Name: Standardizzazione e mantenimento di colture organoidi epatiche e intestinali canine 3D per luso nella ricerca biomedica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Scopri i protocolli per colture organoidi epatici e intestinali canini 3D. Questo metodo standardizzato consente isolamento, mantenimento e biobanking di cellule staminali per applicazioni in biologia e medicina traslazionale.

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Gli autori vogliono esprimere gratitudine ai dipendenti del Veterinary Diagnostic Laboratory della Iowa State University, vale a dire, Haley M. Lambert, Emily Rahe, Rosalyn M. Branaman, Victoria J. Green e Jennifer M. Groeltz-Thrush, per la tempestiva elaborazione dei campioni forniti. Gli autori desiderano riconoscere il supporto di Faculty Startup, ISU VPR Miller Award, ISU VPR Miller Award e NSF SBIR sub-award a ISU # 1912948.

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K. Allenspach è co-fondatore di LifEngine Animal Health e 3D Health Solutions. È consulente per Ceva Animal Health, Bioiberica, LifeDiagnostics, Antech Diagnostics, Deerland Probiotics e Mars. J. P. Mochel è co-fondatore di LifEngine Animal Health e 3D Health Solutions. Il Dr. Mochel è consulente per Ceva Animal Health ed Ethos Animal Health. Altri autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Attualmente mancano protocolli standardizzati per l'isolamento e il mantenimento degli organoidi epatici e intestinali canini. È necessario stabilire procedure operative standard per le colture organoidi affinché questo modello sia applicabile in diversi ambienti di laboratorio. In particolare, fornire protocolli operativi standardizzati per la coltura di questi modelli di organoidi canini è la chiave per caratterizzare la normale crescita degli organoidi durante la coltura e il passaggio per ricavare punti temporali ottimali per l'espansione e la manutenzione. Gli organoidi intestinali canini coltivati utilizzando il protocollo sono stati precedentemente caratterizzati da Chandra et al.12.
Uno dei passaggi più critici del protocollo è il passaggio degli organoidi. Il momento ottimale per il primo passaggio degli sferoidi epatici è stato determinato il giorno 7 dopo l'isolamento in base alle misurazioni dello sferoide epatico. Il volume massimo di sferoidi è stato raggiunto entro il giorno 7 e, allo stesso tempo, gli sferoidi hanno iniziato a germogliare e formare organoidi epatici. L'aumento del volume complessivo degli organoidi dal giorno 2-7 dopo l'isolamento è stato di oltre 365 volte, suggerendo che il tempo di passaggio ottimale è più lungo della coltura di organoidi intestinali canini. Dopo 7 giorni in coltura, non sono stati osservati segni grossolani di apoptosi cellulare nello sferoide epatico, anche senza pulizia o passaggio (Figura 7). Il passaggio degli organoidi intestinali ed epatici può essere impegnativo in quanto la procedura può portare alla perdita di cellule e all'alterazione della vitalità. I risultati indicano che l'incubazione prolungata di organoidi epatici con proteasi simile alla tripsina (fino a 12 min) non influenza negativamente la sottocoltura. L'incubazione degli organoidi in proteasi simile alla tripsina per più di 24 minuti può essere dannosa per la successiva sottocoltura degli organoidi.
In caso di rottura non ottimale nei cluster cellulari con il passaggio organoide, la dissociazione meccanica invece dell'incubazione prolungata con proteasi simile alla tripsina potrebbe essere più vantaggiosa. Se si riscontrano problemi con una corretta dissociazione degli organoidi, si può tentare di allungare brevemente i campioni per migliorare la resa di passaggio. D'altra parte, il vortice ha il potenziale per rovinare una coltura e danneggiare le cellule, quindi dovrebbe essere usato solo quando altre procedure hanno fallito ripetutamente. Rompere gli organoidi epatici in singole cellule abbassa il tasso di crescita degli organoidi, mentre romperli in gruppi di cellule può migliorare notevolmente la loro vitalità. Dieci minuti sono stati scelti come tempo di incubazione per il protocollo organoide. Un timepoint di incubazione di 12 minuti è stato ritenuto non citotossico rispetto a un'incubazione di 24 minuti nell'esperimento di proteasi simile alla tripsina.
