Protocollo basato sulla microdissezione laser per l'analisi LC-MS/MS del profilo proteomico dei granuli di neuromelanina
16 dicembre 2021
Un robusto protocollo è presentato qui per isolare i granuli di neuromelanina dal tessuto umano post-mortem substantia nigra pars compacta tramite microdissezione laser. Questo protocollo rivisto e ottimizzato riduce drasticamente il tempo necessario per la raccolta dei campioni, riduce la quantità di campione richiesta e migliora l'identificazione e la quantificazione delle proteine mediante analisi LC-MS/MS.
La nostra combinazione di microdissezione laser e spettrometria di massa consente lo studio di cambiamenti spazialmente risolti a livello proteomico in qualsiasi tipo di tessuto. Nel nostro caso, granuli di neuromelanina. Il nostro protocollo consente l'analisi proteomica basata su materiale campione limitato.
Che di solito è una grande sfida quando si lavora con tessuto cerebrale postmortem. Poiché le singole cellule possono essere isolate per confrontare condizioni sane e patologiche a livello proteomico. Questo può migliorare la nostra comprensione dei meccanismi della malattia.
Per iniziare, posizionare la slitta della membrana tissutale nel supporto della slitta sul palco del robo con il tessuto rivolto verso l'alto. Per acquisire una scansione panoramica della sezione di tessuto. Utilizzare la funzione di scansione, selezionare l'area di interesse dagli angoli in alto a sinistra e in basso a destra.
Quindi selezionare scansiona tutti i ROI per eseguire la scansione. Per la selezione automatica dei granuli di neuromelanina nel campo visivo corrente. Selezionare l'analisi del campo visivo.
Quindi selezionate Inverti risultato e impostate la soglia per i canali RGB. In modo che solo i granuli di neuromelanina siano evidenziati in rosso nella finestra di anteprima. Ora fai clic su OK per utilizzare le impostazioni regolate per il campo visivo.
Regolare le impostazioni del laser utilizzando un'area della diapositiva coperta solo dalla membrana. Riempire il tappo del tubo di raccolta del campione con 50 microlitri di acqua ultrapura. E inserisci il tappo nel collettore del robo mover.
Utilizzando l'interfaccia software, posizionare il robo mover sopra la fase due del robo per avviare la raccolta dei campioni. Avviare il laser. Controllare le impostazioni di energia e messa a fuoco durante il processo laser e regolare le impostazioni se necessario.
Garantire il corretto isolamento e catapultazione degli oggetti isolati nel tappo del tubo di raccolta dei campioni per almeno i primi 10 oggetti. Al termine del campionamento, guidare il robo mover nella sua posizione iniziale e rimuovere la provetta di raccolta dei campioni. Dopo aver fatto girare i campioni per centratura.
Asciugare i campioni per 1,5 ore in un concentratore sottovuoto. Dopo aver eseguito la digestione triptica come descritto nel testo. Preparare il campione per l'analisi HPLC-MS sciogliendo da 200 a 400 nanogrammi di peptidi campione in un volume definito dello 0,1% TFA.
In ingresso flaconcini di vetro spettrometrico di massa inerte. Se la determinazione della concentrazione non è applicabile a causa di una bassa quantità di campione. Verificare il carico identico del campione confrontando la corrente ionica totale.
Per iniziare l'analisi proteomica dei dati grezzi. Fare clic su Carica per caricare i file raw nel software. Fare clic su imposta esperimento per assegnare i nomi dei campioni.
Per definire parametri specifici del gruppo. Aggiungere le modifiche scegliendo la deamidazione NQ, l'ossidazione M e la carbamidometilazione N-term come modifiche variabili. e quindi aggiungere la carbamidometilazione C come modifica fissa.
Scegli la tripsina come enzima di digestione nella scheda di digestione. Nella scheda di quantificazione senza etichette, aggiungere l'opzione LFQ e se devono essere elaborati più di 10 file, scegliere l'opzione LFQ veloce per ridurre i tempi di elaborazione. Garantire che tutti gli altri parametri specifici del gruppo rimangano nelle impostazioni di fabbrica.
