Name: Singola cellula riutilizzabile per analisi epigenomiche iterative (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-11T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Scopri l'analisi epigenomica iterativa su singola cellula riutilizzabile per studiare marcatori epigenetici multipli nello stesso campione. Questo metodo avanzato consente la validazione statistica e la progettazione di terapie epigenetiche personalizzate.

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Ringraziamo i dottori David Sanchez-Martin e Christopher B. Buck per i commenti durante la fase di concettualizzazione del progetto. Ringraziamo anche il Genomics Core, il Center for Cancer Research, il National Cancer Institute, il National Institutes of Health per l'aiuto negli esperimenti preliminari e la Collaborative Bioinformatics Resource, CCR, NCI, NIH per i consigli nell'analisi computazionale. Ringraziamo la signora Anna Word per l'aiuto nell'ottimizzazione delle DNA polimerasi utilizzate nel metodo. Questo lavoro ha utilizzato le risorse computazionali del cluster NIHHPC Biowulf (http://hpc.nih.gov). Questo progetto è supportato dal programma intramurale del Center for Cancer Research, dal National Cancer Institute, dal National Institutes of Health, dal NCI Director's Innovation Award (# 397172) e dai fondi federali del National Cancer Institute con contratto n. HHSN261200800001E. Ringraziamo i dottori Tom Misteli, Carol Thiele, Douglas R. Lowy e tutti i membri del Laboratorio di Oncologia Cellulare per i commenti produttivi.

<ol><li>Perkel, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+enters+the+multiomics+age%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis enters the multiomics age.</a> Nature. 595 (7868), 614-616 (2021).</li>
<li>Clark, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((scNMT-seq+enables+joint+profiling+of+chromatin+accessibility+DNA+methylation+and+transcription+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">scNMT-seq enables joint profiling of chromatin accessibility DNA methylation and transcription in single cells.</a> Nature Communications. 9 (1), 781(2018).</li>
<li>Ma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+potential+identified+by+shared+single-cell+profiling+of+RNA+and+Chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin potential identified by shared single-cell profiling of RNA and Chromatin.</a> Cell. 183 (4), 1103-1116 (2020).</li>
<li>Zhu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ultra+high-throughput+method+for+single-cell+joint+analysis+of+open+chromatin+and+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An ultra high-throughput method for single-cell joint analysis of open chromatin and transcriptome.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 26 (11), 1063-1070 (2019).</li>
<li>Zhu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Joint+profiling+of+histone+modifications+and+transcriptome+in+single+cells+from+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Joint profiling of histone modifications and transcriptome in single cells from mouse brain.</a> Nature Methods. 18 (3), 283-292 (2021).</li>
<li>Mimitou, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable%2C+multimodal+profiling+of+chromatin+accessibility%2C+gene+expression+and+protein+levels+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Scalable, multimodal profiling of chromatin accessibility, gene expression and protein levels in single cells.</a> Nature Biotechnology. 39 (10), 1246-1258 (2021).</li>
<li>Ohnuki, H., Venzon, D. J., Lobanov, A., Tosato, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iterative+epigenomic+analyses+in+the+same+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Iterative epigenomic analyses in the same single cell.</a> Genome Research. 31 (10), 1819-1830 (2021).</li>
<li>Tosato, G., Ohnuki, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTosato%2C+G+%22Methods+of+preparing+a+re-usable+single+cell+and+methods+fro+analyzing+the+epigenome%2C+transcriptome%2C+and+genome+of+a+single+cell%22">Methods of preparing a re-usable single cell and methods fro analyzing the epigenome, transcriptome, and genome of a single cell</a>. , EP 3619307, US 202001026704 (2021).</li>
<li>Harada, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chromatin+integration+labelling+method+enables+epigenomic+profiling+with+lower+input%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A chromatin integration labelling method enables epigenomic profiling with lower input.</a> Nature Cell Biology. 21 (2), 287-296 (2019).</li>
<li>Egelhofer, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+assessment+of+histone-modification+antibody+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An assessment of histone-modification antibody quality.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 18 (1), 91-93 (2011).</li>
<li>Marina, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TET-catalyzed+oxidation+of+intragenic+5-methylcytosine+regulates+CTCF-dependent+alternative+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">TET-catalyzed oxidation of intragenic 5-methylcytosine regulates CTCF-dependent alternative splicing.</a> EMBO Journal. 35 (3), 335-355 (2016).</li>
<li>Weast, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWeast%2C+RC+%22Handbook+of+chemistry+and+physics%3A+a+ready-reference+book+of+chemical+and+physical+data.+56th+edn%22">Handbook of chemistry and physics: a ready-reference book of chemical and physical data. 56th edn</a>. Weast, R. C., Astle, M. J., Beyer, W. H. , Chemical Rubber Company Press. (1975).</li>
<li>Aydin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+short+history%2C+principles%2C+and+types+of+ELISA%2C+and+our+laboratory+experience+with+peptide%2Fprotein+analyses+using+ELISA%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">A short history, principles, and types of ELISA, and our laboratory experience with peptide/protein analyses using ELISA.</a> Peptides. 72, 4-15 (2015).</li>
<li>Gan, S. D., Patel, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+immunoassay+and+enzyme-linked+immunosorbent+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Enzyme immunoassay and enzyme-linked immunosorbent assay.</a> Journal of Investigative Dermatology. 133 (9), 12(2013).</li>
<li>Porstmann, T., Kiessig, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+immunoassay+techniques.+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzyme immunoassay techniques. An overview.</a> Journal of Immunological Methods. 150 (1-2), 5-21 (1992).</li>
<li>Chao, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+RNA-Seq+preparation+protocol+performance%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance.</a> BMC Genomics. 20 (1), 571(2019).</li>
<li>Song, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+analysis+of+library+prep+approaches+for+sequencing+low+input+translatome+samples%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">A comparative analysis of library prep approaches for sequencing low input translatome samples.</a> BMC Genomics. 19 (1), 696(2018).</li>
<li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+ChIP-seq+reveals+cell+subpopulations+defined+by+chromatin+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).</li>
<li>Ku, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+chromatin+immunocleavage+sequencing+%28scChIC-seq%29+to+profile+histone+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-cell chromatin immunocleavage sequencing (scChIC-seq) to profile histone modification.</a> Nature Methods. 16 (4), 323-325 (2019).</li>
<li>Carter, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+histone+modifications+in+low+cell+number+and+single+cells+using+antibody-guided+chromatin+tagmentation+%28ACT-seq%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Mapping histone modifications in low cell number and single cells using antibody-guided chromatin tagmentation (ACT-seq).</a> Nature Communications. 10 (1), 3747(2019).</li>
<li>Maskell, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+retroviral+integration+into+nucleosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural basis for retroviral integration into nucleosomes.</a> Nature. 523 (7560), 366-369 (2015).</li>
</ol>

