Standardizzazione e mantenimento di colture organoidi epatiche e intestinali canine 3D per l'uso nella ricerca biomedica
January 31st, 2022
Vengono descritti metodi sperimentali per raccogliere cellule staminali adulte da tessuti intestinali ed epatici canini per stabilire colture organoidi 3D. Inoltre, vengono discusse le tecniche di laboratorio per garantire una crescita costante e fornire procedure operative standard per raccogliere, biobancare e far rivivere colture organoidi intestinali ed epatiche canine.
I protocolli per la coltura di organoidi epatici e intestinali canini sono importanti per standardizzare questa nuova tecnologia. Questa tecnica consente l'istituzione affidabile e riproducibile della coltura organoide canina, compreso l'isolamento organoide, la manutenzione, la raccolta e il successivo biobanking dei campioni. Gli organoidi canini possono fornire un modello eccellente per numerose applicazioni che vanno dalla biologia, allo sviluppo di malattie infettive, ai test e alla scoperta di farmaci e anche alla medicina di trasmissione.
Per iniziare, preparare cinque tubi centrifughi da 15 millilitri con cinque millilitri di soluzione chelante completa 1X, un tubo con tre millilitri di soluzione chelante completa 1X, un tubo vuoto e un tubo con cinque millilitri di soluzione chelante completa 1X e due millilitri di siero bovino fetale. Il giorno dell'isolamento, metti una capsula di Petri sterile, un bisturi, un secchiello per il ghiaccio e una miscela di nutrienti DMEM avanzati F12 nell'armadio di biosicurezza. Posizionare il numero richiesto di piastra di coltura cellulare a 24 pozzetti nell'incubatore di anidride carbonica per preriscaldarsi.
Posizionare la matrice di membrana extracellulare solubilizzata sul ghiaccio per lo scongelamento. Pre-raffreddare la centrifuga a quattro gradi Celsius. Spostare i supporti completi con fattori di crescita dal congelatore a un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius evitando l'esposizione diretta alla luce.
Agitare i campioni di tessuto nel tubo di trasporto per 30 secondi. Rimuovere il surnatante eccessivo senza scartare alcun tessuto mediante lento pipettaggio vicino alla superficie del fluido fino a quando non rimangono 0,5 millilitri nel tubo. Trasferire il tessuto e il surnatante rimanente in una capsula di Petri sterile.
Usando un bisturi usa e getta, tagliare e tritare il tessuto in pezzi più piccoli che assomigliano a una consistenza di poltiglia per circa cinque minuti. Pipettare il tessuto tritato con liquido dalla capsula di Petri al primo tubo completo della soluzione chelante, quindi aggiungere due millilitri di miscela di nutrienti DMEM avanzati F12 alla capsula di Petri. Lavare il tessuto rimanente e trasferirlo al primo tubo di soluzione chelante completo.
Vortice del tubo della soluzione chelante completa 1X circa cinque volte per cinque secondi. Lasciare che le biopsie si depositino sul fondo del tubo per un minuto e rimuovere il surnatante fino a quando non rimangono cinque millilitri. Trasferire la soluzione chelante completa 1X dalla nuova provetta alla provetta campione.
Ripetere il passaggio precedente per i due tubi seguenti. E negli ultimi due lavaggi, rimuovere il surnatante fino a tre millilitri rimanenti nel tubo. Trasferire le biopsie e la soluzione chelante completa 1X dalla provetta del campione a un pozzetto di una piastra a sei pozzetti.
Aggiungere tre millilitri di soluzione chelante completa 1X alla provetta del campione. Ruotare delicatamente per raccogliere il tessuto rimanente e trasferirlo nello stesso pozzetto della piastra. Aggiungere 150 microlitri di acido tetraacetico etilene diammina molare 0,5 molare in un pozzetto e posizionare la piastra a sei pozzetti su un bilanciere a 20 gradi a 24 rpm a quattro gradi Celsius.
