Name: Dosaggio multiplo in bolo endovenoso e valutazione emodinamica invasiva in un modello murino di ipertensione arteriosa polmonare indotta da ipossia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-11T13:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Impara il dosaggio multiplo in bolo endovenoso e la valutazione emodinamica invasiva in un modello murino di ipertensione arteriosa polmonare indotta da ipossia. Questo protocollo supporta lo screening di composti terapeutici.

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Questo lavoro è stato sostenuto, in parte, da un Joint Biology Consortium Microgrant fornito nell'ambito della sovvenzione NIH P30AR070253 (PYC), del Fondo per l'educazione alla ricerca medica cardiovascolare (PYC), del VasoRx, Inc. Fund (MS) e delle sovvenzioni NIH HL135582 (MS), HL152197 (MS).

<ol><li>McLaughlin, V. V., McGoon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+arterial+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Pulmonary arterial hypertension.</a> Circulation. 114 (1), 1417-1431 (2006).</li>
<li>Hoeper, M. M., Humbert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+new+haemodynamic+definition+of+pulmonary+hypertension%3A+evidence+prevails%2C+finally%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">The new haemodynamic definition of pulmonary hypertension: evidence prevails, finally.</a> European Respiratory Journal. 53 (3), 1900038(2019).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+rat+model+of+pulmonary+hypertension+induced+by+mono+treatment+with+SU5416%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension+Research%22%5BJournal%5D)">A novel rat model of pulmonary hypertension induced by mono treatment with SU5416.</a> Hypertension Research. 43 (8), 754-764 (2020).</li>
<li>Xiong, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+of+experimental+pulmonary+hypertension%3A+Lung+angiogram+and+right+heart+catheterization%5BTitle%5D)+AND+%22Pulmonary+Circulation%22%5BJournal%5D)">Mouse model of experimental pulmonary hypertension: Lung angiogram and right heart catheterization.</a> Pulmonary Circulation. 11 (4), 20458940211041512(2021).</li>
<li>Kmiotek, E. K., Baimel, C., Gill, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+intravenous+self+administration+in+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Methods for intravenous self administration in a mouse model.</a> Journal of Visualized Experiments. (70), e3739(2012).</li>
<li>Potus, F., Martin, A. Y., Snetsinger, B., Archer, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biventricular+assessment+of+cardiac+function+and+pressure-volume+loops+by+closed-chest+catheterization+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Biventricular assessment of cardiac function and pressure-volume loops by closed-chest catheterization in mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (160), e61088(2020).</li>
<li>Bueno-Beti, C., Hadri, L., Hajjar, R. J., Sassi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sugen+5416%2Fhypoxia+mouse+model+of+pulmonary+arterial+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Models+of+Cardiovascular+Diseases%22%5BJournal%5D)">The Sugen 5416/hypoxia mouse model of pulmonary arterial hypertension.</a> Experimental Models of Cardiovascular Diseases. 1816, 243-252 (2018).</li>
<li>Chen, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF+regulates+TGF-beta+signaling+and+endothelial-to-mesenchymal+transition+via+control+of+let-7+miRNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">FGF regulates TGF-beta signaling and endothelial-to-mesenchymal transition via control of let-7 miRNA expression.</a> Cell Reports. 2 (6), 1684-1696 (2012).</li>
<li>Chen, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+TGF-beta+signalling+drives+vascular+inflammation+and+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Endothelial TGF-beta signalling drives vascular inflammation and atherosclerosis.</a> Nature Metabolism. 1 (9), 912-926 (2019).</li>
<li>Daugherty, A., Rateri, D., Hong, L., Balakrishnan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+blood+pressure+in+mice+using+volume+pressure+recording%2C+a+tail-cuff+method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Measuring blood pressure in mice using volume pressure recording, a tail-cuff method.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1291(2009).</li>
<li>Alam, M. A., Parks, C., Mancarella, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+blood+pressure+measurement+in+freely+moving+mice+using+telemetry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Long-term blood pressure measurement in freely moving mice using telemetry.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), e53991(2016).</li>
<li>Luo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasive+hemodynamic+assessment+for+the+right+ventricular+system+and+hypoxia-induced+pulmonary+arterial+hypertension+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Invasive hemodynamic assessment for the right ventricular system and hypoxia-induced pulmonary arterial hypertension in mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (152), e60090(2019).</li>
</ol>

K Zsebo, M Simons e P-Y Chen sono fondatori scientifici e azionisti di VasoRx, Inc. M Simons è membro del comitato consultivo scientifico di VasoRx, Inc. HJ Duckers è un dipendente e azionista di VasoRx. Gli altri autori dichiarano di non avere interessi contrastanti.