Ohnuki e Tosato sono co-inventori di un brevetto intitolato "Metodi per la preparazione di una singola cellula riutilizzabile e metodi per analizzare l'epigenoma, il trascrittoma e il genoma di una singola cellula" (EP3619307 e US20200102604). La domanda di brevetto è stata depositata in parte sulla base dei risultati preliminari relativi alla tecnologia descritta nel manoscritto corrente. L'invenzione o le invenzioni descritte e rivendicate in questa domanda di brevetto sono state fatte mentre gli inventori erano dipendenti a tempo pieno del governo degli Stati Uniti. Pertanto, ai sensi del 45 Code of Federal Regulations Part 7, tutti i diritti, i titoli e gli interessi relativi a questa domanda di brevetto sono stati o dovrebbero essere assegnati per legge al governo degli Stati Uniti. Il governo degli Stati Uniti trasmette una parte delle royalties che riceve ai suoi inventori dipendenti ai sensi del 15 Codice degli Stati Uniti § 3710c.

Questo articolo descrive il protocollo passo-passo per l'analisi multiepigenomica a singola cellula recentemente riportata utilizzando singole cellule riutilizzabili7. Nei paragrafi successivi, discutiamo i punti critici, sottolineando i potenziali limiti nel protocollo. 
Uno dei punti critici in tutto il protocollo (dai passaggi 7.2-13) è evitare la contaminazione da DNasi. Una singola cellula ha solo due copie di DNA genomico. Pertanto, danneggiare il DNA genomico rid...