L'esperimento di sopravvivenza ha confermato che gli organoidi epatici canini potrebbero sopravvivere fino a 19,5 giorni in condizioni sfavorevoli (esaurimento strutturale e nutrizionale). Gli organoidi che sono sopravvissuti a queste condizioni più a lungo sono stati coltivati con mezzi CMGF +. Questa osservazione potrebbe essere stata causata dalla crescita più lenta di organoidi epatici in mezzi non integrati con inibitore di Rock e GSK3β. Le colture organoidiche con CMGF+ R/G sono cresciute più velocemente e potrebbero aver esaurito le loro risorse più velocemente. Questo esperimento apre la possibilità di miniaturizzare la coltura di organoidi canini per ottenere una conversione del sistema ad alto rendimento. Tale tecnologia mostra il potenziale per facilitare la scoperta di farmaci o studi tossicologici a un costo sostanzialmente ridotto.
Alcuni problemi comuni riscontrati durante la manutenzione della coltura organoide canina sono la solidificazione impropria del campione durante la placcatura, la contaminazione della coltura e la determinazione della corretta densità e dimensione degli organoidi. Se l'ECM solubilizzato si solidifica prematuramente durante la placcatura, metterlo immediatamente sul ghiaccio per 10 minuti. Se l'ECM solubilizzato non forma strutture a cupola, è probabile che non siano stati rimossi abbastanza mezzi dal campione. In questo caso, diluire il campione con un ECM più solubilizzato fino a formare delle cupole.
Quando la contaminazione fungina o batterica si trova in un'intera piastra (vedere la Figura 4), la soluzione migliore è scartare la piastra. Il trattamento con farmaci antifungini o antibiotici può essere tentato, ma il successo di tale tentativo è estremamente basso. Se un singolo pozzo è contaminato in una piastra, i pozzi vitali e non interessati possono essere puliti (seguire i passaggi da 4.1 a 4.5) su una nuova piastra e monitorati attentamente. Se il campione è già stato congelato di emergenza, è consigliabile scartare l'intero campione, poiché lo scongelamento del campione espone l'incubatore a un ulteriore rischio di contaminazione.
La coltura di organoidi sani dovrebbe essere almeno nella categoria di medie dimensioni e media densità o superiore. La densità ottimale è fondamentale per la crescita della coltura di organoidi. La densità inferiore deve essere corretta pulendo gli organoidi a media densità. Se si verifica la situazione di densità estrema (sovraffollamento), gli organoidi dovrebbero essere espansi a più pozzi. Segni grossolani di apoptosi cellulare spesso accompagnano sia il sovraffollamento che la bassa densità della coltura organoide. Se questi problemi non vengono corretti in tempo, l'intera coltura organoide diventerà apoptotica nel giro di pochi giorni. Se gli organoidi raggiungono dimensioni extra large o densità molto elevate, la coltura deve essere utilizzata per un esperimento, congelamento o fissazione.
Il mezzo organoide contiene attualmente 17 componenti e l'aggiunta di fattori di crescita necessari per la manutenzione e l'espansione degli organoidi può quindi essere costosa. Questo problema può essere risolto coltivando colture cellulari 2D che sintetizzano i fattori di crescita per produrre CMGF+ condizionato. La coltura cellulare L-WRN produce fattori di crescita Wnt-3a, R-Spondin-3 e Noggin37. La colonia cellulare utilizza il 90% di DMEM/F12 e il 10% di terreni di coltura FBS. Quando la cultura raggiunge il 90% di confluenza, i media vengono raccolti ogni giorno per 1 settimana. Il mezzo raccolto viene quindi miscelato con 2x CMGF+ (senza questi fattori di crescita). Mentre le colture 2D possono produrre i fattori di crescita necessari a una frazione del costo, è necessario prevedere il tempo e la preparazione aggiunti per produrre i supporti. Anche le concentrazioni di fattori di crescita tra lotti di mezzi condizionati possono differire37,38.
Le colture organoidi derivate da cellule staminali adulte canine sono un modello biomedico unico che può aiutare a raggiungere gli obiettivi della One Health Initiative39. La tecnologia organoide può essere utilizzata in molte aree di ricerca di base e biomedica, che vanno dalla biologia dello sviluppo, alla fisiopatologia, alla scoperta e ai test di farmaci, alla tossicologia allo studio delle malattie infettive e alla medicina rigenerativa40. La ricerca traslazionale e traslazionale inversa sono entrambe aree in cui sono applicabili gli organoidi canini15. I cani sono stati usati per secoli in contesti sperimentali traslazionali e il loro status di animale da compagnia ha anche facilitato la loro posizione come una delle specie più esplorate in medicina veterinaria.
In conclusione, questo manoscritto fornisce protocolli operativi standardizzati per l'isolamento, la manutenzione, la raccolta e il biobanking di organoidi epatici e intestinali canini per facilitare l'applicazione di questo modello in vari campi biomedici. Questo modello è particolarmente adatto a promuovere la ricerca traslazionale inversa come strumento dell'iniziativa One Health per promuovere la condivisione interdisciplinare e intradisciplinare delle conoscenze.