Diversi modelli animali di ipertensione polmonare sono stati stabiliti per imitare gli eventi di elevata resistenza vascolare polmonare nei soggetti umani. Tra questi, il modello di PAH indotto dall'ipossia del topo è stato ampiamente utilizzato per valutare l'efficacia di nuove terapie sperimentali per la PAH. La ricerca che utilizza questo modello richiede spesso la somministrazione di composti ai topi. Rispetto ad altri protocolli pubblicati per l'iniezione endovenosa (IV) e la valutazione emodinamica invasiva, questo...

L'ipertensione arteriosa polmonare (PAH) è definita da una pressione sistolica media dell'arteria polmonare superiore a 20 mmHg a riposo 1,2. Si tratta di una malattia progressiva e fatale, caratterizzata da un aumento prolungato della pressione arteriosa polmonare, che porta al sovraccarico del ventricolo destro e, infine, alla morte per insufficienza ventricolare destra1. Attualmente, non esiste una cura per la PAH.
L'uso di modelli animali di ipertensione polmonare è importante per testare l'efficacia delle terapie sperimentali per la PAH. Tra questi modelli, il modello di PAH indotto dall'ipossia del topo ha fornito informazioni chiave sullo sviluppo della malattia PAH umana di gruppo 3 3,4. La ricerca che utilizza questo modello spesso richiede la somministrazione di composti nei topi per valutare l'efficacia e la sicurezza del nuovo composto. Pertanto, i ricercatori hanno bisogno di una procedura sperimentale dettagliata per il dosaggio dei composti e le misurazioni emodinamiche per garantire la coerenza dell'iniezione e la riproducibilità della misurazione della pressione sanguigna dall'inizio alla fine.
I metodi per l'iniezione endovenosa (IV) e la misurazione della pressione arteriosa sono stati riportati in letteratura 5,6. Tuttavia, la metodologia manca di un'illustrazione visiva e di una descrizione dettagliata. Qui illustriamo i passaggi chiave per un'iniezione endovenosa in bolo e per una misurazione e registrazione accurata della pressione arteriosa sistemica e del ventricolo destro. Le procedure qui presentate sono una risorsa importante per i ricercatori interessati alla piattaforma di somministrazione di composti per via endovenosa per sviluppare un trattamento per la PAH.

<table><tbody><tr><td>Confezione di sutura in prolene 5-0</td><td>Ethicon</td><td>8698G</td><td>per la chiusura dell'incisione</td></tr><tr><td>Confezione di sutura in nylon 8-0</td><td>AROSurgical Instruments</td><td>T06A08N14-13</td><td>per legatura</td></tr><tr><td>Camera di induzione per anestesia</td><td>VETEQUIP</td><td>#941444</td><td>Trattiene l'animale durante l'esposizione all'anestesia</td></tr><tr><td>Cavo di interfaccia del catetere PEC-4D</td><td>Millar</td><td></td><td>per il collegamento del catetere Millar Mikro-Tip al PCU-2000</td></tr><tr><td>Filtri a tanica di carbone</td><td>VETEQUIP</td><td>#931401</td><td>&nbsp; per aiutare a rimuovere&nbsp; anestetico di scarto&nbsp; gas</td></tr><tr><td>Tamponi di cotone</td><td>McKesson</td><td>24-106</td><td>per applicare pressione al sito di iniezione per prevenire il sanguinamento</td></tr><tr><td>Forbici fini</td> Strumenti per la <td>scienza fine</td><td>14059-11</td><td>Strumenti chirurgici</td></tr><tr><td>Siringa da insulina 28 G</td><td>EXEL</td><td>26027</td><td>per iniezione endovenosa giugulare</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>COVETRUS</td><td>#029405</td><td>per anestesia del topo</td></tr><tr><td>Software LabChart 8</td>Strumenti <td>per l'analisi</td> <td>dei</td><td></td> dati</tr><tr><td>Catetere a pressione Mikro-Tip SPR-1000 (1.0 F)</td><td>Millar</td><td></td><td>per la misurazione invasiva della pressione sanguigna</td></tr><tr><td>Ago-25 G</td><td>BD</td><td>305124</td><td>per praticare un piccolo foro in un vaso</td></tr><tr><td>Controllore di ossigeno Sensore di ossigeno ProOx</td><td>BioSpherix</td><td>E702</td><td>per il monitoraggio della concentrazione di ossigeno</td></tr><tr><td>PCU-2000 Unità di controllo della pressione</td><td>Millar</td><td></td><td>per il collegamento del catetere Millar Mikro-Tip a PowerLab 4/35</td></tr><tr><td>PowerLab 4/35</td><td>ADInstruments</td><td></td><td>for Data Acquisition. L'investigatore deve collegare il PowerLab 4/35 a un laptop personale contenente il software LabChart 8 per il funzionamento.</td></tr><tr><td>Prism 8</td><td>GraphPad</td><td></td><td>per la statistica e la grafica scientifica</td></tr><tr><td>Camera per ipossia semisigillabile</td><td>BioSpherix</td><td></td><td>un ambiente artificiale che simula le condizioni di alta quota per gli animali</td></tr><tr><td>Forbici a molla</td><td>Strumenti per le scienze</td><td>15021-15</td><td>Strumenti chirurgici</td></tr><tr><td>Pinzetta stile 4</td><td>Microscopia elettronica Scienze</td><td>0302-4-PO</td><td>Strumenti chirurgici</td></tr><tr><td>VasoRx composto 7C1/let-7 miRNA</td><td>VasoRx, Inc.</td><td>Lotto # B2-L-16Apr</td><td>IV composto per iniezione VIP</td></tr><tr><td>3000 Vaporizzatore veterinario</td><td>COLONIAL MEDICAL SUPPLY CO., INC.</td><td></td><td>per un'erogazione accurata dell'anestesia</td></tr></tbody></table>

