Name: Tessuti polmonari ingegnerizzati preparati da fette di polmone decellularizzate (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-21T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Scopri come generare tessuti polmonari ingegnerizzati utilizzando fette di polmone decellularizzate ripopolate con cellule epiteliali alveolari di tipo 2, fibroblasti e cellule endoteliali. Questo metodo flessibile supporta la ricerca in ingegneria tissutale.

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Gli autori desiderano ringraziare Lorenzo Sewanan e Jorge Nunez per il loro lavoro di sviluppo del design della cassetta di coltura tissutale utilizzato in questo protocollo, il laboratorio Kaminski per l'uso del loro vibratoma, Maurizio Chioccioli e Jessica Nouws per l'assistenza con l'affettamento polmonare, Allie LaRocco per l'assistenza con gli esperimenti pilota iniziali e Hong Qian per l'attenta lettura del protocollo. Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni NIH F30HL143880 (K.L.L.), dal Medical Scientist Training Program Training Grant T32GM136651 (K.L.L.) e U01HL145567 (L.E.N.); e da un dono di ricerca senza restrizioni da Humacyte Inc. (L.E.N.).

L.E.N. è fondatore e azionista di Humacyte, Inc, che è una società di medicina rigenerativa. Humacyte produce vasi sanguigni ingegnerizzati da cellule muscolari lisce allogeniche per la chirurgia vascolare. Il coniuge di L.E.N. ha equità in Humacyte e L.E.N. fa parte del Consiglio di amministrazione di Humacyte. L.E.N. è un inventore di brevetti concessi in licenza a Humacyte e che producono royalties per L.E.N. L.E.N. ha ricevuto un dono di ricerca illimitato per sostenere la ricerca nel suo laboratorio a Yale. Humacyte non ha influenzato la condotta, la descrizione o l'interpretazione dei risultati di questo rapporto.

