester Spagnolli ed Emanuele Rezoagli.

L.B. riceve supporto salariale da K23 HL128882 / NHLBI NIH come ricercatore principale per il suo lavoro sull'emolisi e l'ossido nitrico. LB riceve sovvenzioni da "Fast Grants for COVID-19 research" presso il Mercatus Center della George Mason University e da iNO Therapeutics LLC. B.Y. è supportato da sovvenzioni di un NHLBI/#R21HL130956 e DOD/The Geneva Foundation (W81XWH-19-S-CCC1, Log DM190244). B.Y. ha ricevuto brevetti presso MGH sulla generazione elettrica di ossido nitrico.
L.B. e B.Y. hanno depositato la domanda di brevetto per NO delivery nel numero di domanda PCT della malattia COVID-19: PCT / US2021 / 036269 depositato il 7 giugno 2021. RWC riceve sostegno salariale da Unitaid come ricercatore principale per lo sviluppo tecnologico finalizzato alla diagnosi decentralizzata della tubercolosi nei bambini situati in contesti a basso consumo di risorse.

A causa dell'elevata sensibilità, i saggi basati sulla chemiluminescenza per la determinazione dell'NO e dei composti correlati hanno un alto rischio di contaminazione da NO2-. Ogni reagente (in particolare la soluzione che blocca l'NO2) e il diluente (incluso il ddH2O) utilizzati nell'esperimento devono essere testati per il suo contenuto di NO2- per correggere il segnale di fondo. Il nitrito è estremamente reattivo con un'emivita nel sangue in...

<table><tbody><tr><td>Acido acetico</td><td>Sigma</td><td>45754</td><td>500 mL - liquido</td></tr><tr><td>Emulsione antischiuma B</td><td>Sigma</td><td>A5757</td><td>250 mL - liquido</td></tr><tr><td>DETA NONOate</td><td>Cayman</td><td>82120</td><td>10 mg</td></tr><tr><td>Gibco DPBS (1x) senza calcio, senza magnesio</td><td>ThermoFisher</td><td>14190144</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Acido cloridrico 37% (1 M)</td><td>Sigma</td><td>258148</td><td>500 mL - liquido</td></tr><tr><td>Iodio</td><td>SAFC</td><td>207772</td><td>100 g - solido</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimtech</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Mercurio (II) Cloruro ACS reagente> 99,5%</td><td>Sigma</td><td>215465</td><td>100 g - solido (sciogliere in acqua)</td></tr><tr><td>Sistema di purificazione dell'acqua Mili-Q</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Modello 705 RN 50 &mu; Siringa L</td><td>Hamilton</td><td>80530</td><td>Siringa da microlitro</td></tr><tr><td>Modello 802 N 25 &mu; L Siringa</td><td>Hamilton</td><td>84854</td><td>Siringa da microlitro</td></tr><tr><td>N-etilmaleimmide</td><td>Sigma</td><td>4260</td><td>25 g -</td></tr><tr><td>Analizzatore di ossido nitrico cristallino + Bundle Software - Recipiente di spurgo</td><td>Zysense</td><td>NOA 280i</td><td>Rivelatore di chemiluminescenza</td></tr><tr><td>Nonidet p-40&nbsp; (NP-40)</td><td>ThermoFisher</td><td>85125</td><td>10% - 500 mL</td></tr><tr><td>Reagente ACS esacianoferrato di potassio (III)&ge; 99%</td><td>Sigma</td><td>244023</td><td>100 g - polvere</td></tr><tr><td>Reagente ACS ioduro di potassio> 99%</td><td>Sigma</td><td>221945</td><td>100 g -</td></tr><tr><td>solido Nitrito di potassio. Per analisi EMSURE ACS</td><td>Supelco</td><td>105067</td><td>250 g - cristallino</td></tr><tr><td>PowerGen 125</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-359-251</td><td>Omogeneizzatore meccanico</td></tr><tr><td>RV3 Pompa rotativa a palette a due stadi</td><td>Edwards</td><td>A65201906</td><td>Pompa per vuoto - In bundle con l'analizzatore</td></tr><tr><td>Eparina di sodio - BD Hemogard Clo</td><td>BD Biosciences</td><td>BD367871</td><td>75 unità USP</td></tr><tr><td>Idrossido di sodio anidro Reagente ACS &ge; 97%</td><td>Sigma</td><td>795429</td><td>1 kg - pellett</td></tr><tr><td>Nitrato di sodio ACS reagente &ge; 99%</td><td>Sigma</td><td>221341</td><td>500 g - polvere</td></tr><tr><td>Nitrito di sodio &ge; 99%</td><td>Sigma</td><td>S2252</td><td>500 g -</td></tr><tr><td>Sulfanilamide cristallina &ge; 98%</td><td>Sigma</td><td>S9251</td><td>100 g - solido</td></tr><tr><td>Cloruro di Vanadio (III)</td><td>Sigma</td><td>112393</td><td>25 g - solido - Attenzione (esotermico)</td></tr><tr><td>Whatman 1 Carta da filtro</td><td>Sigma</td><td>WHA10010155</td><td></td></tr></tbody></table>