La tecnologia a cella singola sta entrando nell'era della multiomica a cella singola, che integra le tecnologie omiche a singola cella individuale1. Recentemente, la trascrittomica a singola cellula è stata combinata con metodi per rilevare l'accessibilità della cromatina (scNMT-seq2 e SHARE-seq3) o le modifiche istoniche (Paired-seq4 e Paired-Tag5). Più recentemente, la trascrittomica e la proteomica a singola cellula sono state integrate con l'accessibilità della cromatina (DOGMA-seq6). Questi metodi utilizzano la marcatura basata sulla trasposasi per rilevare l'accessibilità della cromatina o le modifiche degli istoni.
Gli approcci basati sulla trasposasi scindono il DNA genomico e aggiungono un codice a barre del DNA alla fine del frammento di DNA genomico. Ogni frammento genomico scisso può accettare solo fino a due codici a barre del DNA (= un segno epigenetico per sito di scissione) e il DNA genomico nel sito di scissione viene perso. Pertanto, gli approcci basati sulla scissione hanno un compromesso tra il numero di segni epigenetici testati e la densità del segnale. Ciò ostacola l'analisi di più segni epigenetici nella stessa singola cellula. Un metodo epigenomico unicellulare che non fende il DNA genomico è stato sviluppato per superare questo problema 7,8.
Oltre al problema derivato dalla scissione sopra menzionato, gli approcci basati sulla trasposasi hanno altre limitazioni. Nell'analisi dell'epigenoma a singola cellula, è fondamentale conoscere la posizione degli istoni e delle proteine associate al DNA sul genoma. Negli approcci attuali, questo si ottiene utilizzando singole cellule non fissate e la conservazione delle interazioni proteina-DNA e proteina-proteina. Tuttavia, ciò genera una forte distorsione verso le regioni della cromatina accessibili, anche nell'analisi delle modificazioni istoniche 9. La posizione degli istoni e delle proteine associate al genoma sul genoma può essere preservata senza reticolare proteina-DNA e proteina-proteina, utilizzando un'impalcatura di poliacrilammide 7,8. Questo approccio riduce la distorsione strutturale osservata negli approcci attuali che dipendono dalle interazioni proteina-DNA e proteina-proteina.
Gli approcci basati sulla trasposasi possono acquisire segnali solo una volta da una singola cellula. Pertanto, è difficile delineare l'epigenoma completo di una singola cellula a causa della caduta dei segnali. Le singole cellule riutilizzabili sono state sviluppate per superare i limiti attuali consentendo l'analisi epigenomica iterativa nella stessa singola cellula.