Questo documento descrive l'uso di fette polmonari decellularizzate tagliate con precisione come piattaforma per generare tessuti polmonari ingegnerizzati in vitro, che contengono strutture alveolari multi-lineage. Combinando le strategie che abbiamo precedentemente sviluppato per ripopolare gli scaffold polmonari ECM acellulari ad alta fedeltà per l'ingegneria polmonare intera22,31, con il nostro robusto sistema per la coltura di tessuti cardiaci ingegnerizzati su piccola scala30, questo protocollo consente l'uso di ECM polmonare fisiologicamente rilevante come substrato di coltura tissutale, in modo ripetibile e moderatamente produttivo.
I metodi qui presentati descrivono in dettaglio la preparazione dell'impalcatura del PFU dai polmoni di ratto, che sono facilmente raggiungibili, possono essere estratti in blocco con accesso diretto alle vie aeree intatte per il gonfiaggio dell'agarosio e sono di dimensioni maggiori rispetto al polmone di topo. Tuttavia, qualsiasi tessuto polmonare che può essere gonfiato con agarosio e produrre fette di almeno 9 mm di lunghezza può essere utilizzato all'interno di questo sistema. Indipendentemente dalla fonte tissutale, l'inflazione uniforme del tessuto polmonare con agarosio è il passo più critico per garantire il successo dell'affettamento, del taglio e della manipolazione dei tessuti a valle. Il tessuto polmonare sottogonfiato tende a non affettare in modo pulito, mentre il tessuto sovragonfiato può lacerarsi durante il clipping. Dopo la gelificazione dell'agarosio, le regioni tissutali opportunamente gonfiate sono sode ma forniscono un po 'di dare quando vengono premute delicatamente con una pinza. Per i polmoni di ratto intatti, abbiamo scoperto che il pre-gonfiaggio dei polmoni estratti con l'aria più volte, seguito dal gonfiaggio dell'agarosio il prima possibile dopo l'estrazione, si traduce nei migliori risultati di affettamento e nella migliore qualità delle impalcature tissutali risultanti. Il volume appropriato di agarosio deve essere ottimizzato empiricamente; per un polmone di ratto il volume necessario per gonfiare il polmone alla capacità polmonare totale è di circa 30 ml/kg di massa animale (ad esempio, 10,5 mL di agarosio per i polmoni di un ratto da 350 g). Per i tessuti polmonari resecati più grandi con accesso alle vie aeree meno diretto (come quelli provenienti da donatori umani), potrebbe essere necessaria una risoluzione dei problemi aggiuntiva per gonfiare il tessuto attraverso un bronco32. Durante il successivo taglio polmonare, la selezione e l'orientamento del tessuto sullo stantuffo è un altro passo importante per 1) garantire che le fette siano abbastanza grandi da generare strisce di tessuto che possono essere ritagliate in cassette di coltura tissutale e 2) massimizzare l'area del tessuto parenchimale (alveolare), escluse le grandi vie aeree o vasi.
Il clip del PCLS in cassette di coltura tissutale può essere inizialmente un passo impegnativo, ma le cassette semplificano notevolmente la gestione dei tessuti durante la decellularizzazione e la semina. Due potenziali problemi che possono sorgere sono la lacerazione dei tessuti (durante il processo di ritaglio o durante la decellularizzazione) o il posizionamento dei tessuti nelle clip che si traduce in una scarsa semina a valle (ad esempio, nessuna semina o semina solo alle estremità). Lo strappo può essere il risultato di un'eccessiva inflazione di agarosio, di un eccessivo allungamento del tessuto durante l'inserimento della linguetta o di lasciare troppo poca sporgenza per fornire un'adeguata presa del tessuto durante l'inserimento delle linguette. Si noti che le fette che si strappano a un'estremità della clip possono essere seminate con successo, tuttavia, sono difficili da visualizzare al microscopio durante la coltura poiché il tessuto non è piatto. Una scarsa semina dei tessuti (come quella nella Figura 6C) è probabilmente il risultato della fetta che non giace piatta tra le due clip, e quindi fa scarso contatto con la base del bagno di semina bene quando capovolta. Un'altra possibile causa è la posizione impropria della cassetta sul fondo del pozzo del bagno di semina. In termini di clipping, applicare un po 'più di tensione nel tessuto quando si posiziona la seconda clip per aiutarla a rimanere piatta. Alcune fette hanno una leggera concavità; in questi casi agganciare la fetta con il lato convesso verso l'alto. Con la pratica, in genere sperimentiamo la semina fallita con meno del 2% delle fette.
Una limitazione di questo protocollo è il requisito per alcune attrezzature specializzate - una taglierina laser e una stampante 3D - per generare i materiali iniziali per la preparazione del PFU. Tuttavia, una volta create le cassette di coltura dei tessuti e i bagni di semina, non sono necessari materiali speciali aggiuntivi. Le fasi di affettamento polmonare e decellularizzazione della preparazione dell'impalcatura del PFU sono moderatamente dispendiose in termini di tempo; tuttavia, questi passaggi possono essere eseguiti in anticipo o in numero sufficiente per prepararsi a più esperimenti contemporaneamente. Molti PCLS (>100 se ottimizzati per le regioni parenchimali) possono essere tagliati da un singolo polmone e congelati a scatto per un uso successivo. Mentre un singolo ciclo di congelamento-disgelo può causare danni ultrastrutturali minori all'ECM46, anche più cicli di congelamento-disgelo hanno dimostrato di non causare una perdita significativa in ECM 23,47. PCLS può anche essere tagliato e decellularizzato prima di un esperimento, da utilizzare entro un mese. (In particolare, il protocollo di decellularizzazione descritto può essere realizzato in circa 6 ore, il che rappresenta un vantaggio significativo rispetto ai metodi precedentemente descritti che richiedono un giorno o più27,28.) Una volta preparate le impalcature, il processo di semina cellulare è semplice e veloce e la coltura dei PFU non richiede tecniche specializzate.