I roditori sono il modello animale più comunemente utilizzato per la ricerca biomedica e traslazionale1. Sono eccezionalmente utili per studiare la patogenesi molecolare di base delle malattie, sebbene la loro rilevanza clinica per le malattie croniche multifattoriali sia stata recentemente messa in discussione2. Il modello canino presenta diversi vantaggi rispetto ai roditori3,4. Cani e umani condividono somiglianze nella metabolomica e nel microbioma intestinale che si sono sviluppati a causa del consumo di dieta umana durante vari periodi della loro domesticazione5,6,7. Le somiglianze tra anatomia e fisiologia gastrointestinale canina e umana sono un altro degli esempi8.
Inoltre, i cani spesso condividono ambienti e stili di vita simili con i loro proprietari9. La maggiore durata della vita dei cani rispetto ai roditori consente lo sviluppo naturale di numerose condizioni croniche10. La malattia infiammatoria intestinale o la sindrome metabolica sono esempi di malattie croniche multifattoriali che condividono importanti somiglianze tra esseri umani e cani11,12. Gli studi preclinici canini che coinvolgono cani con malattie naturali possono generare dati più affidabili di quelli ottenuti dai modelli di roditori13. Tuttavia, per ridurre al minimo l'uso della ricerca sugli animali vivi e rispettare i principi delle 3R (Ridurre, Raffinare, Sostituire)14, sono emerse alternative ai test in vivo che utilizzano organoidi canini 3D in vitro15.
Gli organoidi sono strutture derivate da cellule staminali 3D autoassemblate che ricapitolano la fisiologia e la microanatomia dei loro organi originali16,17. Questa tecnologia è stata descritta per la prima volta da Sato et al. nel 200917 e ha permesso studi in vitro più traducibili in linee cellulari epiteliali di quanto fosse possibile in precedenza utilizzando colture di cellule tumorali 2D18,19,20. Gli organoidi sono modelli utili in vitro in molte discipline biomediche come negli studi tossicologici preclinici21,22,23, di assorbimento o sul metabolismo24,25,26,27,28, nonché in approcci medici personalizzati29,30,31 . La coltura di successo di organoidi intestinali canini è stata descritta per la prima volta nel 201912, mentre gli organoidi epatici derivati da un cane sono stati segnalati per la prima volta da Nantasanti et al. nel 201532. Da allora gli organoidi canini sono stati utilizzati con successo in studi che studiano enteropatie croniche canine, tumori stromali gastrointestinali, adenocarcinoma colorettale12 e malattia di Wilson33,34.
Mentre le cellule staminali adulte possono essere raccolte tramite necropsie, la tecnologia organoide non richiede sempre il sacrificio degli animali. Le biopsie endoscopiche e laparoscopiche, o anche gli aspirati con ago sottile degli organi35, sono una valida fonte di cellule staminali adulte per l'isolamento degli organoidi epiteliali12. L'uso diffuso di tali tecniche non invasive nella pratica veterinaria facilita le opzioni per la ricerca traslazionale inversa (traduzione di informazioni dalla pratica clinica veterinaria alla pratica clinica umana e viceversa)15. Un ulteriore progresso della tecnologia degli organoidi può essere garantito dalla standardizzazione dei metodi di coltura e manutenzione degli organoidi. Il protocollo organoide qui presentato è parzialmente basato sul lavoro precedentemente pubblicato di Saxena et al. dal 201536 e i metodi sono stati adattati per adattarsi alle specifiche della coltura organoide intestinale ed epatica canina. Il flusso di lavoro complessivo dei protocolli organoidi canini è illustrato nella Figura 1.
Il protocollo di isolamento degli organoidi canini introduce metodi per ottenere campioni da biopsie endoscopiche, laparoscopiche e chirurgiche, nonché necropsie. Delinea il pretrattamento iniziale dei campioni di tessuto e le metodologie utilizzate per il trasporto in laboratorio. I materiali e i reagenti necessari per l'isolamento organoide sono riassunti nella sezione "Preparazione per l'isolamento". Il processo di isolamento delle cellule staminali adulte dai campioni di tessuto è ulteriormente descritto in dettaglio. Infine, viene discusso il processo di placcatura degli organoidi in strutture a cupola utilizzando una matrice di membrana extracellulare solubilizzata.
Il secondo protocollo, Canine Organoid Maintenance Protocol, descrive i metodi di documentazione e coltura degli organoidi. I cambiamenti dei media e la loro frequenza sono discussi in questa sezione. Inoltre, vengono descritte le procedure di laboratorio come il passaggio e la pulizia delle colture cellulari, essenziali per garantire il corretto mantenimento degli organoidi canini 3D. Il passaggio appropriato è un passaggio critico del protocollo e le possibili regolazioni e la risoluzione dei problemi di questo passaggio sono discussi ulteriormente nel manoscritto.
L'ultimo protocollo è Canine Organoid Harvesting and Biobanking Protocol contenente metodi per la preparazione di organoidi adulti per l'incorporamento di paraffina e la conservazione dell'RNA. Qui vengono descritti anche i metodi di biobanking dei campioni organoidi nello stoccaggio dell'azoto liquido. Infine, vengono discussi i modi per scongelare i campioni congelati e sostenere la loro crescita.
