Tessuti polmonari ingegnerizzati preparati da fette di polmone decellularizzate

Questo protocollo consente l'uso ripetibile di matrice extracellulare polmonare intatta come substrato di coltura tissutale tridimensionale e una produttività moderata. Il vantaggio principale del sistema di tessuto polmonare ingegnerizzato è la flessibilità della piattaforma. Gli ELT possono essere adattati per utilizzare vari scaffold tissutali, cellule o terreni di coltura di interesse.

Una volta estratti i polmoni, riempire una siringa da 10 millilitri con agarosio e HBSS senza rosso fenolo. Gonfiare i polmoni con circa 10 millilitri di aria attraverso la cannula della trachea, quindi iniettare immediatamente l'agarosio preparato attraverso la cannula della trachea fino a quando le punte più distali dei lobi polmonari sono gonfiate. Tappare la trachea attaccando il cappuccio bianco da un rubinetto a quattro vie al luer lock femminile della cannula tracheale.

Posizionare il polmone in una capsula di Petri da 150 millimetri su ghiaccio per consentire all'agarosio di solidificarsi. Preparare le fette di polmone secondo il protocollo nel manoscritto, quindi riempire una capsula di Petri da 100 millimetri con 1/3 di volume di PBS. Trasferire cassette e linguette sul piatto usando una pinza.

Se le fette sono congelate, scongelare un piatto alla volta versando su PBS a temperatura ambiente. Quindi, trasferire una fetta scongelata in una capsula di Petri da 150 millimetri. Aprire delicatamente la fetta usando una pinza fine o un emostato e aspirare accuratamente l'eccesso di PBS da tutto il tessuto.

Quindi, tagliare una striscia larga tre millimetri, lunga almeno nove millimetri, dalla fetta premendo saldamente l'intera lunghezza di una lama di rasoio contro il piatto e dondolandola leggermente da un lato all'altro. Per agganciare la striscia di tessuto nella cassetta, farla galleggiare sopra la cassetta, centrandola con attenzione per estendersi oltre i fori nelle clip alle due estremità. Posizionare una linguetta parzialmente nel foro a un'estremità con una pinza fine, raddrizzare delicatamente il tessuto e impostare la seconda linguetta.

Infine, utilizzare una pinza per premere completamente ogni linguetta per fissare il tessuto. Dopo aver tagliato tutti i lati, trasferire la parabola da 100 millimetri contenente le cassette su una cappa a flusso laminare. Trasferire le cassette in piastre a sei pozzetti contenenti la prima soluzione di decellularizzazione utilizzando un emostato curvo per afferrare i lati dentellati.

Quindi, posizionare la piastra a sei pozzetti su uno shaker orbitale a 30 RPM per 10 minuti. Aspirare il fluido da ciascun pozzetto, quindi sostituirlo con tre millilitri della seconda soluzione di decellularizzazione per pozzetto. Posizionare la piastra su uno shaker orbitale a 30 RPM e incubare per cinque minuti.

Ripeti questo processo con ogni soluzione come indicato nel protocollo di decellularizzazione nel manoscritto. Dopo il risciacquo finale con PBS, trasferire i tessuti in piastre sterili a sei pozzetti contenenti PBS fresco con antibiotici e antimicotici e incubare a 37 gradi Celsius per 48 ore. Dopo la sterilizzazione con antibiotici e antimicotici, gli scaffold del tessuto polmonare possono essere seminati immediatamente o conservati a quattro gradi Celsius per un massimo di 30 giorni.

Prima di utilizzarlo per la coltura, incubare gli scaffold conservati a quattro gradi Celsius con PBS fresco e antibiotici e antimicotici durante la notte a 37 gradi Celsius come ulteriore fase di sterilizzazione. Quindi, sciacquare le impalcature con PBS sterile, cinque millilitri per pozzetto, tre volte, per cinque minuti ciascuna. Esaminare le impalcature al microscopio a contrasto di fase con ingrandimento 5X per selezionare i tessuti da seminare.