Un avvertimento del metodo ELT descritto è la mancanza di semina specifica per regione, cioè la consegna di AEC2 specificamente allo spazio alveolare, o cellule endoteliali specificamente allo spazio vascolare. Tuttavia, sebbene le cellule siano semplicemente seminate sopra le impalcature tissutali, il modello di ricellularizzazione non è casuale, con una parvenza di organizzazione alveolare, compresi gli anelli epiteliali. Sospettiamo che le interazioni cellula-cellula, così come le differenze locali nella composizione e nella geometria dell'ECM20,21, contribuiscano probabilmente ai modelli di ricellularizzazione osservati. A sostegno di questa ipotesi, uno studio precedentemente pubblicato, in cui i fibroblasti sono stati seminati non specificamente su fette polmonari decellularizzate, ha dimostrato che il modello di ripopolamento dei tessuti e i fenotipi cellulari associati variavano significativamente in base alla regione tissutale microscopica e alla fonte di scaffold ECM (ad esempio, sano contro malato)27. I fibroblasti sono stati anche osservati invadere l'interstizio - la posizione in cui risiedono nel tessuto polmonare nativo 1,27. Il metodo alternativo primario che possiamo immaginare per coltivare cellule su fette polmonari in un modo veramente specifico per regione comporterebbe la semina di polmoni decellularizzati intatti attraverso le vie aeree31,48 e i compartimenti vascolari49,50, e quindi affettare il tessuto recellularizzato. Tuttavia, questa alternativa 1) è significativamente più costosa, dispendiosa in termini di costi, tempo e risorse; 2) è un throughput inferiore; 3) richiede un aumento del numero di animali; e 4) è associato ad un aumentato rischio di contaminazione a causa delle sfide dell'intera coltura polmonare e della successiva affettatura del polmone seminato. Pur non ricapitolando tutti gli aspetti dell'organizzazione cellulare nativa, la piattaforma ELT consente la coltura di cellule polmonari su un substrato ECM fisiologicamente rilevante, in un modo accessibile a molti più laboratori.
La flessibilità del sistema ELT è un grande vantaggio di questa piattaforma e dovrebbe consentire la coltura di tessuti polmonari su piccola scala con qualsiasi numero di scaffold, cellule o terreni di coltura di interesse. L'uso di scaffold derivati da tessuto malato o da modelli di lesioni può consentire lo studio delle interazioni cellula-cellula o cellula-matrice nel contesto di ECM 27,29,51 alterato dalla malattia. Tuttavia, si noti che potrebbe essere necessario adattare il protocollo di decellularizzazione per tenere conto delle differenze di matrice tra le specie52. La strategia di semina descritta può essere utilizzata per qualsiasi tipo di cellula e la tempistica di coltura adattata per soddisfare le esigenze del ricercatore. Come punto di partenza, 1 x 106 cellule per impalcatura dovrebbe produrre un tessuto altamente cellulare entro 7 giorni dalla coltura, mentre 1 x 105 cellule totali provocano una scarsa cellularità. In qualsiasi adattamento della linea temporale, le cassette di coltura tissutale devono essere rimosse dal bagno di semina 24 ore dopo l'ultima semina del tessuto. Qui, con l'obiettivo di modellare parte della complessità cellulare dell'alveolo polmonare, descriviamo una strategia di ricellularizzazione in tri-coltura che supporta il mantenimento di AEC2 neonatali ben differenziati in strutture alveolari per almeno 7 giorni. I nostri risultati dimostrano anche il successo dell'attecchimento sia dei fibroblasti che delle cellule endoteliali all'interno degli ELT, sottolineando l'ampia applicabilità del substrato di coltura e la sua idoneità per gli studi di co-coltura. La semina di cellule adulte in PFU può facilitare la modellazione di strutture alveolari più quiescenti, mentre la semina di AEC2 umani derivati da PSC, compresi quelli con modificazioni genetiche, potrebbe facilitare studi traslazionali di malattie umane13,53. In generale, l'approccio bottom-up abilitato dalla piattaforma ELT presenta l'opportunità di indagare i contributi di particolari tipi di cellule alle letture di interesse - come la proliferazione AEC2 o lo stato di differenziazione.
In sintesi, questo protocollo delinea un robusto sistema per la generazione di tessuti polmonari ingegnerizzati per studi di co-coltura di AEC2, fibroblasti e cellule endoteliali all'interno di scaffold acellulari di fette polmonari ECM. Gli ELT rappresentano una nuova strategia di coltura 3D per gli AEC2 primari, che fino ad oggi si sono tipicamente basati su matrici di tipo gel meno fisiologiche per mantenere un fenotipo 6,11,12 ben differenziato. L'attuale piattaforma si basa su precedenti lavori nel ripopolamento di fette polmonari decellularizzate 24,25,26,27,28,29, ma offre diversi vantaggi: 1) un sistema di cassette per colture tissutali per facilitare la gestione dei PFU durante la decellularizzazione, la semina e la coltura; 2) un bagno di semina personalizzato per seminare con precisione un numero noto di cellule su ogni impalcatura della fetta; e 3) una strategia di risemina tricoltura che consente il ripopolamento del tessuto alveolare con cellule epiteliali, mesenchimali ed endoteliali. Pertanto, gli ELT rappresentano un importante passo avanti verso la creazione di modelli riproducibili in vitro che catturano la complessità cellulare e del substrato dell'alveolo nativo e della nicchia delle cellule staminali AEC2.