In conclusione, questo articolo mira a fornire procedure coerenti di coltura di organoidi canini attraverso la standardizzazione di protocolli inter-laboratorio. In tal modo, il manoscritto mira a facilitare la riproducibilità dei dati derivati da modelli organoidi canini per aumentare la loro rilevanza nella ricerca biomedica traslazionale.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63515/63515fig01.jpg"> Figura 1: Flusso di lavoro dei protocolli organoidi canini. Il Canine Organoid Isolation Protocol descrive la preparazione dei materiali necessari per l'isolamento organoide, la raccolta di un campione di tessuto (attraverso necropsie, biopsie endoscopiche, laparoscopiche e chirurgiche) e le linee guida sulla dissociazione cellulare e la placcatura della popolazione cellulare. Il Canine Organoid Maintenance Protocol discute la pulizia e il passaggio della coltura organoide. L'Organoid Harvesting and Biobanking Protocol discute la preparazione di campioni organoidi per l'incorporamento di paraffina e un'ulteriore caratterizzazione degli organoidi. Vengono inoltre discussi i metodi per biobancare le colture organoidi e farle rivivere dallo stoccaggio in azoto liquido. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63515/63515fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table><tbody><tr><td><forte>Soluzione chelante</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-Sorbitolo</td><td>Fisher Chemical</td><td>BP439-500</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Promega</td><td>V3151</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P5655-100G</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4-2H2O</td><td></td><td>Sigma S5136-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Fisher Chemical</td><td>S5-500</td><td></td></tr><tr><td>Organoid media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>[Leu15]-gastrina I umana</td><td>Sigma</td><td>G9145-.5MG</td><td></td></tr><tr><td>A-83-01</td><td>PeproTech</td><td>9094360</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplemento</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>VWR Life Science</td><td>J848-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Umano R-Spondin-1</td><td>PeproTech</td><td>120-38-500UG</td><td></td></tr><tr><td>Murino EGF</td><td>PeproTech</td><td>315-09-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Murino Noggin</td><td>PeproTech</td><td>250-38-250UG</td><td></td></tr><tr><td>Murino Wnt-3a</td><td>PeproTech</td><td>315-20-10UG</td><td></td></tr><tr><td>N2 supplemento</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>N-acetil-L-cisteina</td><td>Sigma</td><td>A9165-25G</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma</td><td>N0636-100G</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-1</td><td></td></tr><tr><td>ROCK inibitore (Y-27632)</td><td>EMD Millipore Corp.</td><td>SCM 075</td><td></td></tr><tr><td>SB202190 (inibitore di P38)</td><td>Sigma</td><td>S7067-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Stemolecule CHIR99021 (GSK3&beta;)</td><td>Reprocell</td><td>04-0004-base</td><td></td></tr><tr><td>Trimetoprim</td><td>Sigma</td><td>T7883-5G</td><td></td></tr><tr><td>Sulfametossazolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7507-10G</td><td></td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acido acetico, Glaciale</td><td>Fisher Chemical</td><td>A38-500</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil solfossido (DMSO)</td><td>Fisher Chemicals</td><td>D128-500</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, pH 8,0, 0,5 M</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>Formaldeide (37%)</td><td>Fisher Chemical</td><td>F79P-4</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di glutaraldeide</td><td>Sigma</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>Matrice Matrigel per coltura di organoidi</td><td>Corning</td><td>356255</td><td>Matrice di membrana extracellulare</td></tr><tr><td>Paraformaldeide, 97%</td> <td>Alfa Aesar</td><td>A11313</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 1X (soluzione salina tamponata con fosfato)</td><td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 1X (soluzione salina tamponata con fosfato)</td><td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>RNAlater Soln.</td><td>Invitrogen</td><td>AM7021</td><td>Reagente per la conservazione dell'RNA</td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12604-021</td><td>Proteasi simile alla tripsina</td></tr><tr><td><forte>Altro</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6 pozzetti Piastra per colture cellulari</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>ACD Hybez II Sistema di ibridazione</td><td>ACD a biotechne marca</td><td>321710</td><td></td></tr><tr><td>Provetta da centrifuga, 15 mL</td><td>Corning</td><td>430766</td><td></td></tr><tr><td>CoolCell LX</td><td>Corning</td><td>BCS-405MC</td><td></td></tr><tr><td>Fiale criogeniche</td><td>Corning</td><td>430488</td><td></td></tr><tr><td>Provetta da centrifuga monouso (50 mL)</td><td>Fisherbrand</td><td>05-539-13</td><td></td></tr><tr><td>GyroMini Miscelatore nutante (bilanciere)</td><td>Labnet</td><td>S0500-230V-EU</td><td></td></tr><tr><td>Bagno di calore</td><td>Lab-Line Instruments</td><td>3000</td><td></td></tr><tr><td>Mr. Frosty Contenitore di congelamento</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>ND2000CLAPTOP SpettrofotometroAnalisi</td></tr><tr><td>Incubatore Panasonic</td><td>Panasonic</td><td>MCO-170ML-PA</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M Film di avvolgimento</td><td>Bemis Company Inc</td><td>PM996/EMD</td><td>Nastro in film flessibile</td></tr><tr><td>da laboratorio protetto monouso Bisturi</td><td>Bard-Parker</td><td>239844</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope 2.5 HD Saggio &ndash; RED</td><td>ACD un marchio biotechne</td><td>322350</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope H2O2 & Reagenti Protease Plus</td><td>ACD un marchio biotechne</td><td>322330</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope Target Retrieval Reagents</td><td>ACD un marchio biotechne</td><td>322000</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope Wash Buffer Reagents</td><td>ACD un marchio biotechne</td><td>310091</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Culture Dish Dot</td><td>Scientific</td><td>6676621</td><td></td></tr><tr><td>Piastra per coltura tissutale 24 pozzetti</td><td>Fisherbrand</td><td>FB012929</td><td></td></tr></tbody></table>

