Trapianto di microglia derivata da cellule staminali pluripotenti indotte umane nel cervello di topi immunocompetenti tramite via transnasale non invasiva
31 maggio 2022
Il protocollo qui presentato consente il trapianto di microglia umana derivata da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSMG) nel cervello attraverso una via transnasale in topi immunocompetenti. Viene mostrato il metodo per la preparazione e il trapianto transnasale di cellule e la somministrazione di miscela di citochine per il mantenimento di iPSMG.
Questo protocollo consente un trapianto non invasivo di iPSMG nel cervello di topo immunocompetente combinando l'on/off farmacologico di un antagonista del recettore CSF1 PLX5622 con il trapianto transnasale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che iPSMG può essere trapiantato senza indurre danni cerebrali anche nei topi immunocompetenti. Il trapianto microgliale può servire come potenziale terapia per scambiare microglia disfunzionali con quelle funzionali in varie malattie neurodegenerative in futuro.
A dimostrare la procedura sarà Bijay Parajuli, un ricercatore del mio laboratorio. Inizia scongelando rapidamente le cellule della microglia umana derivate da cellule staminali pluripotenti indotte congelate in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Ruotare i campioni fino a quando tutto il ghiaccio visibile si è sciolto.
Aggiungere l'iPSMG scongelato al terreno di coltura, riscaldato a 37 gradi Celsius. Aggiungere un millilitro di cellule a 10 millilitri di terreni di coltura. Centrifugare le celle a 300 volte g per cinque minuti per ottenere un pellet cellulare.
Rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet cellulare. Aggiungere il mezzo di trapianto per ottenere una concentrazione cellulare di 10 alla quinta cellula per microlitro. Posizionare l'iPSMG sul ghiaccio e procedere immediatamente al trapianto.
Per preparare i topi al trapianto transnasale, nutrire i topi maschi con una dieta contenente PLX per sette giorni. Alla fine del settimo giorno, cessare la dieta PLX e nutrire i topi con una dieta normale. Un'ora prima del trapianto transnasale di iPSMG, somministrare 2,5 microlitri di ialuronidasi in PBS a ciascuna narice due volte utilizzando una punta di pipetta da 10 microliti per aumentare la permeabilità alla mucosa nasale.
Posizionare i topi in posizione supina dopo l'applicazione della ialuronidasi. Somministrare 2,5 microlitri di ialuronidasi dieci minuti prima del trapianto transnasale di iPSMG. Applicare 2,5 microlitri di sospensione cellulare in una narice del mouse utilizzando una punta della pipetta da 10 microlitri.
Posizionare il mouse in posizione supina per cinque minuti prima della somministrazione della sospensione cellulare all'altra narice. Somministrare la sospensione cellulare quattro volte, applicando un volume totale di 20 microlitri per animale. 48 ore dopo la cessazione dell'alimentazione plX, ripetere la somministrazione di ialuronidasi e sospensione cellulare sugli stessi topi.
Per la somministrazione di citochine, applicare 2,5 microlitri del mezzo di trapianto in una narice del topo utilizzando una punta di pipetta da 10 microliti. Dopo due mesi di trapianto transnasale, il numero di cellule trapiantate può essere determinato contando le cellule positive sia per i marcatori specifici per l'uomo che per quelli pan-microgliali. Le microglia di topo endogene sono positive solo per i marcatori pan-microgliali.
Nei topi di controllo, sono state rilevate solo microglia di topo sia nella corteccia che nell'ippocampo. Nella corteccia dei topi trapiantati iPSMG, sono state rilevate solo microglia di topo, mentre nell'ippocampo sono state rilevate iPSMG. Quando si tenta questo protocollo, la rimozione completa del surnatante è essenziale per prevenire la diluizione delle citochine.
È fondamentale applicare citochine ogni 12 ore per la vitalità delle cellule trapiantate. L'esaurimento della microglia di topo endogena è necessario per il trapianto di iPSMG. Questa procedura consente il trapianto di iPSMG in un cervello di topo normale o malato.
Pertanto, è possibile determinare la caratteristica di iPSMG e la risposta alla malattia. Questa tecnica è adatta a determinare la caratteristica in vivo di iPSMG nel cervello del topo. Pertanto, il trapianto di iPSMG in topi modello di malattia ci aiuterà a capire la risposta e potrebbe aprire la strada a un nuovo bersaglio terapeutico.
Panoramica
Questo studio presenta un metodo non invasivo per il trapianto di microglia umana derivata da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSMG) nel cervello di topi immunocompetenti mediante una via transnasale. Il protocollo sfrutta l'amministrazione di citochine e l'eliminazione della microglia endogena per consentire un'integrazione efficace delle iPSMG, aprendo potenzialmente la strada ad approcci terapeutici nelle malattie neurodegenerative.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Ricerca sulle cellule staminali
- Biologia delle microglia
Sfondo
- Le cellule staminali pluripotenti indotte possono differenziarsi in microglia funzionali.
- La disfunzione microgliale è implicata in varie malattie neurodegenerative.