Gli alveoli sono le unità funzionali del polmone distale, che comprende una rete di spazi aerei a scambio di gas rivestiti da cellule epiteliali alveolari di tipo 1 (AEC1) e cellule di tipo 2 (AEC2). Alla base dell'epitelio c'è una fitta rete di capillari e mesenchima di supporto, il tutto sostenuto da un'impalcatura a matrice extracellulare (ECM) che fornisce forza e flessibilità a queste delicate sacche d'aria1. Gli alveoli sono anche il sito di lesioni in numerose patologie polmonari, tra cui la fibrosi polmonare idiopatica2, la sindrome da distress respiratorio acuto3 e la grave malattia da coronavirus-19 (COVID-19)4. Sebbene il lavoro dell'ultimo decennio abbia scoperto una notevole plasticità all'interno dell'epitelio polmonare, i meccanismi che consentono la riparazione polmonare distale in alcuni contesti - e che precludono la riparazione in altri - rimangono un'area di intensa indagine5. Lo sviluppo di piattaforme in vitro migliorate per modellare l'alveolo faciliterebbe gli studi di biologia alveolare, rigenerazione e terapia.
Gli AEC2 si auto-rinnovano e si differenziano in AEC1, e quindi sono considerati la cellula staminale primaria del polmone distale 6,7,8. Tuttavia, queste cellule rappresentano una sfida particolare per lo studio in vitro date le difficoltà associate alla coltura di AEC2 primari senza perdita di fenotipo9. Nella cultura convenzionale a 2 dimensioni (2D), gli AEC2 appiattiscono e adottano alcune caratteristiche delle celle simili ad AEC110. Al contrario, le strategie di coltura 3D, più comunemente organoidi, supportano il mantenimento di caratteristiche differenziate negli AEC2 primari 6,11,12 e consentono la coltura a lungo termine di AEC2 derivati da cellule staminali pluripotenti (PSC) 13,14. Gli organoidi sono stati utilizzati per modellare lo sviluppo polmonare distale15, l'infezione virale 11,15 e la malattia genetica correlata all'AEC2 13,16,17, consentendo importanti approfondimenti sulla biologia e la rigenerazione dell'AEC2. Tuttavia, questi modelli di coltura comprendono in genere solo uno o due lignaggi cellulari e incorporano le cellule in matrici di tipo gel che non riescono a ricapitolare né l'architettura né il substrato ECM dell'alveolo polmonare nativo.
L'ECM è un regolatore critico del fenotipo e del comportamento cellulare tramite segnali molecolari, topologici e meccanici; comprende una componente chiave delle nicchie tessuto-specifiche che regolano il destino delle cellule staminali; e funge da serbatoio che modula la disponibilità di fattori di crescita secreti localmente 18,19,20,21. La coltivazione di cellule su ECM nativo può quindi aumentare la capacità predittiva dei sistemi in vitro di modellare la biologia dei tessuti in vivo. La decellularizzazione, un processo che rimuove il materiale cellulare dai tessuti tramite detergenti, enzimi o metodi fisici o di altro tipo, può preservare in gran parte l'impalcatura ECM di un organo nativo, se eseguita con cura22,23. Tali scaffold possono essere ripopolati con cellule per la coltura biomimetica 3D. Tuttavia, mentre gli scaffold decellularizzati sono ampiamente utilizzati per applicazioni di ingegneria tissutale, il loro uso per la coltura cellulare di routine è stato limitato. Diversi studi precedenti hanno riportato la decellularizzazione e la ricellularizzazione di fette polmonari o piccoli segmenti di tessuto polmonare. Oltre agli studi proof-of-concept24,25,26, sono state utilizzate fette polmonari ripopolate per studiare l'adesione della matrice fibroblastica27,28 e per studiare l'effetto delle matrici polmonari malate sul fenotipo27,29 dei fibroblasti. Con le tecnologie migliorate disponibili per la generazione di fette di tessuto tagliate con precisione, le fette polmonari decellularizzate potrebbero offrire una piattaforma comoda e su piccola scala con cui coltivare le cellule, preservando al contempo le sottostrutture alveolari, delle vie aeree e vascolari. L'incorporazione di più tipi di cellule consentirebbe studi sulle interazioni cellula-cellula all'interno di un ambiente 3D fisiologicamente rilevante. Tuttavia, sono necessarie strategie migliorate per facilitare la manipolazione dei tessuti durante tutto il processo di coltura e per garantire la semina controllata e riproducibile di tessuti con un numero noto di cellule.
Qui, presentiamo un protocollo per generare tessuti polmonari ingegnerizzati (ELT) ripopolando fette polmonari decellularizzate a taglio di precisione (PCLS) con cellule endoteliali primarie, AEC2 e fibroblasti. In un adattamento del nostro sistema di tessuto cardiaco ingegnerizzato precedentemente descritto30 e delle strategie di decellularizzazione-ricellularizzazione dell'intero polmone22,31, descriviamo le procedure per tagliare PCLS dai polmoni di ratto e per agganciare le fette in cassette di coltura tissutale riutilizzabili che semplificano e standardizzano le manipolazioni a valle. Le fette tagliate vengono decellularizzate per formare scaffold ECM acellulari, che vengono ripopolati in bagni di semina personalizzati. Gli scaffold a fette polmonari preservano i componenti e l'architettura ECM critici e supportano la crescita di AEC2 all'interno di strutture alveolari multi-lineage per almeno 7 giorni. Gli ELT rappresentano un nuovo sistema di co-coltura alveolare all'interno di una matrice 3D fisiologicamente rilevante, che dovrebbe supportare lo sviluppo di strategie di ingegneria dei tessuti polmonari, facilitando al contempo gli studi biologici di base degli AEC2 e degli alveoli.