standardizzazione e mantenimento di colture organoidi epatiche e intestinali canine 3d per l'uso nella ricerca biomedica

Standardization and Maintenance of 3D Canine Hepatic and Intestinal Organoid Cultures for Use in Biomedical Research

I cani sviluppano malattie multifattoriali complesse analoghe agli esseri umani, tra cui malattie infiammatorie, malattie metaboliche e cancro. Pertanto, rappresentano modelli animali di grandi dimensioni rilevanti con il potenziale traslazionale della medicina umana. Gli organoidi sono strutture 3-dimensionali (3D), auto-assemblate derivate da cellule staminali che imitano la microanatomia e la fisiologia del loro organo di origine. Questi modelli traslazionali in vitro possono essere utilizzati per applicazioni di permeabilità e scoperta di farmaci, valutazione tossicologica e per fornire una comprensione meccanicistica della fisiopatologia delle malattie croniche multifattoriali. Inoltre, gli organoidi canini possono migliorare la vita dei cani da compagnia, fornendo input in varie aree della ricerca veterinaria e facilitando applicazioni di trattamento personalizzate in medicina veterinaria. Un piccolo gruppo di donatori può creare una biobanca di campioni di organoidi, riducendo la necessità di una raccolta continua di tessuti, poiché le linee cellulari organoidi possono essere sottocolturate a tempo indeterminato. Qui vengono presentati tre protocolli che si concentrano sulla coltura di organoidi canini intestinali ed epatici derivati da cellule staminali adulte. Il Canine Organoid Isolation Protocol delinea i metodi per elaborare il tessuto e l'incorporamento dell'isolato cellulare in una matrice di supporto (matrice di membrana extracellulare solubilizzata). Il canino Organoid Maintenance Protocol descrive la crescita e la manutenzione degli organoidi, compresa la pulizia e il passaggio insieme ai tempi appropriati per l'espansione. L'Organoid Harvesting and Biobanking Protocol descrive i modi per estrarre, congelare e conservare gli organoidi per ulteriori analisi.