<table><tbody><tr><td>10x CutSmart</td><td>tampone New England BioLabs</td><td>B6004</td><td>10x Tampone di digestione</td></tr><tr><td>200 proof etanolo</td><td>Warner-Graham Company</td><td>200 proof</td><td>Etanolo</td></tr><tr><td>5-idrossimetilcitosina (5-hmC) Anticorpo monoclonale [HMC/4D9]</td><td>Epigentek</td><td>A-1018-100</td><td>Anti-5hmC</td></tr><tr><td>Acridina Arancio/Propidio Ioduro Stain</td><td>Logos Biosystems</td><td>F23001</td><td>Contatore di cellule</td></tr><tr><td>Soluzione di acrilammide, 40% in H2O, per biologia molecolare</td><td>MilliporeSigma</td><td>01697-500ML</td><td>Soluzione di acrilammide al 40%</td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza all-in-one BZ-X710</td><td>Keyence</td><td>BZ-X710</td><td>Unità di</td></tr><tr><td>filtro centrifugo Amicon Ultra-0.5</td><td>Cassetta di ultrafiltrazione</td><td>Sigma</td><td>UFC510024</td></tr><tr><td>Persolfato di ammonio per biologia molecolare</td><td>MilliporeSigma</td><td>A3678-100G</td><td>Polvere di persolfato di ammonio</td></tr><tr><td>DMF</td><td>anidro Vettori</td><td>laboratori S-4001-005</td><td>Anidro N,N-dimetilformammide (DMF)</td></tr><tr><td>Anti-RNA polimerasi II CTD ripetere YSPTSPS (fosfo S5) anticorpo [4H8]</td><td>Abcam</td><td>ab5408</td><td>Anti-Pol II</td></tr><tr><td>Anti-TRAP220/MED1 (fosfo T1457) anticorpo</td><td>Abcam</td><td>ab60950</td><td>Anti-Med1</td></tr><tr><td>BciVI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0596L</td><td>BciVI</td></tr><tr><td>Soluzione di albumina sierica bovina, 20 mg/mL in H2O, a bassa carica microbica, senza proteasi, per biologia molecolare</td><td>MilliporeSigma</td><td>B8667-5ML</td><td>20% BSA (Tabella 7)</td></tr><tr><td>Bst DNA polimerasi, frammento grande</td><td>New England BioLabs</td><td>M0275L</td><td>Bst DNA polimerasi</td></tr><tr><td>BT10 Serie 10 &; l Punta barriera</td><td>NEPTUNE</td><td>BT10</td><td>P10 Punta a bassa ritenzione</td></tr><tr><td>CellCelector</td><td>Soluzioni di laboratorio automatizzate</td><td>N/A</td><td>Robot di prelievo automatizzato a cella singola</td></tr><tr><td>CellCelector 4 piastre a nanopozzetti nl per la clonazione di singole cellule, piastra S200-100 100K, 24 pozzetti, ULA</td><td>Automated Lab Solutions</td><td>CC0079</td><td>Piastra a 4 nanopozzetti da 4 nL</td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>MilliporoSigma</td><td></td><td>Cloroformio</td></tr><tr><td>Corning Costar Micropiastra a fondo piatto a 96 pozzetti, trattata con colture cellulari</td><td>Corning</td><td>3596</td><td>Piastre a fondo piatto a 96 pozzetti</td></tr><tr><td>DNA polimerasi a sfiato profondo (eso-) New</td><td>England BioLabs</td><td>M0259L</td><td>Exo- DNA polimerasi</td></tr><tr><td>DNA LoBind Tubes, 0,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30108035</td><td>0,5 mL di provetta a basso legame</td></tr><tr><td>DNA DNA Oligo, 1° primer casuale</td><td>Tecnologie DNA integrate</td><td>N/ A, vedi Tabella 3</td><td>1° primer casuale</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2° primer casuale Cell#01</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, vedi Tabella 3</td><td>2° primer casuale</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2° primer casuale Cell#02</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, vedi Tabella 3</td><td>2° primer casuale</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2° primer casuale Cell#03</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, vedi Tabella 3</td><td>2° primer</td></tr> <tr><td>casualeDNA Oligo, 2° primer casuale Cell#04</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, vedi Tabella 3</td><td>2° primer casuale</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2° primer casuale Cell#05</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, vedi Tabella 3</td><td>2° primer casuale</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2° primer casuale Cell#06</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, vedi Tabella 3</td><td>2° primer casuale</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2° primer casuale Cell#07</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, vedere la Tabella 3</td><td>2° primer casuale</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2° primer casuale Cell#08</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, vedere la