<table><tbody><tr><td>Stampante 3D: Form 2</td><td>Formlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-Isobutil-1-metilxantina (IBMX)</td><td>Sigma</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>8-Bromo cAMP</td><td>Sigma</td><td>B7880</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio, UltraPure LMP</td><td>Invitrogen</td><td>15517-014</td><td></td></tr><tr><td>Amfotericina B</td><td>Sigma</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>Raccordo riduttore spinato, 3/8 di pollice x 1/4 di pollice</td><td>McMaster-Carr</td><td>5121K271</td><td></td></tr><tr><td>Benzonasi nucleasi</td><td>Sigma</td><td>E1014</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA) Frazione V</td><td>Gemini</td><td>700-104P</td><td>Per terreno di crescita AEC2</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA), grado standard</td><td>Gemini</td><td>700-100P</td><td>Per tampone benzonasi</td></tr><tr><td>Valvola di ritegno, polipropilene, portagomma da 1/8 di pollice</td><td>Cole-Parmer</td><td>SK-98553-10</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>PeproTech</td><td>2520691</td><td></td></tr><tr><td>Resina trasparente, 1 L di</td> colla cianoacrilica <td>Formlabs</td><td>RS-F2-GPCL-04</td><td></td></tr><tr><td>, come la colla permanente Krazy Maximum Bond</td><td>Qualsiasi ferramenta, artigianato o farmacia</td><td>KG483 o simile</td><td></td></tr><tr><td>Desametasone</td><td>Sigma</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (a basso contenuto di glucosio)</td><td>Gibco</td><td>11885-084</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (glucosio alto)</td><td>Saggio del DNA Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>(kit del saggio del DNA Quant-iT PicoGreen)</td><td>Invitrogen</td><td>P7589</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, 0,5 M, pH 8,0</td><td>AmericanBio</td><td>AB00502-01000</td><td></td></tr><tr><td>Kit EdU (Kit di proliferazione cellulare Click-iT EdU per l'imaging, Alexa Fluor 647)</td><td>Invitrogen</td><td>C10340</td><td>Utilizzato secondo le indicazioni del produttore</td></tr><tr><td>Raccordo a gomito, 3/8 di pollice</td><td>McMaster-Carr</td><td>5121K907</td><td></td></tr><tr><td>F12</td><td>Gibco</td><td>11765-054</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS), caratterizzato</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina solfato</td><td>Gemini</td><td>400-100P</td><td>Ricostituito in diH2O per una soluzione madre a 50 mg/mL</td></tr><tr><td>Tagliacapelli</td><td>Wahl</td><td>MiniArco</td><td></td></tr><tr><td>Hank's balanced salt solution (HBSS), senza fenolo</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Iniezione di eparina sodica, USP, 1000 U/mL</td><td>Sagent</td><td>NDC: 25021-400-30</td><td>Per iniezione intraperitoneale e intracardiaca</td></tr><tr><td>Sale sodico di eparina</td><td>Sigma</td><td>H4784</td><td>Per perfusione dell'arteria polmonare; preparare una soluzione madre a 100 U/mL in PBS</td></tr><tr><td>HEPES Buffer</td><td>Corning</td><td>25-060-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Raccordo a T in linea, 3/8 di pollice x 1/8 di pollice</td><td>McMaster-Carr</td><td>5121K851</td><td></td></tr><tr><td>Anello di inoculazione, monouso</td><td>Fisherbrand</td><td>22-363-600</td><td></td></tr><tr><td>Insulina da pancreas bovino</td><td>Sigma</td><td>I6634</td><td></td></tr><tr><td>Iniezione di ketamina, 100 mg/mL</td><td>Covetrus (Butler Animal Health)</td><td>010177</td><td></td></tr><tr>KGF, taglierina laser <td>PeproTech</td><td>100-19</td><td></td><td>umana ricombinante</td></tr><tr><td>, VLS 3.50 30 watt</td><td>Universal Laser Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-glutammina</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Luer-lock, femmina, 3/32 pollici</td><td>Cole-Parmer</td><td>45508-02</td><td></td></tr><tr><td>Luer-lock, maschio, 1/8 di pollice</td><td>Cole-Parmer</td><td>30800-24</td><td></td></tr><tr><td>Luer-lock, maschio, 1/4 di pollice</td><td>McMaster-Carr</td><td>51525K146</td><td></td></tr><tr><td>MCDB-131 Completo senza siero</td><td>VEC Technologies</td><td>MCDB-131 WOFBS</td> Cloruro di <td></td></tr><tr><td>magnesio (MgCl2), 1 M</td><td>AmericanBio</td><td>AB09006-00100</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>American Bioananalytical</td><td>AB01915</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), senza Ca2+ e Mg2+, 10X</td><td>Sigma</td><td>D1408</td><td>Recostituire a 1X con diH2O</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), con Ca2+ e Mg2+</td><td>Gibco</td><td>21300-058</td><td></td></tr><tr><td>PDMS - Kit di elastomeri siliconici SYLGARD 184</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>4019862</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina (10.000 U/mL penicillina/10.000 &mu; g/mL streptomicina)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri, 150 mm</td><td>Falcon</td><td>351058</td><td></td></tr><tr><td>Film plastico (parafilm)</td><td>Tubo BPT Pharmed Bemis</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>, tubo BPT LS 16</td><td>Masterflex</td><td>06508-16</td><td></td></tr><tr><td>Pharmed BPT, tubo in</td> silicone polimerizzato al platino LS 17 <td>Masterflex</td><td>06508-17</td><td></td></tr><tr><td>, LS 14</td><td>Masterflex</td><td>96420-14</td><td></td></tr><tr><td>Tubi in silicone polimerizzato con platino, LS 16</td><td>Masterflex</td><td>96420-16</td><td></td></tr><tr><td>Tubi in silicone polimerizzato con platino, LS 36</td><td>Masterflex</td><td>96410-36</td><td></td></tr><tr><td>Poloxamer 407 (Pluronic F-127)</td><td>Sigma</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>Tamponi per la preparazione di povidone/iodio, 10%</td>Foglio in PTFE <td>Dynarex Corporation</td><td>1108</td><td></td></tr><tr><td>, spessore 0,060 pollici (1/16 di pollice)</td><td>ePlastics</td><td>PTFENAT0.060X12X12</td><td>Per schede per cassette per colture tissutali Foglio</td></tr><tr><td>in PTFE, 0,093 pollici (3/32 pollici) di spessore</td><td></td><td>ePlastics PTFENAT0.093X12X12</td><td>Per telai e clip per cassette per colture tissutali</td></tr><tr><td>Azionamento della pompa peristaltica: Masterflex L/S Azionamento digitale a velocità variabile</td><td>Cole-Parmer</td><td>ZM-07528-30</td><td></td></tr><tr><td>Testa della pompa peristaltica: Testa della pompa Masterflex L/S Easy-Load II</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-77202-60</td><td></td></tr><tr><td>Rat, Sprague Dawley</td><td>Charles River</td><td>Codice ceppo: 400</td><td></td></tr><tr><td>Lama di rasoio</td><td>Qualsiasi ferramenta o negozio di artigianato</td><td>Personna 94-120-71 o simile</td><td></td></tr><tr><td>Acido retinoico</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>Lame rotanti, 28 mm</td><td>Omnigrid</td><td>2046</td><td></td></tr><tr><td>Taglierina rotante, 28 mm</td><td>Olfa</td><td>Modello 9551</td><td></td></tr><tr><td>Desossicolato di sodio (SDC)</td><td>Sigma</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>Nitrorusside di sodio (SNP)</td><td>Rubinetto Sigma</td><td>71778</td><td></td></tr>, sutura <tr><td>Edwards</td><td>594WSC</td><td></td>a<td>4 vie</td></tr><tr><td>, 4-0 siringa in polipropilene monofilamento</td><td>Covidien</td><td>VP-557-X</td><td></td></tr><tr><td>, 10 mL</td><td></td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>siringa BD, 50 mL</td><td></td><td>BD 309653</td><td></td></tr><tr><td>Piastra per coltura tissutale, 35 mm</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>Piastra per coltura tissutale, 100 mm</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>Piastra per coltura tissutale, 6 pozzetti</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Piastra per coltura tissutale</td><td>Falcon</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>Transferrin umano</td><td>Sigma</td><td>T8158</td><td></td></tr><tr><td>Tris, 1 soluzione M, pH 8.0</td><td>AmericanBio</td><td>AB14043-01000</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB02025-00500</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome, Compresstome VF-300-0Z</td><td>Strumenti di precisione LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xilazina, 100 mg/mL</td><td>Henry Schein</td><td>NDC: 11695-4022-1</td><td></td></tr><tr><td>Connettore a Y, 1/16 di pollice spinato</td><td>Cole-Parmer</td><td>30614-43</td><td></td></tr></tbody></table>

