Singola cellula riutilizzabile per analisi epigenomiche iterative
11 febbraio 2022
Il presente protocollo descrive un metodo a singola cellula per analisi epigenomiche iterative utilizzando una singola cellula riutilizzabile. La singola cellula riutilizzabile consente l'analisi di più segni epigenetici nella stessa singola cellula e la convalida statistica dei risultati.
Questo metodo sperimentale consente la conservazione a lungo termine delle singole cellule riutilizzabili per i test epigenomici. Permette inoltre l'analisi di molti segni epigenetici e fattori di trascrizione nella stessa singola cellula. Negli attuali metodi per l'analisi dell'epigenoma a singola cellula, le stesse singole cellule non possono essere rianalizzate.
Tuttavia, con singole celle riutilizzabili, le stesse singole cellule possono essere rianalizzate molte volte. Questa tecnica è utile per la diagnosi e la progettazione della terapia epigenetica, in particolare quando le cellule del paziente sono limitate in numero. Questo metodo è più adatto allo studio dell'epigenoma, alla regolazione dell'espressione genica e ad altri sistemi purché siano disponibili anticorpi specifici per i marchi epigenetici.
Quando provi per la prima volta questa tecnica, ti consigliamo di esercitarti su campioni non troppo preziosi e di convalidare l'esperimento utilizzando un sequenziamento superficiale come MiSeq o iSeq 100. Per iniziare, in una cappa a flusso laminare pulita, mescolare un millilitro di sospensione cellulare e 199 millilitri di un PBS EDTA millimolare contenente un colorante intercalatore per il DNA. Dopo la miscelazione, trasferire 200 microlitri della sospensione cellulare in ciascun pozzetto della piastra a fondo piatto a 96 pozzetti.
Posizionare il coperchio sulla piastra a 96 pozzetti e scansionare la lastra utilizzando un microscopio a scansione. Quindi, inclinare la piastra e attendere alcuni minuti fino a quando la singola cella non è affondata sul bordo inferiore del pozzo. Quindi posizionare la punta della pipetta nell'angolo inferiore e trasferire la singola cella e il tampone in una provetta PCR.
Controllare il pozzetto utilizzando un microscopio a fluorescenza per confermare il trasferimento. Se una singola cellula è ancora nel pozzo, aggiungere 200 microlitri per pozzetto di un PBS EDTA millimolare contenente un colorante intercalatore per il DNA e ripetere il trasferimento. Dopo il trasferimento, posizionare un coperchio sulla piastra PCR a 96 pozzetti e centrifugare la piastra utilizzando un rotore oscillante senza interruzioni.
Dopo la centrifugazione, posizionare la piastra sul ponte di un robot automatico per la movimentazione dei liquidi. Quindi, trascinare e rilasciare il codice supplementare uno nella finestra del software del robot di gestione dei liquidi ed eseguire il programma per rimuovere 195 microlitri di surnatante con una velocità di pipettaggio molto lenta. Aggiungere 50 microlitri di 4% TEMED o olio minerale e incubare la piastra durante la notte a temperatura ambiente.
Il giorno successivo, rimuovere l'olio minerale mediante pipettaggio e lavare le cellule cinque volte con 200 microlitri di tampone negativo al magnesio TP. Dopo l'ultimo lavaggio, rimuovere il surnatante, aggiungere 15 microlitri di tampone di ricottura e incubare sul ghiaccio per un'ora. Dopo l'incubazione, posizionare i tubi PCR su un termociclatore e riscaldare a 94 gradi Celsius per tre minuti.
Quindi trasferire i tubi in un blocco metallico raffreddato a ghiaccio e incubare per due minuti. Quindi, aggiungere quattro microlitri di cloruro di solfato di magnesio-sodio, mescolare DNTP e mescolare a vortice alla massima velocità. Quindi aggiungere un microlitro di grande frammento di polimerasi BST, mescolare per vortice e incubare per quattro ore su uno shaker.