Tabella 3</td><td>2° primer casuale</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2° primer casuale Cell#09</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, vedere la Tabella 3</td><td>2° primer</td></tr><tr><td>casuale DNA Oligo, 2° primer casuale Cell#10</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, vedere la Tabella 3</td><td>2° primer casuale</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2° primer casuale Cell#11</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, vedere la Tabella 3</td><td>2° primer casuale</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2° primer casuale Cell#12</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, vedere la Tabella 3</td><td>2° primer casuale</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2° primer di sintesi</td> Integrated <td>DNA Technologies</td><td>N/A, vedere Tabella 3</td><td>2° primer</td></tr> <tr><td>di sintesiDNA Oligo, Adattatore di legatura</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, vedere la Tabella 3</td><td>Adattatore di legatura</td></tr><tr><td>DNA Oligo, Primer per trascrizione inversa</td> Integrated <td>DNA Technologies</td><td>N/A, vedere la Tabella 3</td><td>Primer per trascrizione inversa</td></tr><tr><td>DNase I (senza RNasi)</td><td>New England BioLabs</td><td>M0303L</td><td>DNase I (senza RNasi, 4 U).</td></tr><tr><td>Tampone di reazione DNase I</td><td>New England BioLabs</td><td>B0303S</td><td>10x DNase I buffer (NEB)</td></tr><tr><td>dNTP Mix (10 mM ciascuno)</td><td>Thermo Fisher</td><td>R0192</td><td>10 mM dNTPs</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino, origine USA, inattivato a caldo</td><td>MilliporeSigma</td><td>F4135-500ML</td><td>Siero fetale bovino</td></tr><tr><td>HiScribe T7 Kit di sintesi di RNA ad alto rendimento</td><td>New England BioLabs</td><td>E2040S</td> Master <td>mix di trascrizione in vitro</td></tr><tr><td>Anticorpo istone H3K27ac</td><td>Motivo attivo</td><td>39133</td><td>Anti-H3K27ac</td></tr><tr><td>Anticorpo istone H3K27me3</td><td>Motivo attivo</td><td>39155</td><td>Anti-H3K27me3</td></tr><tr><td>IgG da siero di coniglio</td><td>Millipore Sigma</td><td>I5006-10MG</td><td>Controllo IgG</td></tr><tr><td>Ossido di ferro (II,III) nanopolvere magnetica, 30 nm dimensione media della parte (TEM), NHS estere funzionalizzato</td><td>MilliporeSigma</td><td>747467-1G</td><td>Polvere di ossido di ferro da 30 nm funzionalizzata con estere NHS</td></tr><tr><td>K-562</td><td>Raccolta di colture di tipo americano (ATCC)</td><td>Cellule CCL-243</td><td></td></tr><tr><td>Acrilammide lineare (5 mg/mL)</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9520</td><td>Acrilammide lineare</td></tr><tr><td>LUNA-FL Contatore di cellule a doppia fluorescenza</td><td>Logos Biosystems</td><td>L20001</td><td>Contatore di cellule</td></tr><tr><td>LUNA Vetrini per conteggio cellulare, 50 vetrini</td><td>Logos</td><td>Biosystems L12001</td><td>Contatore di cellule</td></tr><tr><td>Olio minerale, BioReagent, per biologia molecolare, olio leggero</td><td>MilliporeSigma</td><td>M5904-500ML</td><td>Olio minerale</td></tr><tr><td>N,N,N&prime;,N&prime;-Tetrametiletilendiammina per biologia molecolare</td><td>MilliporeSigma</td><td>T7024-100ML</td><td>N,N,N&prime;,N&prime;-Tetrametiletilendiammina</td></tr><tr><td>NaCl (5 M), senza RNasi</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9760G</td><td>5M NaCl</td></tr><tr><td>NanoDrop Lite</td><td>Thermo Fisher</td><td>2516</td><td>&nbsp; Spettrofotometro per microvolumi</td></tr><tr><td>NEST 2 mL Piastra a pozzetti profondi a 96 pozzetti, fondo a V</td><td>Opentrons</td><td>N/A</td><td>Piastra a 96 pozzetti con pozzetti profondi da 2 mL</td></tr><tr><td>Piastra PCR a 96 pozzetti senza bordo</td><td>Genesee Scientific</td><td>27-405</td><td>Piastra per PCR a 96 pozzetti</td></tr><tr><td>NuSive GTG Agarose</td><td>Lonza</td><td>50081</td><td>Agarose</td></tr><tr><td>OmniPur Acrilammide: Bis-acrilammide 19:1, soluzione al 40%</td><td>MilliporeSigma</td><td>1300-500ML</td><td>Robot da laboratorio OT-2 al 40% acrilammide/bis-acrilammide</td></tr><tr><td></td><td>Opentrons</td><td>OT2</td><td>Robot automatizzato per la manipolazione dei liquidi</td></tr><tr><td>Paraformaldeide, grado EM, purificato, soluzione acquosa al 20%</td><td>Scienze della microscopia