tessuti polmonari ingegnerizzati preparati da fette di polmone decellularizzate

Engineered Lung Tissues Prepared from Decellularized Lung Slices

C'è bisogno di modelli polmonari tridimensionali (3D) migliorati che ricapitolino la complessità architettonica e cellulare dell'alveolo polmonare nativo ex vivo. Modelli organoidi sviluppati di recente hanno facilitato l'espansione e lo studio dei progenitori epiteliali polmonari in vitro, ma queste piattaforme si basano tipicamente sulla matrice e/o sul siero derivati dal tumore del topo e incorporano solo uno o due lignaggi cellulari. Qui, descriviamo un protocollo per la generazione di tessuti polmonari ingegnerizzati (ELT) basato sulla ricellularizzazione multi-lineage di fette polmonari decellularizzate tagliate con precisione (PCLS). Gli ELT contengono strutture alveolari che comprendono epitelio alveolare, mesenchima ed endotelio, all'interno di un substrato di matrice extracellulare (ECM) molto simile a quello del polmone nativo. Per generare i tessuti, i polmoni di ratto vengono gonfiati con agarosio, affettati in fette spesse 450 μm, tagliati a strisce e decellularizzati. Gli scaffold ECM acellulari risultanti vengono quindi riseminati con cellule endoteliali primarie, fibroblasti e cellule epiteliali alveolari di tipo 2 (AEC2). Gli AEC2 possono essere mantenuti in coltura ELT per almeno 7 giorni con un terreno di crescita privo di siero e chimicamente definito. Durante il processo di preparazione e coltura dei tessuti, le fette vengono ritagliate in un sistema di cassette che facilita la manipolazione e la semina cellulare standardizzata di più PFU in parallelo. Questi PFU rappresentano una piattaforma di coltura organotipica che dovrebbe facilitare le indagini sulle interazioni cellula-cellula e cellula-matrice all'interno dell'alveolo, nonché i segnali biochimici che regolano gli AEC2 e la loro nicchia.