Vengono descritti metodi sperimentali per raccogliere cellule staminali adulte da tessuti intestinali ed epatici canini per stabilire colture organoidi 3D. Inoltre, vengono discusse le tecniche di laboratorio per garantire una crescita costante e fornire procedure operative standard per raccogliere, biobancare e far rivivere colture organoidi intestinali ed epatiche canine.

Standardizzazione e mantenimento di colture organoidi epatiche e intestinali canine 3D per l'uso nella ricerca biomedica

Dogs develop complex multifactorial diseases analogous to humans, including inflammatory diseases, metabolic diseases, and cancer. Therefore, they ...

I protocolli per la coltura di organoidi epatici e intestinali canini sono importanti per standardizzare questa nuova tecnologia. Questa tecnica consente l'istituzione affidabile e riproducibile della coltura organoide canina, compreso l'isolamento organoide, la manutenzione, la raccolta e il successivo biobanking dei campioni. Gli organoidi canini possono fornire un modello eccellente per numerose applicazioni che vanno dalla biologia, allo sviluppo di malattie infettive, ai test e alla scoperta di farmaci e anche alla medicina di trasmissione.Per iniziare, preparare cinque tubi centrifughi da 15 millilitri con cinque millilitri di soluzione chelante completa 1X, un tubo con tre millilitri di soluzione chelante completa 1X, un tubo vuoto e un tubo con cinque millilitri di soluzione chelante completa 1X e due millilitri di siero bovino fetale. Il giorno dell'isolamento, metti una capsula di Petri sterile, un bisturi, un secchiello per il ghiaccio e una miscela di nutrienti DMEM avanzati F12 nell'armadio di biosicurezza. Posizionare il numero richiesto di piastra di coltura cellulare a 24 pozzetti nell'incubatore di anidride carbonica per preriscaldarsi.Posizionare la matrice di membrana extracellulare solubilizzata sul ghiaccio per lo scongelamento. Pre-raffreddare la centrifuga a quattro gradi Celsius. Spostare i supporti completi con fattori di crescita dal congelatore a un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius evitando l'esposizione diretta alla luce.Agitare i campioni di tessuto nel tubo di trasporto per 30 secondi. Rimuovere il surnatante eccessivo senza scartare alcun tessuto mediante lento pipettaggio vicino alla superficie del fluido fino a quando non rimangono 0,5 millilitri nel tubo. Trasferire il tessuto e il surnatante rimanente in una capsula di Petri sterile.Usando un bisturi usa e getta, tagliare e tritare il tessuto in pezzi più piccoli che assomigliano a una consistenza di poltiglia per circa cinque minuti. Pipettare il tessuto tritato con liquido dalla capsula di Petri al primo tubo completo della soluzione chelante, quindi aggiungere due millilitri di miscela di nutrienti DMEM avanzati F12 alla capsula di Petri. Lavare il tessuto rimanente e trasferirlo al primo tubo di soluzione chelante completo.Vortice del tubo della soluzione chelante completa 1X circa cinque volte per cinque secondi. Lasciare che le biopsie si depositino sul fondo del tubo per un minuto e rimuovere il surnatante fino a quando non rimangono cinque millilitri. Trasferire la soluzione chelante completa 1X dalla nuova provetta alla provetta campione.Ripetere il passaggio precedente per i due tubi seguenti. E negli ultimi due lavaggi, rimuovere il surnatante fino a tre millilitri rimanenti nel tubo. Trasferire le biopsie e la soluzione chelante completa 1X dalla provetta del campione a un pozzetto di una piastra a sei pozzetti.Aggiungere tre millilitri di soluzione chelante completa 1X alla provetta del campione. Ruotare delicatamente per raccogliere il tessuto rimanente e trasferirlo nello stesso pozzetto della piastra. Aggiungere 150 microlitri di acido tetraacetico etilene diammina molare 0,5 molare in un pozzetto e posizionare la piastra a