elettronica</td><td>15713</td><td>20% pararmaldeide</td></tr><tr><td>PBS (10x), pH 7,4</td><td>Thermo Fisher</td><td>70011044</td><td>10x PBS</td></tr><tr><td>PIPETMAN Classic P1000</td><td>GILSON</td><td>F123602</td><td>A P1000 pipetta</td></tr><tr><td>Provette Protein LoBind, 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>925000090</td><td>1,5 mL Provetta a basso legame proteico</td></tr><tr><td>QIAgen Kit di estrazione su gel</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td>A Pipetta P1000</td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay</td><td>Thermo Fisher</td><td>P11495</td><td>&nbsp; Kit di legatura rapida per colorante intercalante specifico per dsDNA</td></tr><tr><td></td><td>New England BioLabs</td><td>M2200L</td><td>T4 DNA ligasi (NEB)</td></tr><tr><td>RNaseOUT Inibitore della ribonucleasi ricombinante</td><td>Thermo Fisher</td><td>10777019</td><td>Inibitore dell'RNAsi</td></tr><tr><td>S-4FB Crosslinker (solubile in DMF)</td><td>Laboratori vettori</td><td>S-1004-105</td><td>Succinimidil 4-formilbenzoato (S-4FB)</td></tr><tr>Laboratori <td>vettoriali</td><td></td> <td>S-HyNicS-1002-105</td><td>Succinimidil 6-idrazinonicotinato acetone idrazone (S-HyNic)</td></tr><tr><td>Acetato di sodio, 3 M, pH 5.2, grado di biologia molecolare</td><td>MilliporeSigma</td><td>567422-100ML</td><td>3M Acetato di sodio (pH 5.2)</td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio, 1M tampone soln., pH 8.5</td><td>Alfa Aesar</td><td>J60408</td><td>1M tampone bicarbonato di sodio, pH 8.5</td></tr><tr><td>Sodio fosfato bibasico per biologia molecolare</td><td>MilliporeSigma</td><td>S3264-250G</td><td>Na2HPO4</td></tr><tr><td>Fosfato di sodio monobasico per biologia molecolare</td><td>MilliporeSigma</td><td>S3139-250G</td><td>NaH2PO4</td></tr><tr><td>Trascrittasi inversa SuperScript IV</td><td>Thermo Fisher</td><td>18090050</td><td>Trascrittasi inversa</td></tr><tr><td>SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (10.000x concentrato in DMSO)</td><td>Thermo Fisher</td><td>S11494</td><td>Un colorante intercalante per DNA</td></tr><tr><td>T4 Tampone di reazione DNA ligasi</td><td>New England BioLabs</td><td>B0202S</td><td>10x T4 Tampone di reazione DNA ligasi</td></tr><tr><td>ThermoPol Pacchetto tampone di reazione</td><td>New England BioLabs</td><td>B9004S</td><td>10x tampone TPM-T (Tris-HCl/Cloruro di pottasio/Solfato di magnesio/Triton X-100)</td></tr><tr><td>Reagente TRIzol LS</td><td>Thermo Fisher</td><td>10296-028</td><td>Estrazione di tiocianato-fenolo-cloroformio di guanidinio</td></tr><tr><td>Kit di preparazione della libreria di DNA TruSeq Nano</td><td>Illumina</td><td>20015965</td><td>Un kit di preparazione della libreria di DNA (vedere anche le istruzioni del produttore)</td></tr><tr><td>Ultramer DNA Oligo, Anti-5hmC_Ab#005</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, vedere la Tabella 3</td><td>Una sonda DNA modificata con ammina per l'anticorpo</td></tr><tr><td>Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27ac_Ab#002</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, vedere la Tabella 3</td><td>Una sonda DNA modificata con ammina per anticorpi</td></tr><tr><td>Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27me3_Ab#003</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, vedere la Tabella 3</td><td>Una sonda di DNA modificato con ammina per l'anticorpo</td></tr><tr><td>Ultramer DNA Oligo, Anti-Med1_Ab#004</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, vedere la Tabella 3</td><td>Una sonda di DNA modificato con ammina per l'anticorpo</td></tr><tr><td>Ultramer DNA Oligo, Anti-Pol II_Ab#006</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, vedere la Tabella 3</td><td>Una sonda di DNA modificato con ammina per l'anticorpo</td></tr><tr><td>Ultramer DNA Oligo, Control IgG_Ab#001</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, vedere la Tabella 3</td><td>Una sonda DNA modificata con ammina per il controllo IgG</td></tr><tr><td>UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Thermo Fisher</td><td>15575020</td><td>0,5 M EDTA, pH 8,0</td></tr><tr><td>Acqua distillata UltraPure DNasi/RNasi</td><td>Thermo Fisher</td><td>10977023</td><td>Acqua ultrapura</td></tr><tr><td>Colonne di desalinizzazione Zeba Splin, 7K MWCO, 0,5 mL</td><td>Thermo Fisher</td><td>89882</td><td>Colonna di desalinizzazione</td></tr></tbody></table>