Incubare i campioni di fegato per 10 minuti e i campioni intestinali per un'ora sul bilanciere in movimento. Trasportare la piastra a sei pozzetti nell'armadio di biosicurezza e trasferire il tessuto e il liquido tritati in un tubo contenente 1 soluzione chelante completa 1X con siero bovino fetale. Lasciare che i tessuti si depositino e trasportare il surnatante con 0,2 millilitri della parte superiore del tessuto in un tubo vuoto.
Girare verso il basso il tubo contenente il campione a 700 XG per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Le cellule staminali sono ora pellettate insieme al tessuto tritato. Rimuovere ed eliminare il surnatante con attenzione per non disturbare il pellet.
Risospesciare il pellet in DMEM F12 avanzato. Ruotare nuovamente il tubo e aspirare il surnatante senza disturbare il pellet. Aggiungere il volume calcolato della matrice di membrana extracellulare solubilizzata alla provetta campione.
Fare attenzione quando si rimuovono i supporti in modo da non perdere il pellet cellulare. Quando si aggiunge una matrice di membrana extracellulare, pipettare lentamente per non creare bolle eccessive nella sospensione organoide. Mantenere il campione con la matrice di membrana extracellulare solubilizzata su ghiaccio e seminare la sospensione nel mezzo dei pozzetti in modo che la matrice di membrana extracellulare solubilizzata formi una struttura a cupola.
Trasportare la piastra in un incubatore e consentire alla matrice di membrana extracellulare solubilizzata di solidificarsi per 30 minuti. Mescolare l'inibitore ROCK e GSK3 beta in supporti completi con fattori di crescita e aggiungere 500 microlitri di questa soluzione ad ogni pozzo. Posizionare il piatto nell'incubatrice.
Il protocollo organoide canino genera in genere circa 50.000-150.000 cellule intestinali o epatiche per pozzo. Dopo l'isolamento delle cellule staminali, gli organoidi canini epatici iniziano il loro ciclo di vita come sferoidi in espansione e, dopo sette giorni, si trasformano in organoidi in erba e differenzianti. Sono stati calcolati il volume, la superficie, l'area dell'ellisse 2D e la circonferenza degli sferoidi.
L'area e la circonferenza dell'ellisse 2D sono state utilizzate per valutare la salute della coltura organoide. La valutazione dell'espressione dei marcatori in modo semi-quantitativo ha mostrato che gli sferoidi esprimevano preferenzialmente il marcatore dei colangiociti KRT7 che andava da uno al 26% L'espressione del marcatore delle cellule staminali LGR5 variava tra lo 0,17 e lo 0,78%, mentre i marcatori epatocitari erano espressi in misura inferiore dallo 0,05 allo 0,34% per forkhead box 1A e dallo 0,03 allo 0,28% per il citocromo-P450. Un'incubazione di 12 minuti con proteasi simile alla tripsina non ha inibito la crescita organoide.
Tuttavia, la crescita degli organoidi è stata influenzata negativamente utilizzando un'incubazione di 24 minuti. La sopravvivenza degli organoidi epatici canini in un ambiente sfavorevole è stata analizzata per determinare il volume di mezzi organoidi e matrice basale necessari per la crescita e la sopravvivenza di successo degli organoidi epatici. Il tasso di sopravvivenza degli organoidi variava da 12,9 giorni a 18 giorni.
Le tecniche di coltura cellulare di base e gli approcci asettici sono i prerequisiti essenziali per un corretto isolamento e mantenimento degli organoidi.
Panoramica
Questo articolo descrive metodi sperimentali per raccogliere cellule staminali adulte dai tessuti intestinali ed epatici canini per stabilire colture di organoidi 3D. Descrivono tecniche di laboratorio per una crescita costante e procedure operative standard per la raccolta, la biobanca e la riattivazione di queste colture di organoidi.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Neuroscienza
- Biologia delle cellule staminali
- Tecnologia degli organoidi
Sfondo
- Gli organoidi canini servono come modelli per varie applicazioni biologiche.