Passare alla scheda parametri globali e aggiungere il file FASTA derivato da uniprot. org nella scheda Sequenze. Modificare di conseguenza la regola dell'identificatore.
E aggiungi l'ID tassonomia 9606 per Homo sapiens. Per la quantificazione delle proteine scegliere peptidi unici e rasoio. Quindi aggiungi l'opzione iBAQ come misura per la quantificazione delle proteine nella scheda di quantificazione senza etichetta.
Assicurarsi che tutti gli altri parametri globali rimangano nelle impostazioni di fabbrica e fare clic su Start. Dopo che l'analisi è stata eseguita con successo recuperare i gruppi proteici. Output txt.
Caricare i gruppi proteici. txt nel software di analisi. Aggiungi i valori iBAQ come colonne principali e ordina tutte le altre colonne in base al loro tipo.
Filtrare le esche e i contaminanti filtrando le righe in base alla colonna categorica e filtrare i risultati in base a valori validi. Esportare l'output in formato txt per ulteriori elaborazioni. E valutare i risultati relativi alla domanda di ricerca.
Nel presente studio, 1.898 gruppi proteici sono stati identificati in NMG e 1.565 sono stati identificati nel tessuto SN circostante di cui 1.384 sono stati identificati in entrambe le aree tissutali. Pertanto, 514 e 181 gruppi proteici sono stati identificati esclusivamente nei NMG e nel tessuto SN rispettivamente. Nelle misurazioni rappresentative DDA.
Valori di iBAQ leggermente più alti negli NMG rispetto a SN indicavano una maggiore abbondanza della proteina citoplasmatica dinien-1, catena pesante 1 negli NMG. Questa osservazione potrebbe essere verificata in esperimenti PRM per il peptide ESPEVLLTLDILK. In cui è stata rilevata una maggiore abbondanza di NMG.
In base all'area di picco a livello MS1 e MS2. Il passo più importante è di gran lunga l'isolamento degli NMG, poiché il resto del protocollo si basa su questo passaggio da eseguire correttamente. Dopo la procedura LMD, i campioni possono essere utilizzati e ulteriormente elaborati per qualsiasi tipo di tecnica omica come genomica, trascrittomica, proteomica o lipidomica.
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Panoramica
Questo studio presenta un protocollo robusto per isolare i granuli di neuromelanina dal tessuto umano post-mortem della substantia nigra pars compacta utilizzando la microdissezione laser. L'approccio ottimizzato riduce significativamente il tempo e la quantità di campioni necessari, migliorando al contempo l'identificazione e la quantificazione delle proteine attraverso l'analisi LC-MS/MS.
Componenti chiave dello studio
Area di scienza
- Neuroscienze
- Proteomica
- Analisi del cervello post-mortem
Sfondo
- I granuli di neuromelanina sono stati storicamente difficili da isolare per l'analisi.
- I metodi tradizionali richiedono campioni più grandi e tempi di raccolta prolungati.
- La microdissezione laser consente un'isolamento preciso a livello di singola cellula.
- Questo protocollo mira a migliorare la comprensione dei meccanismi delle malattie nelle condizioni neurologiche.
Obiettivo dello studio
- Ottimizzare l'isolamento dei granuli di neuromelanina per l'analisi proteomica.
- Minimizzare i requisiti dei campioni e ridurre il tempo di raccolta nel tessuto post-mortem.
- Migliorare la rilevazione delle proteine legate alle condizioni di salute e malattia.
Metodi utilizzati
- La microdissezione laser è stata utilizzata per isolare i granuli di neuromelanina dal tessuto cerebrale umano.
- Il modello ha coinvolto il tessuto post-mortem della substantia nigra.
- È stato integrato un dettagliato flusso di lavoro LC-MS/MS per l'identificazione delle proteine.