Preparare la sospensione cellulare endoteliale in mezzo endoteliale a 5 milioni di cellule per millilitro con cellule sufficienti per seminare 500.000 cellule endoteliali per fetta. Posizionare i bagni di semina autoclavati in piastre di Petri da 100 millimetri e trasferire con cura gli scaffold di risciacquo a testa in giù nei bagni di semina. Ruotare delicatamente la sospensione cellulare preparata per mescolare.

Quindi, pipettare con cura 100 microlitri di cellule direttamente sopra ogni tessuto alla base dei pozzetti, facendo attenzione a non danneggiare il tessuto con la punta della pipetta. Trasferire i tessuti seminati nell'incubatore di colture cellulari. 24 ore dopo la semina delle cellule endoteliali, aggiungere 900 microlitri di terreno di coltura preriscaldato a ciascun pozzetto usando una pipetta manuale, quindi restituire la piastra all'incubatore.

Dopo 24 ore di semina cellulare, rimuovere il mezzo e sostituire il millilitro di mezzo endoteliale fresco per pozzetto. 72 ore dopo la semina delle cellule endoteliali, contare le cellule AEC2 o le cellule epiteliali alveolari di tipo II e i fibroblasti usando un emocitometro e preparare una sospensione cellulare 1: 1 nel mezzo di crescita AEC2 a 5 milioni di cellule per millilitro. Pipettare bene il mezzo da ogni bagno di semina e ruotare delicatamente la sospensione cellulare preparata.

Pipetta 100 microlitri di cellule direttamente sopra ogni tessuto alla base del pozzo. Trasferire i tessuti seminati nell'incubatore di colture cellulari. Dopo due ore, aggiungere 900 microlitri di terreno di crescita AEC2 preriscaldato a ciascun pozzetto, quindi restituire la piastra all'incubatore.

Dopo 24 ore di coltura con AEC2 e fibroblasti, preparare una piastra a 12 pozzetti con un millilitro di terreno di crescita AEC2 preriscaldato per pozzetto, per cassetta. Pipettare 800 microlitri di mezzo da ciascun pozzetto del bagno di semina, quindi rimuovere le cassette dal bagno di semina e trasferirle sul lato destro fino alla piastra a 12 pozzetti preparata, una cassetta per pozzetto. Cambia il terreno di coltura con attenzione usando una pipetta Pasteur di vetro a giorni alterni per la durata della coltura desiderata.

Monitorare il grado di ripopolamento dei tessuti tramite microscopia a contrasto di fase con ingrandimento 5X per tutta la durata della coltura. La colorazione H ed E degli scaffold tissutali ha mostrato un'architettura alveolare preservata dopo la decellularizzazione senza nuclei cellulari visibili. Il tessuto alveolare è stato osservato quando gli scaffold della matrice extracellulare decellularizzata sono stati visualizzati con ingrandimento 5X mediante microscopia a contrasto di fase.

Grandi vie aeree ramificate e vasi erano visibili anche in alcune fette. Il settimo giorno di coltura, la microscopia a contrasto di fase ha mostrato che il modello di ricellularizzazione nei tessuti polmonari ingegnerizzati emulava la struttura alveolare dei tessuti in caso di ripopolamento riuscito. Anche la scarsa ricellularizzazione era visibile.

La colorazione H ed E al settimo o ottavo giorno ha mostrato il ripopolamento dei setti alveolari. L'immunofluorescenza in piedi ha rivelato fibroblasti pro-collagene di tipo I alfa 1-positivi, ABCA3-positivi AEC2, cellule endoteliali CD31-positive, e abbondanti AEC2 SPB-positivi. Inoltre, il test della timidina ha mostrato molti AEC2 proliferanti.

Questa tecnica ha facilitato lo sviluppo di strategie per l'ingegneria dei tessuti polmonari e ha permesso indagini sulle code che supportano la proliferazione e la differenziazione delle cellule di tipo II all'interno dell'alveolo.