saggi basati sulla chemiluminescenza per la rilevazione di ossido nitrico e suoi derivati da autoxidazione e composti nitrosi

Chemiluminescence-based Assays for Detection of Nitric Oxide and its Derivatives from Autoxidation and Nitrosated Compounds

L'attività dell'ossido nitrico (NO) in vivo è il risultato combinato dei suoi effetti diretti, dell'azione dei suoi derivati generati dall'autossidazione dell'NO e degli effetti dei composti nitrosi. La misurazione dei metaboliti no è essenziale per studiare l'attività dell'NO sia a livello vascolare che in altri tessuti, specialmente nei contesti sperimentali in cui viene somministrato NO esogeno. I saggi di chemiluminescenza a base di ozono consentono misurazioni precise dei metaboliti NO e NO sia nei fluidi (inclusi plasma, omogeneizzati tissutali, colture cellulari) che nelle miscele di gas (ad esempio, respiro espirato). L'NO reagisce con l'ozono per generare biossido di azoto allo stato eccitato. La conseguente emissione luminosa permette il fotorilevamento e la generazione di un segnale elettrico che riflette il contenuto di NO del campione. Le aliquote dello stesso campione possono essere utilizzate per misurare specifici metaboliti NO, come nitrati, nitriti, S-nitrosotioli e complessi ferro-nitrosilici. Inoltre, l'NO consumato dall'emoglobina priva di cellule viene anche quantificato con l'analisi di chemiluminescenza. Viene fornita un'illustrazione di tutte queste tecniche.

Il consumo di NO mediante il saggio hb senza cellule è stato utilizzato in campioni contenenti concentrazioni note di ossiHb privo di cellule (Figura 4). Poiché un eme di oxyHb rilascia stechiometricamente una molecola NO nel test, l'oxyHb privo di cellule purificate viene utilizzato per costruire la curva di calibrazione per il test (Figura supplementare 3).
La relazione dose-risposta tra Hb senza cellule (misurata con un test colorimetrico) e co...

Qui presentiamo protocolli per rilevare l'ossido nitrico e i suoi derivati biologicamente rilevanti utilizzando saggi basati sulla chemiluminescenza ad alta sensibilità.

Saggi basati sulla chemiluminescenza per la rilevazione di ossido nitrico e suoi derivati da autoxidazione e composti nitrosi

Nitric oxide (NO) activity in vivo is the combined results of its direct effects, the action of its derivatives generated from NO autoxidation, and the ...