sei pozzetti su un bilanciere a 20 gradi a 24 rpm a quattro gradi Celsius.Incubare i campioni di fegato per 10 minuti e i campioni intestinali per un'ora sul bilanciere in movimento. Trasportare la piastra a sei pozzetti nell'armadio di biosicurezza e trasferire il tessuto e il liquido tritati in un tubo contenente 1 soluzione chelante completa 1X con siero bovino fetale. Lasciare che i tessuti si depositino e trasportare il surnatante con 0,2 millilitri della parte superiore del tessuto in un tubo vuoto.Girare verso il basso il tubo contenente il campione a 700 XG per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Le cellule staminali sono ora pellettate insieme al tessuto tritato. Rimuovere ed eliminare il surnatante con attenzione per non disturbare il pellet.Risospesciare il pellet in DMEM F12 avanzato. Ruotare nuovamente il tubo e aspirare il surnatante senza disturbare il pellet. Aggiungere il volume calcolato della matrice di membrana extracellulare solubilizzata alla provetta campione.Fare attenzione quando si rimuovono i supporti in modo da non perdere il pellet cellulare. Quando si aggiunge una matrice di membrana extracellulare, pipettare lentamente per non creare bolle eccessive nella sospensione organoide. Mantenere il campione con la matrice di membrana extracellulare solubilizzata su ghiaccio e seminare la sospensione nel mezzo dei pozzetti in modo che la matrice di membrana extracellulare solubilizzata formi una struttura a cupola.Trasportare la piastra in un incubatore e consentire alla matrice di membrana extracellulare solubilizzata di solidificarsi per 30 minuti. Mescolare l'inibitore ROCK e GSK3 beta in supporti completi con fattori di crescita e aggiungere 500 microlitri di questa soluzione ad ogni pozzo. Posizionare il piatto nell'incubatrice.Il protocollo organoide canino genera in genere circa 50.000-150.000 cellule intestinali o epatiche per pozzo. Dopo l'isolamento delle cellule staminali, gli organoidi canini epatici iniziano il loro ciclo di vita come sferoidi in espansione e, dopo sette giorni, si trasformano in organoidi in erba e differenzianti. Sono stati calcolati il volume, la superficie, l'area dell'ellisse 2D e la circonferenza degli sferoidi.L'area e la circonferenza dell'ellisse 2D sono state utilizzate per valutare la salute della coltura organoide. La valutazione dell'espressione dei marcatori in modo semi-quantitativo ha mostrato che gli sferoidi esprimevano preferenzialmente il marcatore dei colangiociti KRT7 che andava da uno al 26% L'espressione del marcatore delle cellule staminali LGR5 variava tra lo 0,17 e lo 0,78%, mentre i marcatori epatocitari erano espressi in misura inferiore dallo 0,05 allo 0,34% per forkhead box 1A e dallo 0,03 allo 0,28% per il citocromo-P450. Un'incubazione di 12 minuti con proteasi simile alla tripsina non ha inibito la crescita organoide.Tuttavia, la crescita degli organoidi è stata influenzata negativamente utilizzando un'incubazione di 24 minuti. La sopravvivenza degli organoidi epatici canini in un ambiente sfavorevole è stata analizzata per determinare il volume di mezzi organoidi e matrice basale necessari per la crescita e la sopravvivenza di successo degli organoidi epatici. Il tasso di sopravvivenza degli organoidi variava da 12,9 giorni a 18 giorni.Le tecniche di coltura cellulare di base e gli approcci asettici sono i prerequisiti essenziali per un corretto isolamento e mantenimento degli organoidi.

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Questo protocollo descrive la produzione di un sistema di 3-dimensionale organoid del mouse dei dotti biliari extrahepatic. Questi organoids biliare può essere mantenute in coltura per studiare biologia dei colangiociti. Organoids biliare esprimono marcatori di cellule progenitrici e cellule biliari e sono composte da cellule epiteliali polarizzate.