- La standardizzazione dei protocolli di coltura degli organoidi è cruciale per la riproducibilità.
- Le tecniche includono l'isolamento, la manutenzione e la raccolta degli organoidi.
- Comprendere le dinamiche di crescita degli organoidi è essenziale per la loro applicazione nella ricerca.
Obiettivo dello studio
- Stabilire protocolli affidabili per le colture di organoidi intestinali ed epatici canini.
- Facilitare la biobanca e la riattivazione dei campioni di organoidi.
- Valutare la crescita e la salute degli organoidi in varie condizioni.
Metodi utilizzati
- Preparazione di soluzioni chelantanti e piastre per coltura cellulare.
- Isolamento e triturazione dei campioni di tessuto.
- Incubazione dei campioni con soluzioni specifiche per promuovere la crescita.
- Valutazione della salute degli organoidi attraverso misurazioni morfologiche.
Principali risultati
- I protocolli per organoidi canini producono da 50.000 a 150.000 cellule per pozzetto.
- Gli organoidi mostrano fasi di crescita distinte ed espressione di marcatori.
- I tassi di sopravvivenza degli organoidi variano in base alle condizioni ambientali.
- I tempi di incubazione influenzano significativamente i risultati di crescita degli organoidi.
Conclusioni
- I protocolli standardizzati migliorano l'affidabilità delle colture di organoidi canini.
- Comprendere le dinamiche di crescita è vitale per applicazioni di successo.
- Studi futuri possono sfruttare questi organoidi per test di farmaci e modellazione di malattie.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Standardized 3D canine hepatic and intestinal organoid cultures provide a reproducible, scalable platform for translational drug discovery and toxicology assessment. These organoid systems enable predictive modeling of complex disease biology, supporting mechanistic de-risking and target validation in large animal models relevant to human medicine. Biobanking and maintenance protocols further enhance portfolio continuity and reduce reliance on continuous tissue harvesting.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of therapeutic hypotheses in disease-relevant canine models.
- Supports mechanistic de-risking by modeling multifactorial disease pathways in vitro.
- Facilitates functional target validation through quantitative marker expression and morphological assessment.
- Provides a platform for predictive confidence in early-stage portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, reproducible organoid cultures for downstream compound screening.
- Enables quantitative assessment of organoid health via 2D ellipse area and circumference measurements.
- Supports assay scalability and platform reuse through biobanking and indefinite sub-culturing.
- Improves reliability of drug permeability and toxicology testing in a controlled system.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by modeling canine diseases analogous to human conditions.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation using biobanked organoid lines.
- Reduces biological risk by providing a robust, disease-relevant preclinical model.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on organoid viability and marker expression data.
Pipeline & Workflow Integration
These protocols position canine organoid cultures as a bridge from early discovery through lead identification and preclinical research, supporting hypothesis testing and mechanistic studies in a scalable, reusable format.
- Discovery Biology: Facilitates pathway clarification and biological de-risking via marker expression and morphological metrics.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible organoid systems for compound evaluation and toxicology assessment.
- Analytics: Enables quantitative readouts such as cell yield, viability, and marker expression for condition comparison.
- Translational Research: Supports preclinical continuity and biomarker alignment in disease-relevant canine models.
- Enterprise Reuse: Biobanking protocols allow for long-term storage and repeated use across multiple R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes workflows, enhances reproducibility, and supports scalable culture expansion.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of candidates using robust, reproducible data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture and aseptic technique for reliable organoid isolation and maintenance.
- Demands access to specialized instrumentation, including biosafety cabinets, incubators, and imaging systems.
- Necessitates cross-team standardization of protocols for reproducibility and data comparability.
- Adaptation may be needed for different tissue sources or disease models within the canine system.
- Limitations include sensitivity to incubation times and environmental conditions affecting organoid viability.