Questo protocollo consente ai ricercatori di utilizzare con competenza un rilevatore di chemiluminescenza per la misurazione dei metaboliti dell'ossido nitrico senza la guida o la spesa di impiegare personale dedicato in loco. Il test basato sulla chemiluminescenza è il metodo più sensibile per rilevare cambiamenti minimi nei livelli di ossido nitrico e dei suoi metaboliti in un dato campione biologico. L'ossido nitrico inalato è un gas terapeutico utilizzato per un'ampia varietà di malattie.È fondamentale che la progressione e il recupero della malattia siano accuratamente correlati con i livelli di metaboliti dell'ossido nitrico. L'ossido nitrico inalato, un antimicrobico, è promettente nel trattamento di pazienti con malattie infettive delle vie aeree. Il metodo della chemiluminescenza fornisce informazioni sulla correlazione della dose di ossido nitrico e dei suoi metaboliti con i cambiamenti microbiologici e fisiopatologici.Per preparare la soluzione deTA-NONOato, aggiungere 10 milligrammi di DETA-NONOato a 610 microlitri di idrossido di sodio 10 millimolare in PBS di pH 7,4 per generare 100 millimolari di DETA-NONOato e mantenerlo sul ghiaccio. Per procedere, collegare la linea di ossigeno al rilevatore di chemiluminescenza e aprire il serbatoio di ossigeno a una pressione secondo le istruzioni del produttore fornite nel testo. Quindi, collegare la linea del filtro dielettrico a campo intenso al rilevatore di chemiluminescenza.Sull'interfaccia del rilevatore di chemiluminescenza, avviare il programma di rilevamento per i saggi in fase liquida, assicurandosi che l'apporto di ossigeno sia adeguato e il rilevatore inizierà il campionamento, indicando il rilevamento tramite segnale in millivolt, altrimenti richiedere un segnale diagnostico negativo. Per preparare il recipiente di spurgo, chiudere il recipiente di spurgo su tutte e tre le porte avvitando completamente la valvola a spillo a destra e chiudendo i rubinetti di arresto in ingresso e in uscita. Rimuovere il cappuccio dal recipiente di spurgo.Aggiungere una quantità sufficiente del reagente specifico per il test pianificato alla camera di reazione in modo che l'ago della siringa utilizzato per iniettare i campioni possa raggiungere la colonna di fluido verificando la presenza di una linea di base stabile e desiderata. Per avviare il flusso di gas di spurgo, assicurarsi che il serbatoio del gas inerte sia dotato di un regolatore a due stadi e collegare il serbatoio del gas inerte con l'ingresso del gas della nave. Quindi, aprire l'uscita del recipiente di spurgo e aprire il gas con una pressione di uscita al regolatore da uno a cinque libbre per pollice quadrato.Quindi, aprire l'ingresso del recipiente di spurgo e aprire lentamente la valvola a spillo del recipiente di spurgo per consentire l'afflusso di gas e verificare il gorgogliamento all'interno del recipiente di spurgo. Per regolare il flusso di gas, registrare la pressione della cella misurata dal rivelatore di chemiluminescenza con la linea di filtro dielettrico a campo intenso che campiona l'aria ambiente. Riposizionare il cappuccio sul recipiente di spurgo e collegare la linea del filtro dielettrico a campo intenso al recipiente di spurgo.Utilizzare la valvola a spillo per raggiungere la stessa pressione cellulare al livello del rilevatore di chemiluminescenza registrato nell'aria ambiente. Per avviare il programma di acquisizione