Dopo l'incubazione, posizionare il tubo PCR su un termociclatore ed eseguire un programma di quattro ore o durante la notte come descritto nel testo. Per il legame anticorpale, aggiungere 1,625 microlitri di soluzione di cloruro di sodio EDTA BSA al tubo. Mescolare vorticando a bassa velocità e incubare il tubo sul ghiaccio per un'ora.
Quindi aggiungere 0,1 microgrammi per millilitro di anticorpo e controllare le IgG coniugate con la sonda anticorpale. Dopo aver aggiunto gli anticorpi, incubare i tubi sul ghiaccio con un leggero scuotimento. Il giorno successivo, lavare le celle due volte con 200 microlitri di tampone TPM-T su ghiaccio.
Quindi rimuovere il surnatante e lavare una volta con tampone T4 DNA ligasi. Quindi, aggiungere 19 microlitri di soluzione adattatore di legatura e incubare per un'ora a 25 gradi Celsius. Quindi, aggiungere un microlitro di DNA ligasi T4 e mescolare il tubo vorticando a velocità media.
Posizionare il tubo su un termociclatore ed eseguire il programma di legatura di prossimità. Dopo la corsa, lavare le cellule due volte con 200 microlitri di tampone positivo EDTA negativo al magnesio BST e conservare le cellule durante la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno seguente, lavare le cellule due volte con 200 microlitri di tampone negativo EDTA negativo al magnesio BST e aggiungere 20 microlitri di una miscela contenente BST, DNTP e solfato di magnesio.
Quindi mescolare con un miscelatore a vortice e incubare il tubo per quattro ore su uno shaker orbitale. Dopo l'incubazione, posizionare il tubo su un termociclatore ed eseguire il programma di estensione completo come descritto nel manoscritto testuale. Successivamente, per l'amplificazione a spostamento multiplo, aggiungere 0,4 microlitri di 100 micromolari di secondo primer casuale e mescolare per vortice.
Quindi, incubare il tubo per due ore su uno shaker orbitale prima di posizionare il tubo su un termociclatore per il riscaldamento a 94 gradi Celsius. Dopo tre minuti, posizionare i tubi in un blocco metallico raffreddato a ghiaccio e aggiungere un microlitro di DNA polimerasi BST. Vortice i tubi a bassa velocità.
Quindi posizionare i tubi su un termociclatore per eseguire il programma di amplificazione a spostamento multiplo. Dopo il programma, trasferire circa 20 microlitri di surnatante in un tubo PCR e conservarlo a meno 80 gradi Celsius. Quindi, aggiungere 20 microlitri di tampone TWEEN 20 e 0,1X TE allo 0,05% a un tubo PCR contenente la singola cellula riutilizzabile e incubare il tubo durante la notte a quattro gradi Celsius.
Il giorno seguente, raccogliere il surnatante e combinarlo con il surnatante raccolto in precedenza. Quindi, immergere la singola cellula riutilizzabile e il tampone TBS contenente il 50% di glicerolo, cinque millimolari EDTA, 0,5% BSA e 0,05% TWEEN 20, quindi incubarlo per 30 minuti su uno shaker orbitale. Dopo l'incubazione, conservare la singola cella riutilizzabile a meno 20 gradi Celsius fino a un ulteriore utilizzo.
Infine, aggiungere 40 microlitri di miscela master Exo negativa e posizionare il tubo su un termociclatore per eseguire il programma come descritto nel manoscritto testuale. Le singole celle riutilizzabili K562 sono state generate utilizzando questo protocollo. Le singole cellule sono state incorporate nello strato esterno della perla di poliacrilammide e visualizzate utilizzando un colorante intercalatore per la colorazione del DNA.