Generazione dei Organoids da dotti biliari Extrahepatic Mouse

Le colture tridimensionali di campioni di BMPC pazienti e xenografi del carcinoma della prostata metastatica ossea mantengono l'eterogeneità funzionale dei loro tumori originali con conseguenti cisti, sferoidi e organoidi complessi simili a tumori. Questo manoscritto fornisce una strategia di ottimizzazione e un protocollo per la cultura 3D di campioni eterogenei derivati dai pazienti e la loro analisi utilizzando IFC.

Istituzione e analisi di organidi tridimensionali (3D) Derivati dagli spettri della metastasi ossea del cancro della prostata del paziente e dai loro xenoinfi

L'intera struttura 3D e il contenuto cellulare degli organoidi, così come la loro somiglianza fenotipica con il tessuto originale possono essere catturati utilizzando il protocollo di imaging 3D a risoluzione singola descritto qui. Questo protocollo può essere applicato a una vasta gamma di organoidi che variano in origine, dimensione e forma.

Risoluzione a una cellula di immagini tridimensionali di organoidi intatti

Qui, presentiamo un protocollo che descrive la coltura di organoidi intestinali canini in un sistema di supporto permeabile a doppia camera. Vengono descritti la semina organoide nei supporti permeabili, il mantenimento del monostrato e i successivi esperimenti di permeabilità ai farmaci.

Organoidi intestinali canini in un sistema di supporto permeabile a doppia camera

Qui, descriviamo un metodo per generare organoidi di glioblastoma (GBM) da campioni di pazienti primari o colture cellulari derivate dal paziente e mantenerli fino alla maturità. Questi organoidi GBM contengono popolazioni cellulari fenotipicamente diverse e ricreano microambienti tumorali ex vivo.

Mantenimento della diversità cellulare del glioblastoma umano ex vivo utilizzando la coltura di organoidi tridimensionali

L'integrazione di organoidi intestinali canini e di un sistema microfluidico Gut-on-a-Chip offre modelli traslazionali rilevanti per le malattie intestinali umane. I protocolli presentati consentono la morfogenesi 3D e la modellazione dinamica in vitro dell'intestino, aiutando nello sviluppo di trattamenti efficaci per le malattie intestinali nei cani e negli esseri umani con One Health.

Morfogenesi tridimensionale nell'intestino su chip canino utilizzando organoidi intestinali derivati da pazienti con malattie infiammatorie intestinali

Gli enteroidi stanno emergendo come un nuovo modello per lo studio della fisiologia e della fisiopatologia dei tessuti, dello sviluppo di farmaci e della medicina rigenerativa. Qui, descriviamo un sistema di coltura derivato da enteroidi 2D di cellule primarie bovine che consente la co-coltura con i tipi di cellule tissutali rilevanti. Questo modello offre un vantaggio traslazionale per la modellazione della ricerca gastrointestinale.

Generazione di un sistema di coltura monostrato bidimensionale di derivazione enteroide primaria bovina per applicazioni nella ricerca biomedica traslazionale

Questo protocollo presenta una tecnica ottimizzata di perfusione epatica della collagenasi in due fasi in un modello di ratto e mostra l'uso di epatociti isolati per la coltura in vitro a lungo termine di organoidi 3D.

Perfusione epatica di ratto e isolamento degli epatociti primari: una vecchia procedura cruciale per la coltura di organoidi 3D all'avanguardia

Questo studio delinea un protocollo per la generazione di monostrati 2D di organoidi suini derivati dall'intestino tenue e crasso. La crescita di questi monostrati è contrassegnata da valori TEER crescenti, che indicano una robusta integrità epiteliale. Inoltre, questi monostrati mostrano risposte secretorie fisiologiche negli esperimenti della camera di Ussing dopo l'applicazione della forskolina.

Organoidi intestinali suini bidimensionali che riflettono le proprietà fisiologiche dell'intestino nativo

Descriviamo un metodo minimamente invasivo e indolore per misurare la forza muscolare degli arti posteriori del cane e la risposta muscolare alle ripetute contrazioni eccentriche.

In Vivo saggio canina funzione muscolare

Scopri i protocolli per colture organoidi epatici e intestinali canini 3D. Questo metodo standardizzato consente isolamento, mantenimento e biobanking di cellule staminali per applicazioni in biologia e medicina traslazionale.

Standardizzazione e mantenimento di colture organoidi epatiche e intestinali canine 3D per l'uso nella ricerca biomedica

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