Una panoramica del processo di generazione dei PFU - che comprende l'affettamento polmonare, il taglio e la decellularizzazione delle fette e il ripopolamento delle impalcature - è presentata nella Figura 3. Gli ELT qui presentati sono stati coltivati utilizzando cellule endoteliali microvascolari polmonari di ratto primarie (vedi Tabella dei materiali), AEC2 di ratto neonatale e fibroblasti polmonari di ratto neonatali arricchiti con lipofibroblasti36. Gli AEC2 sono stati appena isolati tramite smistamento magnetico a base di perline come descritto in precedenza37; protocolli di isolamento alternativi sono stati dettagliati e discussi altrove 38,39,40. La purezza degli AEC2 isolati di ratto può essere valutata tramite citometria a flusso per il marcatore di superficie AEC2 specifico per ratto RTII-7041, o tramite colorazione di un campione di cellule citocentrifughe per RTII-70 o proteina C pro-tensioattiva (pSPC). I fibroblasti polmonari di ratto sono stati isolati dai cuccioli di ratto postnatale giorno 7-9 secondo un adattamento di un protocollopubblicato 42 e utilizzato al passaggio 1-2; protocolli di isolamento alternativi sono stati descritti altrove43,44. La purezza dei fibroblasti isolati può essere valutata attraverso la colorazione di cellule in coltura o citocentrifughe per la vimentina marcatore mesenchimale e l'arricchimento dei lipofibroblasti può essere valutato tramite colorazione per Oil Red O45.
Quando il tessuto polmonare è uniformemente gonfiato con agarosio e pezzi di tessuto strategicamente selezionati e orientati per l'affettamento in modo da massimizzare l'area totale e parenchimale del tessuto, un polmone di ratto può produrre tessuto per PFU alveolari &gt;100. Le strisce di PCLS mostrano un'integrità meccanica sufficiente per essere agganciate in cassette di tessuto con pochi (&lt;5%) casi di strappo (Figura 3B).
Il protocollo per la decellularizzazione delle fette polmonari è strettamente basato sul nostro protocollo di decellularizzazione dell'intero polmone precedentemente pubblicato, che per proteomica quantitativa ha dimostrato di preservare molti componenti ECM a livelli non significativamente diversi da quelli del polmone nativo22. Gli scaffold a fette decellularizzati preservano l'architettura nativa degli alveoli, come visto dalla colorazione di ematossilina ed eosina (H &amp; E) (Figura 4A, B) e dalla microscopia a contrasto di fase (Figura 4C). In genere escludiamo le impalcature contenenti grandi vie aeree o vasi (Figura 4D) o lacrime, anche se i primi possono essere inclusi se sono di interesse per il ricercatore. La decellularizzazione porta ad una riduzione del 96% del contenuto di DNA tissutale misurato mediante un test per il DNA a doppio filamento (vedere Tabella dei materiali; 0,50 μg/mg ± 0,073 μg/mg vs 0,018 μg/mg ± 0,0035 μg/mg nel tessuto nativo vs decellularizzato, rispettivamente, ± media) (Figura 5A), senza DNA visibile mediante colorazione ematossilina (Figura 4B). La colorazione istologica e immunofluorescente degli scaffold decellularizzati rivela il mantenimento delle proteine ECM collagene, elastina, collagene IV e laminina con architettura e quantità simili a quelle delle fette polmonari native (Figura 5B-E). Si noti che i nuclei dei tessuti nativi si colorano di blu / nero con macchie di tricomi (per il collagene) ed EVG (per l'elastina). La colorazione immunofluorescente è stata eseguita come descritto in precedenza, utilizzando metodi standard per la colorazione dei tessuti37. Gli anticorpi utilizzati e le rispettive concentrazioni sono elencati nella Tabella 4.
Il successo del ripopolamento dell'impalcatura porta a PFU altamente cellulari dopo 7 giorni, con un modello di ripopolamento alveolare visibile al microscopio ottico (Figura 6A-C). In alcuni casi, con una cellularità molto elevata, possono essere visibili strutture di tipo organoide (Figura 6A,B). La semina tissutale non riuscita può essere visualizzata mediante microscopia a contrasto di fase durante la coltura (Figura 6C). Dopo aver coltivato scaffold tissutali con AEC2, fibroblasti e cellule endoteliali, i PFU vengono densamente ripopolati con strutture alveolari che comprendono tutte e tre le linee cellulari (Figura 6D, E). Al giorno 7 o 8, gli AEC2 mantengono la morfologia cuboidale ed esprimono la proteina B tensioattiva (SPB) e la proteina del corpo lamellare ABCA3, senza evidenza di differenziazione significativa in AEC1 (Figura 6E, F). Gli AEC2 sono altamente proliferativi nei PFU, come dimostrato dall'incorporazione di 5-etinil-2'-deossiuridina (EdU) a seguito di un impulso di 2 ore a 10 μM (Figura 6G).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig01.jpg"> Figura 1: Schema del sistema di perfusione per l'estrazione e la pulizia polmonare. (A) Il sistema di perfusione comprende un arto guidato dalla gravità, utilizzato per la cannulazione iniziale dell'arteria polmonare sotto flusso; e un arto azionato da una pompa, utilizzato per liberare i polmoni in modo efficiente dopo la cannulazione iniziale. La linea della pompa include un "smorzatore di impulsi" che smorza i picchi di pressione causati dalla pompa. Il design delle cannule arteriose tracheali e polmonari è dettagliato a sinistra. SNP = nitroprussiato di sodio. (B) Dettagli del gruppo smorzatore di impulsi. BPT e silicone si riferiscono a tipi di tubi. (C) Posizioni delle cannule arteriose tracheali e polmonari posizionate durante l'estrazione polmonare. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig02.jpg"> Figura 2: Sequenza temporale della cultura per la ricellularizzazione del tri-lignaggio. Tempistica proposta per la semina e la coltura del PFU tri-lignaggio, compresi i tempi di semina a due fasi. Sono indicati i numeri di cella per la semina e il terreno di coltura per ogni fase. Vedere i dettagli dei media culturali nella tabella 3. AEC2 = cellula epiteliale alveolare di tipo 2. EC = cellula endoteliale. FB = fibroblasti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig03.jpg"> Figura 3: Schema della preparazione del tessuto polmonare ingegnerizzato. (A) Il tessuto polmonare nativo viene tagliato a fette usando un vibratoma. (B) Le fette polmonari tagliate con precisione vengono tagliate in strisce standardizzate larghe 3 mm, tagliate in cassette di coltura tissutale in politetrafluoretilene (PTFE) e decellularizzate con detergente per produrre scaffold a matrice extracellulare acellulare. (C) Gli scaffold vengono riseminati in bagni di semina specializzati che limitano l'area di semina all'area del tessuto e quindi coltivati in un piatto di pozzo standard. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig04.jpg"> Figura 4: Struttura degli scaffold polmonari decellularizzati. Colorazione H&amp;E di fette polmonari native (A) e decellularizzate (B) che mostrano la conservazione dell'architettura alveolare dopo la decellularizzazione. (C,D) Esempi di scaffold ECM decellularizzati osservati con ingrandimento 5x mediante microscopia a contrasto di fase, comprendenti prevalentemente tessuto alveolare (C) o contenenti grandi vie aeree e vasi ramificati (D, punte di freccia nere e rosse). Barre di scala, 50 μm (A,B); 500 μm (C,D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig05.jpg"> Figura 5: Rimozione del DNA e conservazione della matrice in scaffold polmonari decellularizzati. (A) Quantificazione del DNA in fette polmonari native e decellularizzate (media ± SEM, n = 5). Test t di Welch, **P &lt; 0,01. Decell = decellularizzato. (B,C) Colorazione istologica di fette polmonari native e decellularizzate per collagene (B) ed elastina (C). Punte di freccia, elastina conservata in anelli d'ingresso alveolari di tessuto decellularizzato. (D,E) Colorazione immunofluorescente di fette polmonari native e decellularizzate per collagene IV (D) e laminina (E). Barre di scala, 50 μm. In tutti i pannelli, le caselle tratteggiate delineano l'area dell'immagine che viene ingrandita a destra in ciascun pannello. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig06.jpg"> Figura 6: Ripopolamento cellulare di tessuti polmonari ingegnerizzati. (A-C) Esempi di PFU ricellularizzati il giorno 7 della coltura, come visualizzato durante la coltura mediante microscopia a contrasto di fase. Il modello di ricellularizzazione rispecchia la struttura alveolare del tessuto. In alcune aree ad alta cellularità, possono formarsi strutture organoidiche (punte di freccia). (A) e (B) rappresentano un ripopolamento cellulare di successo, mentre (C) rappresenta uno scarso livello di ricellularizzazione dopo 7 giorni di coltura. (D-G) Colorazione di PFU ricellularizzati il giorno 7 o 8 della coltura. (D) Colorazione H&amp;E che mostra il ripopolamento cellulare dei setti alveolari. (E) Le etichette coloranti immunofluorescenti hanno innestato fibroblasti proCollagenIα1+ , ABCA3+ AEC2 e cellule endoteliali CD31+ . (F) I tessuti contengono abbondanti SPB+ AEC2 ma pochi RTI-40 (podoplanina)+ AEC1 in queste condizioni. (G) Molti AEC2 stanno proliferando nei PFU, come misurato dall'incorporazione di EdU. Barre di scala, 500 μm (A-C); 25 μm (D-G). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig06large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Tabella 1: Soluzioni di decellularizzazione. Dettagli di preparazione per soluzioni di decellularizzazione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Table%201%20-%20Decellularization%20solutions_Revised.xlsx" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questa tabella.</a>
Tabella 2: Protocollo di decellularizzazione. Dettagli del protocollo per la decellularizzazione delle fette polmonari. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Table%202%20-%20Decellularization%20protocol.xlsx" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questa tabella.</a>
Tabella 3: Mezzi di coltura. Dettagli di preparazione per i mezzi di crescita endoteliali e AEC2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Table%203%20-%20Culture%20media.xlsx" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questa tabella.</a>
Tabella 4: Anticorpi usati per l'immunocolorazione. Dettagli degli anticorpi e delle loro concentrazioni utilizzate per l'immunocolorazione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Table%204%20-%20Antibodies%20used%20for%20immunostaining.xlsx" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questa tabella.</a>
Fascicolo complementare 1: Progettazione per il taglio laser di telai per cassette per colture tissutali. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>
Fascicolo complementare 2: Progettazione per il taglio laser di clip per cassette per colture tissutali. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Supplementary%20File%202.zip" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>
Fascicolo complementare 3: Progettazione per il taglio laser di schede di cassette per colture tissutali. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Supplementary%20File%203.zip" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>
Fascicolo complementare 4: File CAD per la semina della base dello stampo del bagno. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Supplementary%20File%204.zip" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>
Fascicolo complementare 5: File CAD per la semina dell'anello dello stampo del bagno. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Supplementary%20File%205.zip" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>