singola cellula riutilizzabile per analisi epigenomiche iterative

Reusable Single Cell for Iterative Epigenomic Analyses

Le attuali analisi dell'epigenoma monocellulare sono progettate per l'uso singolo. La cellula viene scartata dopo un singolo utilizzo, impedendo l'analisi di più segni epigenetici in una singola cellula e richiedendo dati da altre cellule per distinguere il segnale dal rumore di fondo sperimentale in una singola cellula. Questo articolo descrive un metodo per riutilizzare la stessa singola cellula per analisi epigenomiche iterative. 
In questo metodo sperimentale, le proteine cellulari vengono prima ancorate a un polimero di poliacrilammide invece di reticolarle a proteine e DNA, alleviando i pregiudizi strutturali. Questo passaggio critico consente esperimenti ripetuti con la stessa singola cellula. Successivamente, un primer casuale con una sequenza di scaffold per la legatura di prossimità viene ricotto al DNA genomico e la sequenza genomica viene aggiunta al primer per estensione utilizzando una DNA polimerasi. Successivamente, un anticorpo contro un marcatore epigenetico e IgG di controllo, ciascuno marcato con diverse sonde di DNA, sono legati ai rispettivi bersagli nella stessa singola cellula. 
La legatura di prossimità viene indotta tra il primer casuale e l'anticorpo aggiungendo un DNA connettore con sequenze complementari alla sequenza di scaffold del primer casuale e della sonda anticorpo-DNA. Questo approccio integra le informazioni sugli anticorpi e le sequenze del genoma vicino in un singolo prodotto del DNA di legatura di prossimità. Consentendo esperimenti ripetuti con la stessa singola cellula, questo metodo consente un aumento della densità dei dati da una cellula rara e analisi statistiche utilizzando solo IgG e dati anticorpali dalla stessa cellula. Le singole cellule riutilizzabili preparate con questo metodo possono essere conservate per almeno alcuni mesi e riutilizzate in seguito per ampliare la caratterizzazione epigenetica e aumentare la densità dei dati. Questo metodo offre flessibilità ai ricercatori e ai loro progetti.

Le singole celle K562 sono state generate utilizzando il protocollo descritto nel passaggio 8 (vedere la Figura 5). Le singole celle sono state incorporate nello strato esterno della perla di poliacrilammide. Il DNA cellulare è stato colorato e visualizzato utilizzando un colorante intercalatore per la colorazione del DNA.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63456/63456fig05.jpg"> Figu...

Il presente protocollo descrive un metodo a singola cellula per analisi epigenomiche iterative utilizzando una singola cellula riutilizzabile. La singola cellula riutilizzabile consente l'analisi di più segni epigenetici nella stessa singola cellula e la convalida statistica dei risultati.