del segnale di chemiluminescenza, collegare la porta seriale del rilevatore di chemiluminescenza alla porta seriale del computer in cui è stato installato il programma di acquisizione. Quindi, eseguire il programma di analisi.Fare clic su Acquisisci, quindi selezionare la cartella in cui salvare il file di dati, digitare il nome del file e fare clic su Salva. Durante la preparazione per l'iniezione del campione, regolare la scala di tensione sullo schermo per avere il controllo sulla linea di base di destinazione facendo clic sui pulsanti minimo e / o massimo e quindi inserendo il valore desiderato. Per eseguire l'iniezione del campione, sciacquare la siringa almeno due o più volte con acqua deionizzata e distillata prima di prelevare ciascun campione e assicurarsi un'espulsione d'acqua senza ostacoli su una salvietta da attività.Quindi, inserire la siringa nella provetta del campione tenendo sia la siringa che il tubo a una distanza ravvicinata e tirare su lo stantuffo al volume desiderato assicurandosi che nessuna bolla d'aria o parti solide non omogeneizzate siano intrappolate. Pulire la punta della siringa con un tergicristallo e inserire la siringa nel cappuccio del setter alla porta di iniezione. Dopo aver verificato che la punta della siringa rientri nella fase liquida, iniettare il campione nella camera di reazione.Per contrassegnare l'iniezione nel programma software, digitare il nome del campione facendo clic sulla casella grigia sotto Nomi campione, quindi fare clic su Mark Injection mentre si verifica che l'iniezione causi un cambiamento verso l'alto nel segnale o verso il basso nel consumo di ossido nitrico mediante test di emoglobina senza cellule. La relazione dose-risposta tra emoglobina priva di cellule e consumo di ossido nitrico è stata misurata attraverso la chemiluminescenza dopo bypass cardiopolmonare. Si può presumere che vi sia un'alta concentrazione di gruppi eme nello stato ossidato scavenging ossido nitrico.Nei pazienti che ricevono ossido nitrico durante il bypass cardiopolmonare, invece, la maggior parte dei gruppi eme è ridotta e non consuma ossido nitrico. Le misurazioni della concentrazione di emoglobina libera da cellule hanno indicato una lenta eliminazione dal plasma entro 12 ore dal bypass cardiopolmonare. Tuttavia, il consumo di ossido nitrico ha raggiunto il picco a 15 minuti e non riflette l'eliminazione dell'emoglobina priva di cellule.Le curve di regressione lineare del consumo di ossido nitrico da parte dell'emoglobina senza cellule hanno mostrato una prevalenza di emoglobina ossidata e che consuma ossido nitrico a 15 minuti, rispetto all'emoglobina più ridotta al basale 4 ore e 12 ore dopo il bypass cardiopolmonare. Sono stati monitorati gli effetti della somministrazione di gas di ossido nitrico sul consumo di ossido nitrico. Quando i pazienti sono stati trattati con ossido nitrico gassoso intra e post-operatorio, l'aumento osservato di emoglobina libera dopo il bypass cardiopolmonare non è stato associato ad alcun aumento del consumo di ossido nitrico.I risultati hanno indicato che l'ossido nitrico somministrato esogenamente riduceva la maggior parte dell'emoglobina libera e impediva lo scavenging dell'ossido nitrico. L'esperimento è valido solo se tutte le condizioni rimangono le stesse. Se l'altezza del livello del liquido supera la colonna di reazione, dobbiamo fermarci e condurre una nuova calibrazione.