I prodotti a base di DNA prima e dopo la digestione di BciVI sono mostrati qui. La digestione enzimatica di restrizione ha generato i frammenti attesi da 19 a 20, da 31 a 32, 49 e superiori a 49 coppie di basi. Inoltre, la libreria di DNA costruita è stata analizzata mediante elettroforesi capillare per i prodotti desiderati.
I risultati del sequenziamento hanno indicato che le letture mappate uniche dell'anti-istone H3 acetilata lisina 27 e dell'anti-istone H3 trimetilata lisina 27 erano significativamente più numerose rispetto alle IgG di controllo. I segnali di sequenziamento REpi sono stati valutati confrontando i dati di sequenziamento REpi con i dati di sequenziamento ChIP di massa. In media, circa il 91% dei segnali di lisina 27 acetilata H3 dell'istone dal sequenziamento REpi si sovrapponevano ai picchi di lisina 27 acetilata dell'istone H-3 nel sequenziamento ChIP di massa.
La precisione del sequenziamento REpi per il segno istonico inattivo, istone H3 trimetilata lisina 27 era 52% La sensibilità del sequenziamento REpi è stata analizzata per misurare quanti picchi di sequenziamento ChIP di massa sono stati rilevati dal sequenziamento REpi riprodotto letture. La sensibilità del sequenziamento REpi è stata del 55,30% nell'istone H3 acetilata lisina 27 e del 50,94% nell'istone H3 trimetilata lisina 27. Assicurati di utilizzare reagenti privi di DNS.
Inoltre, tutte le operazioni che coinvolgono i cavi del tubo di apertura o i cavi del reagente devono essere eseguite in una cappa pulita. I prodotti del DNA di questa procedura vengono sequenziati e quindi mappati sul genoma per rivelare quali modifiche istoniche sono presenti, in quali regioni del genoma in singole cellule. Questa tecnologia ha permesso di analizzare più segni epigenetici nella stessa singola cellula e ha aperto la strada all'analisi multiomica in ogni singola cellula.
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Panoramica
Questo protocollo descrive un nuovo metodo a singola cellula per analisi epigenomiche iterative mediante l'uso di cellule singole riutilizzabili. Questo approccio consente l'analisi di più marcatori epigenetici all'interno della stessa cellula, facilitando la validazione statistica dei risultati.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Epigenomica
- Biologia cellulare
- Genetica
Sfondo
- I metodi attuali di analisi dell'epigenoma a singola cellula non consentono la riesame delle stesse cellule.
- Questo metodo affronta le limitazioni relative alla disponibilità di cellule del paziente per studi epigenetici.
- Sono necessari anticorpi specifici per i marcatori epigenetici in questa tecnica.
- È possibile lo stoccaggio a lungo termine di singole cellule riutilizzabili per test epigenomici continui.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo che consenta analisi multiple della stessa singola cellula.
- Migliorare la comprensione della regolazione dell'espressione genica.
- Facilitare la progettazione di terapie epigenetiche.
Metodi Utilizzati
- Tecnologia riutilizzabile per l'analisi epigenomica a singola cellula.
- Tecniche di conservazione a lungo termine per singole cellule.
- Analisi di diverse marcature epigenetiche e fattori di trascrizione.
- Validazione statistica dei risultati ottenuti da analisi multiple.
Risultati principali
- Ha dimostrato la fattibilità della rianalisi delle stesse singole cellule.
- Ha mostrato la capacità di analizzare contemporaneamente più marcatori epigenetici.
- Ha fornito informazioni sulla regolazione dell'espressione genica.
- Ha evidenziato il potenziale per un miglioramento nella progettazione delle terapie epigenetiche.
Conclusioni
- Il metodo riutilizzabile a singola cellula rappresenta un notevole progresso nella ricerca epigenomica.
- Questa tecnica è particolarmente vantaggiosa quando le cellule del paziente sono limitate.