- Sono stati enfatizzati i passaggi critici come la selezione automatizzata e la regolazione delle impostazioni del laser.
- L'analisi proteomica ha incluso la validazione rispetto ai metodi consolidati di quantificazione delle proteine.
Risultati principali
- Sono stati identificati 1.898 gruppi di proteine nei granuli di neuromelanina, con modelli di espressione distinti rispetto al tessuto circostante.
- Trovamenti degni di nota includono valori iBAQ più alti nei granuli di neuromelanina per specifiche proteine.
- Il metodo facilita il confronto tra condizioni di salute e malattia a livello proteomico.
- Questo studio evidenzia risultati critici riguardanti la composizione proteica nella salute e nella patologia del cervello.
Conclusioni
- Lo studio dimostra un approccio semplificato per isolare i granuli di neuromelanina, migliorando le analisi proteomiche.
- Il metodo ottimizzato ha implicazioni significative per la comprensione dei meccanismi delle malattie nei disturbi neurologici.
- Ulteriori applicazioni potrebbero portare a progressi in contesti clinici e di ricerca concentrati sulle patologie legate alla neuromelanina.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Laser microdissection enables spatially resolved proteomic analysis of neuromelanin granules from limited post-mortem human brain tissue, addressing a key bottleneck in neurodegenerative disease research. This approach supports target validation and mechanistic de-risking by providing disease-relevant proteomic data from dopaminergic neurons affected in Parkinson's disease. The method enhances predictive confidence in early discovery by allowing direct comparison of healthy and diseased states at the protein level.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating neuromelanin granules for proteomic profiling in Parkinson's disease-relevant tissue.
- Operational Value: Reduces tissue requirements through unbiased, automated collection of granules, facilitating analysis of precious post-mortem samples.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by identifying proteins exclusively enriched in neuromelanin granules versus surrounding substantia nigra tissue.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream omics workflows by yielding high-purity granule isolates compatible with LC-MS/MS.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through automated selection thresholds and consistent laser settings for granule isolation.
- Scientific Value: Enables reliable compound evaluation by providing quantitative proteomic outputs (iBAQ, LFQ) from disease-relevant neuronal compartments.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance by linking neuromelanin granule proteomics to neurodegenerative conditions like Parkinson's disease and dementia with Lewy bodies.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation by enabling proteomic comparison of healthy versus disease conditions.
- Scientific Value: Focuses on predictive de-risking value by identifying differentially abundant proteins (e.g., cytoplasmic dynein-1 heavy chain 1) as potential translational biomarkers.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation to preclinical research by providing spatially resolved proteomic data from disease-affected neuronal populations.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling proteomic comparison of neuromelanin granules and surrounding substantia nigra tissue.
- Screening: Describes assay readiness through automated granule selection and reproducible sample collection for downstream LC-MS/MS analysis.
- Analytics: Highlights label-free quantification (LFQ) and iBAQ measurements that allow teams to compare protein abundance between conditions.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity by enabling proteomic profiling of human tissue relevant to Parkinson's disease pathology.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability for omics applications (genomics, transcriptomics, lipidomics) beyond proteomics.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in neurodegeneration research.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability through automated laser microdissection workflows.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in CNS target programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on disease-relevant proteomic signatures.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in laser microdissection operation and mass spectrometry-based proteomics.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs include UV laser microdissection systems and LC-MS/MS platforms.
- Cross-team standardization requirements for granule selection thresholds and sample preparation protocols.
- Adaptation considerations across model systems, including optimization of laser settings for different tissue types.
- Practical limitations include dependency on post-mortem tissue availability and potential protein degradation effects.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:46
Laser Microdissection and Pressure Catapulting
2:46
Sample Preparation for HPLC-MS and Proteomic Raw Data Analysis
5:10
Statistical Analysis
5:50
Results: Protein Identification in Neuromelanin Granules (NMGs) and Substantia nigra (SN)
7:00
Conclusion