- La somministrazione transnasale rappresenta un approccio innovativo al trapianto cellulare.
- La somministrazione di citochine è fondamentale per la vitalità cellulare dopo il trapianto.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo per il trapianto non invasivo di microglia.
- Valutare la fattibilità della somministrazione transnasale nel mantenere la normale funzione cerebrale.
- Valutare il potenziale delle iPSMG nel sostituire la microglia disfunzionale.
Metodi Utilizzati
- La piattaforma principale prevede il trapianto transnazale di iPSMG in topi immunocompetenti.
- I topi maschi sono stati pretrattati con l'antagonista del recettore CSF1 PLX5622 e una soluzione di ialuronidasi per aumentare la permeabilità nasale.
- Sospensioni cellulari sono state somministrate in dosi multiple secondo tempistiche specificate per garantire un'adeguata integrazione.
- Il monitoraggio post-trapianto ha comportato la valutazione della presenza e della vitalità delle cellule trapiantate.
Risultati principali
- Gli iPSMG trapiantati si sono integrati con successo nell'ippocampo del topo senza danneggiare le microglia endogene.
- L'amministrazione di citochine ogni 12 ore è risultata fondamentale per mantenere la vitalità cellulare dopo il trapianto.
- Questo metodo consente di esaminare le risposte degli iPSMG sia in modelli normali che in modelli patologici.
Conclusioni
- Questo protocollo facilita lo studio delle iPSMG in vivo, il che potrebbe fornire indicazioni per future terapie geniche nelle malattie neurodegenerative.
- Comprendere il comportamento delle microglia trapiantate può aiutare a definire il loro ruolo nella salute cerebrale.
- Questo approccio potrebbe aprire nuove strade verso bersagli terapeutici innovativi nel trattamento delle patologie correlate alle microglia.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Contenuto
Il trapianto non invasivo di microglia derivata da iPSC umane in cervelli di topi immunocompetenti permette lo studio diretto in vivo della funzione microgliale umana e della risposta alle malattie. Questo approccio colma le lacune traduttive tra microglia di roditore e umana, favorendo modelli preclinici più predittivi per la ricerca sulle malattie neurodegenerative. Il protocollo migliora la validazione degli obiettivi e la riduzione dei rischi meccanicistici nei primi stadi della scoperta e nei punti critici preclinici.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette l'analisi in vivo della biologia delle microglia umane all'interno di un ambiente cerebrale mammifero.
- Consente la riduzione del rischio meccanicistica distinguendo le risposte specifiche delle microglia umane da quelle dei modelli murini.
- Facilita la validazione funzionale degli obiettivi terapeutici nei percorsi di neuroinfiammazione e neurodegenerazione.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce un sistema validato per valutare l'integrazione e la vitalità delle microglia umane in vivo.
- Permette una quantificazione riproducibile delle microglia trapiantate rispetto a quelle endogene mediante l'uso di marcatori specifici.
- Consente lo screening successivo di composti mirati alla funzione delle microglia umane in un contesto fisiologico.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea i modelli preclinici alla rilevanza delle malattie umane incorporando microglia umana in cervelli di topo.
- Permette la valutazione della risposta microgliale umana sia in topi normali che in modelli di malattia.
- Migliora la fiducia predittiva nella scoperta di biomarcatori traslazionali e nei test di ipotesi terapeutiche.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo collega la fase iniziale della scoperta alla ricerca preclinica, permettendo studi funzionali delle microglia umane in vivo e sostenendo l'identificazione di composti promettenti e la continuità traslazionale.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sui ruoli delle microglia umane nella fisiologia e nella patologia cerebrale.
- Screening: Fornisce letture quantitative dell'integrazione cellulare e della vitalità dopo il trapianto.
- Analisi: Permette la discriminazione basata su marcatori tra microglia umane e murine per un'analisi dati robusta.
- Ricerca traslazionale: Facilita la modellizzazione rilevante per le malattie tramite il trapianto di iPSMG in topi modelli di malattia.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per valutare la funzione delle microglia umane in diversi contesti patologici.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità specifica per specie nella ricerca sull'infiammazione neurologica.
- Valore operativo: Standardizza le procedure di somministrazione e quantificazione cellulare non invasive per garantire la riproducibilità tra studi.
- Valore strategico: Permette decisioni più accurate su prosecuzione o interruzione dello sviluppo di terapie mirate alle microglia, fornendo dati rilevanti per l'uomo.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione basata sul rischio dei programmi per le malattie neurodegenerative migliorando la fedeltà del modello.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella coltura di iPSC, nella differenziazione microgliale e nelle tecniche di trapianto in vivo.
- Necessita dell'accesso ad agenti farmacologici per la deplezione delle microglia endogene e al supporto con citochine.
- Richiede protocolli standardizzati per la preparazione cellulare, il trapianto e l'analisi post-trapianto.
- L'adattamento ad altri sistemi modello potrebbe richiedere l'ottimizzazione dei parametri di somministrazione e deplezione.
- L'amministrazione continua di citochine è fondamentale per la vitalità delle cellule trapiantate, come supportato dal protocollo.