- Studi futuri potranno sfruttare questo metodo per ottenere approfondimenti più dettagliati sui meccanismi epigenetici.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'analisi epigenomica iterativa mediante l'uso di singole cellule riutilizzabili affronta un collo di bottiglia fondamentale nel profilo delle singole cellule, consentendo ripetuti cicli di raccolta dati da campioni rari o preziosi. Questo approccio aumenta la sicurezza predittiva nella validazione di bersagli epigenetici e supporta una riduzione solida dei rischi meccanicistici nelle fasi iniziali di scoperta e nei punti critici di traduzione. Il metodo incrementa il valore del portafoglio massimizzando la densità di dati ottenuti da cellule limitate di derivazione paziente o rilevanti per la malattia.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Permette l'interrogazione ripetuta di marcatori epigenetici nella stessa cellula, riducendo il rumore biologico.
- Supporta la validazione funzionale delle proteine bersaglio consentendo il confronto diretto di diverse modifiche all'interno di una singola cellula.
- Migliora la sicurezza predittiva nell'analisi dei percorsi metabolici e nella riduzione del rischio meccanicistico.
Sviluppo di screening e saggi
- Semplifica la preparazione di sistemi monocellulari validati per flussi di lavoro multi-omici successivi.
- Permette la standardizzazione e la riproducibilità dei saggi controllando la variabilità tra cellula e cellula.
- Fornisce output quantitativi per lo screening affidabile di composti o anticorpi in contesti epigenetici.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea ai sistemi rilevanti per la malattia massimizzando i dati ottenuti da campioni pazienti rari.
- Permette una continuità dalla scoperta alla validazione preclinica, consentendo analisi longitudinali a singola cellula.
- Riduce il rischio nello sviluppo di biomarcatori traslazionali aumentando la densità di dati all'interno della singola cellula.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si integra nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica, consentendo test ipotetici iterativi e profili multiparametrici all'interno della stessa singola cellula.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi consentendo misurazioni epigenetiche ripetute in singole cellule.
- Screening: Garantisce prontezza del saggio e riproducibilità attraverso il riutilizzo standardizzato di singole cellule.
- Analisi: Fornisce letture quantitative e output statistici per confrontare i segnali di anticorpi e IgG di controllo all'interno della stessa cellula.
- Ricerca traslazionale: Permette una continuità preclinica conservando e riutilizzando cellule rare o derivate da pazienti per analisi prolungate.
- Riuso aziendale: Stabilisce una piattaforma di singole cellule riutilizzabili per studi epigenetici multi-omici e iterativi su diversi programmi.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione degli obiettivi epigenetici.
- Valore operativo: Standardizza i flussi di lavoro e migliora la riproducibilità riducendo la variabilità tra cellule.
- Valore strategico: Consente decisioni più accurate di avanzamento/cessazione e una maggiore efficienza del capitale estraendo il massimo quantitativo di dati da campioni limitati.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione e la progressione degli obiettivi epigenetici e dei biomarcatori con adeguamento del rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella manipolazione di singole cellule, nei saggi epigenomici e nelle tecniche di legazione per prossimità.
- Richiede l'accesso a piattaforme di sequenziamento e infrastrutture analitiche per l'integrazione di dati multi-marker.
- Necessita di una standardizzazione tra team per i protocolli di preparazione del campione e di analisi dei dati.
- Potrebbe essere necessaria un'adattamento per diversi tipi cellulari o modelli di malattia in base alla disponibilità degli anticorpi.
- I protocolli per la conservazione a lungo termine e il riutilizzo devono essere convalidati per ogni applicazione al fine di garantire l'integrità dei dati.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:32
Preparation of Reusable Single Cells: Manual Version
3:09
Random Primer Annealing and Extension
4:09
Antibody Binding and Proximity Ligation of Antibody Probe and Proximally Extended Random Primer
5:25
Full Extension of the 1st Random Primer and Multiple Displacement Amplification
7:32
Results: Single Cell Multiepigenomic Analysis
9:26
Conclusion