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Qui vi proponiamo semplici metodi per testare e valutare la presenza di specie reattive dell'ossigeno nelle cellule.

Produzione e di rilevamento di specie reattive dell&#39;ossigeno (ROS) in Cancro

La produzione endogena di ossido nitrico (NO) regola una varietà di funzioni biologiche. Sta diventando sempre più chiaro che l'alterazione o disregolazione di NO segnalazione based è coinvolta in molte malattie umane. Metodi per quantificare relativo numero metaboliti possono fornire nuovi biomarcatori diagnostici o prognostici per le malattie umane.

Tecniche analitiche per il saggio Bioattività Ossido Nitrico

NADPH ossidasi è la principale fonte di specie reattive dell'ossigeno (ROS) in fagociti. A causa della natura effimera dei ROS, è difficile misurare e monitorare i livelli di ROS negli animali viventi. Un metodo minimamente invasivo per la quantificazione seriale di ROS in topi viventi è descritto.

Imaging bioluminescenza di attività NADPH ossidasi in diversi modelli animali

In questo articolo descriviamo un metodo relativamente semplice adattato utilizzando il colorante fluorescente diaminofluorescein-2 diacetato (DAF-2DA) e dihydroethidium (DHE) per en face rilevazione simultanea e la visualizzazione di ossido nitrico intracellulare (NO) e di anione superossido (O 2 .- ), rispettivamente, in appena isolato aortas intatte di un modello di obesità del mouse.

En Face Detection di ossido nitrico e superossido in strato endoteliale delle arterie Intact

Questo protocollo descrive una nuova tecnica di imaging intraoperatorio che utilizza un complesso di rutenio come fonte di emissione di luce chemiluminescente, producendo così alti rapporti segnale-rumore durante l'imaging in vivo. L'imaging intraoperatorio è un campo in espansione che potrebbe rivoluzionare il modo in cui vengono eseguite le procedure chirurgiche.

Una tecnica innovativa per la generazione e Observing Chemiluminescenza in un ambiente biologico

L'ossido nitrico (NO) è un'importante molecola di segnalazione nell'omeostasi vascolare. La produzione di NO in vivo è troppo bassa per la misurazione diretta. La chemiluminescenza fornisce informazioni utili sul ciclo dell'NO attraverso la misurazione dei suoi precursori e prodotti di ossidazione, nitriti e nitrati. Viene spiegata la determinazione di nitriti/nitrati nei tessuti e nei fluidi corporei.

Misurazione nitriti e nitrati, metaboliti in ossido nitrico Pathway, nei materiali biologici utilizzando il metodo chemiluminescenza

Questo manoscritto presenta protocolli per l'applicazione di nuove sonde di ossido nitrico (NO•) geneticamente codificate (geNOps) per monitorare le fluttuazioni di NO• di singole cellule in tempo reale utilizzando la microscopia a fluorescenza. La formazione di NO• innescata dal Ca2+ a livello delle singole cellule endoteliali è stata visualizzata combinando geNOps con un sensore chimico di Ca2+.

L&#39;applicazione di geneticamente codificato fluorescente ossido nitrico (NO •) sonde, i geNOps, in tempo reale Imaging di NO • I segnali in singole cellule

Presentiamo protocolli per tre diversi metodi per l'omogeneizzazione di quattro diversi gruppi muscolari di tessuto muscolare scheletrico di ratto per misurare e confrontare i livelli di nitrati e nitriti. Inoltre, confrontiamo diversi pesi del campione per indagare se la dimensione del campione di tessuto influisce sui risultati dell'omogeneizzazione.

Preparazione di omogenati muscolari scheletrici di ratto per misurazioni di nitrati e nitriti

Catturare i cambiamenti dinamici nell'attivazione proteica dei globuli rossi enucleati pone sfide metodologiche, come la conservazione dei cambiamenti dinamici agli stimoli acuti per una valutazione successiva. Il protocollo presentato descrive la preparazione del campione e le tecniche di colorazione che consentono la conservazione e l'analisi dei cambiamenti proteici rilevanti e la successiva rilevazione.

Rilevazione basata sull'immunocolorazione di alterazioni dinamiche nelle proteine dei globuli rossi

Questo protocollo descrive un metodo per quantificare la produzione di ossido nitrico (NO) nelle colture epiteliali delle vie aeree differenziate all'interfaccia aria-liquido (ALI) misurando il nitrito nelle secrezioni apicali tramite un saggio di chemiluminescenza a base di triioduro.

Misurazione della produzione di ossido nitrico nelle colture cellulari epiteliali tracheali del topo differenziate all'interfaccia aria-liquido

Scopri i saggi basati sulla chemiluminescenza per rilevare l'ossido nitrico e i suoi metaboliti nei campioni biologici. Questo metodo sensibile consente di misurare variazioni minime senza personale dedicato sul posto.

Saggi basati sulla chemiluminescenza per la rilevazione di ossido nitrico e suoi derivati da autoxidazione e composti nitrosi

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