Questo protocollo descrive un metodo per generare tessuti polmonari ingegnerizzati riproducibili su piccola scala, ripopolando fette polmonari decellularizzate tagliate con precisione con cellule epiteliali alveolari di tipo 2, fibroblasti e cellule endoteliali.

Tessuti polmonari ingegnerizzati preparati da fette di polmone decellularizzate

There is a need for improved 3-dimensional (3D) lung models that recapitulate the architectural and cellular complexity of the native lung alveolus ex ...

Questo protocollo consente l'uso ripetibile di matrice extracellulare polmonare intatta come substrato di coltura tissutale tridimensionale e una produttività moderata. Il vantaggio principale del sistema di tessuto polmonare ingegnerizzato è la flessibilità della piattaforma. Gli ELT possono essere adattati per utilizzare vari scaffold tissutali, cellule o terreni di coltura di interesse.Una volta estratti i polmoni, riempire una siringa da 10 millilitri con agarosio e HBSS senza rosso fenolo. Gonfiare i polmoni con circa 10 millilitri di aria attraverso la cannula della trachea, quindi iniettare immediatamente l'agarosio preparato attraverso la cannula della trachea fino a quando le punte più distali dei lobi polmonari sono gonfiate. Tappare la trachea attaccando il cappuccio bianco da un rubinetto a quattro vie al luer lock femminile della cannula tracheale.Posizionare il polmone in una capsula di Petri da 150 millimetri su ghiaccio per consentire all'agarosio di solidificarsi. Preparare le fette di polmone secondo il protocollo nel manoscritto, quindi riempire una capsula di Petri da 100 millimetri con 1/3 di volume di PBS. Trasferire cassette e linguette sul piatto usando una pinza.Se le fette sono congelate, scongelare un piatto alla volta versando su PBS a temperatura ambiente. Quindi, trasferire una fetta scongelata in una capsula di Petri da 150 millimetri. Aprire delicatamente la fetta usando una pinza fine o un emostato e aspirare accuratamente l'eccesso di PBS da tutto il tessuto.Quindi, tagliare una striscia larga tre millimetri, lunga almeno nove millimetri, dalla fetta premendo saldamente l'intera lunghezza di una lama di rasoio contro il piatto e dondolandola leggermente da un lato all'altro. Per agganciare la striscia di tessuto nella cassetta, farla galleggiare sopra la cassetta, centrandola con attenzione per estendersi oltre i fori nelle clip alle due estremità. Posizionare una linguetta parzialmente nel foro a un'estremità con una pinza fine, raddrizzare delicatamente il tessuto e impostare la seconda linguetta.Infine, utilizzare una pinza per premere completamente ogni linguetta per fissare il tessuto. Dopo aver tagliato tutti i lati, trasferire la parabola da 100 millimetri contenente le cassette su una cappa a flusso laminare. Trasferire le cassette in piastre a sei pozzetti contenenti la prima soluzione di decellularizzazione utilizzando un emostato curvo per afferrare i lati dentellati.Quindi, posizionare la piastra a sei pozzetti su uno shaker orbitale a 30 RPM per 10 minuti. Aspirare il fluido da ciascun pozzetto, quindi sostituirlo con tre millilitri della seconda soluzione di decellularizzazione per pozzetto. Posizionare la piastra su uno shaker orbitale a 30 RPM e incubare per cinque minuti.Ripeti questo processo con ogni soluzione come indicato nel protocollo di decellularizzazione nel manoscritto. Dopo il risciacquo finale con PBS, trasferire i tessuti in piastre sterili a sei pozzetti contenenti PBS fresco con antibiotici e antimicotici e incubare a 37 gradi Celsius per 48 ore. Dopo la sterilizzazione con antibiotici e antimicotici, gli scaffold del tessuto polmonare possono essere seminati immediatamente o conservati a quattro gradi Celsius per un massimo di 30 giorni.Prima di utilizzarlo per la coltura, incubare gli scaffold conservati a quattro gradi Celsius con PBS fresco e antibiotici e antimicotici durante la notte a 37 gradi Celsius come ulteriore fase di sterilizzazione. Quindi, sciacquare le impalcature con PBS sterile, cinque millilitri per pozzetto, tre volte, per cinque minuti ciascuna. Esaminare le impalcature al microscopio a contrasto di fase con ingrandimento 5X per selezionare i tessuti da seminare.Preparare la sospensione cellulare endoteliale in mezzo endoteliale a 5 milioni di cellule per millilitro con cellule sufficienti per seminare 500.000 cellule endoteliali per fetta. Posizionare i bagni di semina autoclavati in piastre di Petri da 100 millimetri e trasferire con cura gli scaffold di risciacquo a testa in giù nei bagni di semina. Ruotare delicatamente la sospensione cellulare preparata per mescolare.Quindi, pipettare con cura 100 microlitri di cellule direttamente sopra ogni tessuto alla base dei pozzetti, facendo attenzione a non danneggiare il tessuto con la punta della pipetta. Trasferire i tessuti seminati nell'incubatore di colture cellulari. 24 ore dopo la semina delle cellule endoteliali, aggiungere 900 microlitri di terreno di coltura preriscaldato a ciascun pozzetto usando una pipetta manuale, quindi restituire la piastra all'incubatore.Dopo 24 ore di semina cellulare, rimuovere il mezzo e sostituire il millilitro di mezzo endoteliale fresco per pozzetto. 72 ore dopo la semina delle cellule endoteliali, contare le cellule AEC2 o le cellule epiteliali alveolari di tipo II e i fibroblasti usando un emocitometro e preparare una sospensione cellulare 1: 1 nel mezzo di crescita AEC2 a 5 milioni di cellule per millilitro. Pipettare bene il mezzo da ogni bagno di semina e ruotare delicatamente la sospensione cellulare preparata.Pipetta 100 microlitri di cellule direttamente sopra ogni tessuto alla base del pozzo. Trasferire i tessuti seminati nell'incubatore di colture cellulari. Dopo due ore, aggiungere 900 microlitri di terreno di crescita AEC2 preriscaldato a ciascun pozzetto, quindi restituire la piastra all'incubatore.Dopo 24 ore di coltura con AEC2 e fibroblasti, preparare una piastra a 12 pozzetti con un millilitro di terreno di crescita AEC2 preriscaldato per pozzetto, per cassetta. Pipettare 800 microlitri di mezzo da ciascun pozzetto del bagno di semina, quindi rimuovere le cassette dal bagno di semina e trasferirle sul lato destro fino alla piastra a 12 pozzetti preparata, una cassetta per pozzetto. Cambia il terreno di coltura con attenzione usando una pipetta Pasteur di vetro a giorni alterni per la durata della coltura desiderata.Monitorare il grado di ripopolamento dei tessuti tramite microscopia a contrasto di fase con ingrandimento 5X per tutta la durata della coltura. La colorazione H ed E degli scaffold tissutali ha mostrato un'architettura alveolare preservata dopo la decellularizzazione senza nuclei cellulari visibili. Il tessuto alveolare è stato osservato quando gli scaffold della matrice extracellulare decellularizzata sono stati visualizzati con ingrandimento 5X mediante microscopia a contrasto di fase.Grandi vie aeree ramificate e vasi erano visibili anche in alcune fette. Il settimo giorno di coltura, la microscopia a contrasto di fase ha mostrato che il modello di ricellularizzazione nei tessuti polmonari ingegnerizzati emulava la struttura alveolare dei tessuti in caso di ripopolamento riuscito. Anche la scarsa ricellularizzazione era visibile.La colorazione H ed E al settimo o ottavo giorno ha mostrato il ripopolamento dei setti alveolari. L'immunofluorescenza in piedi ha rivelato fibroblasti pro-collagene di tipo I alfa 1-positivi, ABCA3-positivi AEC2, cellule endoteliali CD31-positive, e abbondanti AEC2 SPB-positivi. Inoltre, il test della timidina ha mostrato molti AEC2 proliferanti.Questa tecnica ha facilitato lo sviluppo di strategie per l'ingegneria dei tessuti polmonari e ha permesso indagini sulle code che supportano la proliferazione e la differenziazione delle cellule di tipo II all'interno dell'alveolo.

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Bioengineering

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Procedura per l&#39;Ingegneria del polmone

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