Singola cellula riutilizzabile per analisi epigenomiche iterative

Current single-cell epigenome analyses are designed for single use. The cell is discarded after a single use, preventing analysis of multiple epigenetic ...

Questo metodo sperimentale consente la conservazione a lungo termine delle singole cellule riutilizzabili per i test epigenomici. Permette inoltre l'analisi di molti segni epigenetici e fattori di trascrizione nella stessa singola cellula. Negli attuali metodi per l'analisi dell'epigenoma a singola cellula, le stesse singole cellule non possono essere rianalizzate.Tuttavia, con singole celle riutilizzabili, le stesse singole cellule possono essere rianalizzate molte volte. Questa tecnica è utile per la diagnosi e la progettazione della terapia epigenetica, in particolare quando le cellule del paziente sono limitate in numero. Questo metodo è più adatto allo studio dell'epigenoma, alla regolazione dell'espressione genica e ad altri sistemi purché siano disponibili anticorpi specifici per i marchi epigenetici.Quando provi per la prima volta questa tecnica, ti consigliamo di esercitarti su campioni non troppo preziosi e di convalidare l'esperimento utilizzando un sequenziamento superficiale come MiSeq o iSeq 100. Per iniziare, in una cappa a flusso laminare pulita, mescolare un millilitro di sospensione cellulare e 199 millilitri di un PBS EDTA millimolare contenente un colorante intercalatore per il DNA. Dopo la miscelazione, trasferire 200 microlitri della sospensione cellulare in ciascun pozzetto della piastra a fondo piatto a 96 pozzetti.Posizionare il coperchio sulla piastra a 96 pozzetti e scansionare la lastra utilizzando un microscopio a scansione. Quindi, inclinare la piastra e attendere alcuni minuti fino a quando la singola cella non è affondata sul bordo inferiore del pozzo. Quindi posizionare la punta della pipetta nell'angolo inferiore e trasferire la singola cella e il tampone in una provetta PCR.Controllare il pozzetto utilizzando un microscopio a fluorescenza per confermare il trasferimento. Se una singola cellula è ancora nel pozzo, aggiungere 200 microlitri per pozzetto di un PBS EDTA millimolare contenente un colorante intercalatore per il DNA e ripetere il trasferimento. Dopo il trasferimento, posizionare un coperchio sulla piastra PCR a 96 pozzetti e centrifugare la piastra utilizzando un rotore oscillante senza interruzioni.Dopo la centrifugazione, posizionare la piastra sul ponte di un robot automatico per la movimentazione dei liquidi. Quindi, trascinare e rilasciare il codice supplementare uno nella finestra del software del robot di gestione dei liquidi ed eseguire il programma per rimuovere 195 microlitri di surnatante con una velocità di pipettaggio molto lenta. Aggiungere 50 microlitri di 4% TEMED o olio minerale e incubare la piastra durante la notte a temperatura ambiente.Il giorno successivo, rimuovere l'olio minerale mediante pipettaggio e lavare le cellule cinque volte con 200 microlitri di tampone negativo al magnesio TP. Dopo l'ultimo lavaggio, rimuovere il surnatante, aggiungere 15 microlitri di tampone di ricottura e incubare sul ghiaccio per un'ora. Dopo l'incubazione, posizionare i tubi PCR su un termociclatore e riscaldare a 94 gradi Celsius per tre minuti.Quindi trasferire i tubi in un blocco metallico raffreddato a ghiaccio e incubare per due minuti. Quindi, aggiungere quattro microlitri di cloruro di solfato di magnesio-sodio, mescolare DNTP e mescolare a vortice alla massima velocità. Quindi aggiungere un microlitro di grande frammento di polimerasi BST, mescolare per vortice e incubare per quattro ore su uno shaker.Dopo l'incubazione, posizionare il tubo PCR su un termociclatore ed eseguire un programma di quattro ore o durante la notte come descritto nel testo. Per il legame anticorpale, aggiungere 1,625 microlitri di soluzione di cloruro di sodio EDTA BSA al tubo. Mescolare vorticando a bassa velocità e incubare il tubo sul ghiaccio per un'ora.Quindi aggiungere 0,1 microgrammi per millilitro di anticorpo e controllare le IgG coniugate con la sonda anticorpale. Dopo aver aggiunto gli anticorpi, incubare i tubi sul ghiaccio con un leggero scuotimento. Il giorno successivo, lavare le celle due volte con 200 microlitri di tampone TPM-T su ghiaccio.Quindi rimuovere il surnatante e lavare una volta con tampone T4 DNA ligasi. Quindi, aggiungere 19 microlitri di soluzione adattatore di legatura e incubare per un'ora a 25 gradi Celsius. Quindi, aggiungere un microlitro di DNA ligasi T4 e mescolare il tubo vorticando a velocità media.Posizionare il tubo su un termociclatore ed eseguire il programma di legatura di prossimità. Dopo la corsa, lavare le cellule due volte con 200 microlitri di tampone positivo EDTA negativo al magnesio BST e conservare le cellule durante la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno seguente, lavare le cellule due volte con 200 microlitri di tampone negativo EDTA negativo al magnesio BST e aggiungere 20 microlitri di una miscela contenente BST, DNTP e solfato di magnesio.Quindi mescolare con un miscelatore a vortice e incubare il tubo per quattro ore su uno shaker orbitale. Dopo l'incubazione, posizionare il tubo su un termociclatore ed eseguire il programma di estensione completo come descritto nel manoscritto testuale. Successivamente, per l'amplificazione a spostamento multiplo, aggiungere 0,4 microlitri di 100 micromolari di secondo primer casuale e mescolare per vortice.Quindi, incubare il tubo per due ore su uno shaker orbitale prima di posizionare il tubo su un termociclatore per il riscaldamento a 94 gradi Celsius. Dopo tre minuti, posizionare i tubi in un blocco metallico raffreddato a ghiaccio e aggiungere un microlitro di DNA polimerasi BST. Vortice i tubi a bassa velocità.Quindi posizionare i tubi su un termociclatore per eseguire il programma di amplificazione a spostamento multiplo. Dopo il programma, trasferire circa 20 microlitri di surnatante in un tubo PCR e conservarlo a meno 80 gradi Celsius. Quindi, aggiungere 20 microlitri di tampone TWEEN 20 e 0,1X TE allo 0,05% a un tubo PCR contenente la singola cellula riutilizzabile e incubare il tubo durante la notte a quattro gradi Celsius.Il giorno seguente, raccogliere il surnatante e combinarlo con il surnatante raccolto in precedenza. Quindi, immergere la singola cellula riutilizzabile e il tampone TBS contenente il 50% di glicerolo, cinque millimolari EDTA, 0,5% BSA e 0,05% TWEEN 20, quindi incubarlo per 30 minuti su uno shaker orbitale. Dopo l'incubazione, conservare la singola cella riutilizzabile a meno 20 gradi Celsius fino a un ulteriore utilizzo.Infine, aggiungere 40 microlitri di miscela master Exo negativa e posizionare il tubo su un termociclatore per eseguire il programma come descritto nel manoscritto testuale. Le singole celle riutilizzabili K562 sono state generate utilizzando questo protocollo. Le singole cellule sono state incorporate nello strato esterno della perla di poliacrilammide e visualizzate utilizzando un colorante intercalatore per la colorazione del DNA.I prodotti a base di DNA prima e dopo la digestione di BciVI sono mostrati qui. La digestione enzimatica di restrizione ha generato i frammenti attesi da 19 a 20, da 31 a 32, 49 e superiori a 49 coppie di basi. Inoltre, la libreria di DNA costruita è stata analizzata mediante elettroforesi capillare per i prodotti desiderati.I risultati del sequenziamento hanno indicato che le letture mappate uniche dell'anti-istone H3 acetilata lisina 27 e dell'anti-istone H3 trimetilata lisina 27 erano significativamente più numerose rispetto alle IgG di controllo. I segnali di sequenziamento REpi sono stati valutati confrontando i dati di sequenziamento REpi con i dati di sequenziamento ChIP di massa. In media, circa il 91% dei segnali di lisina 27 acetilata H3 dell'istone dal sequenziamento REpi si sovrapponevano ai picchi di lisina 27 acetilata dell'istone H-3 nel sequenziamento ChIP di massa.La precisione del sequenziamento REpi per il segno istonico inattivo, istone H3 trimetilata lisina 27 era 52% La sensibilità del sequenziamento REpi è stata analizzata per misurare quanti picchi di sequenziamento ChIP di massa sono stati rilevati dal sequenziamento REpi riprodotto letture. La sensibilità del sequenziamento REpi è stata del 55,30% nell'istone H3 acetilata lisina 27 e del 50,94% nell'istone H3 trimetilata lisina 27. Assicurati di utilizzare reagenti privi di DNS.Inoltre, tutte le operazioni che coinvolgono i cavi del tubo di apertura o i cavi del reagente devono essere eseguite in una cappa pulita. I prodotti del DNA di questa procedura vengono sequenziati e quindi mappati sul genoma per rivelare quali modifiche istoniche sono presenti, in quali regioni del genoma in singole cellule. Questa tecnologia ha permesso di analizzare più segni epigenetici nella stessa singola cellula e ha aperto la strada all'analisi multiomica in ogni singola cellula.

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L&#39;analisi del trascrittoma di singole cellule

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