dosaggio multiplo in bolo endovenoso e valutazione emodinamica invasiva in un modello murino di ipertensione arteriosa polmonare indotta da ipossia

Multiple Intravenous Bolus Dosing and Invasive Hemodynamic Assessment in a Hypoxia-Induced Mouse Pulmonary Artery Hypertension Model

L'ipertensione arteriosa polmonare (PAH) è una malattia progressiva potenzialmente letale, che colpisce principalmente le piccole arteriole polmonari del polmone. Attualmente, non esiste una cura per la PAH. È importante scoprire nuovi composti che possono essere utilizzati per trattare la PAH. Il modello di PAH indotto dall'ipossia murina è un modello ampiamente utilizzato per la ricerca sulla PAH. Questo modello riassume le manifestazioni cliniche umane della malattia PAH di gruppo 3 ed è un importante strumento di ricerca per valutare l'efficacia di nuove terapie sperimentali per la PAH. La ricerca che utilizza questo modello richiede spesso la somministrazione di composti nei topi. Per un composto che deve essere somministrato direttamente nel flusso sanguigno, l'ottimizzazione della somministrazione endovenosa (IV) è una parte fondamentale delle procedure sperimentali. Idealmente, il sistema di iniezione endovenosa dovrebbe consentire più iniezioni in un determinato periodo di tempo. Sebbene il modello di PAH indotto dall'ipossia murina sia molto popolare in molti laboratori, è tecnicamente difficile eseguire il dosaggio di più boli endovenosi e la valutazione emodinamica invasiva in questo modello. In questo protocollo, presentiamo istruzioni passo-passo su come eseguire il dosaggio di boli endovenosi multipli attraverso la vena giugulare di topo ed eseguire il cateterismo arterioso e del ventricolo destro per la valutazione emodinamica nel modello di PAH indotto dall'ipossia del topo.

L'anestesia spesso riduce la pressione sanguigna. Pertanto, è stata utilizzata una dose minima di anestesia per abolire i movimenti in risposta a uno stimolo nocivo. L'accesso riuscito alla camera ventricolare destra può essere visualizzato mentre la forma d'onda emodinamica cambia in diverse regioni dei sistemi venosi (Figura 8).
In questo studio, i topi sono stati assegnati in modo casuale al gruppo normossico (21% O2 ) (n = 10), al gruppo ipossia (10...

Questo protocollo fornisce una procedura passo-passo per l'esecuzione della somministrazione di dosi multiple in bolo endovenoso e il monitoraggio emodinamico invasivo nei topi. I ricercatori possono utilizzare questo protocollo per il futuro screening dei composti terapeutici per l'ipertensione arteriosa polmonare.

Dosaggio multiplo in bolo endovenoso e valutazione emodinamica invasiva in un modello murino di ipertensione arteriosa polmonare indotta da ipossia

Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a progressive life-threatening disease, primarily affecting small pulmonary arterioles of the lung. Currently, ...

Per un composto che deve essere somministrato direttamente nel flusso sanguigno, l'ottimizzazione della somministrazione endovenosa è la parte fondamentale della procedura sperimentale. Il nostro protocollo dettagliato fornisce istruzioni dettagliate per eseguire il dosaggio di boli endovenosi multipli attraverso la vena giugulare di topo e come eseguire cateterismi arteriosi e ventricolari destri per un'accurata valutazione emodinamica nel modello di ipertensione arteriosa polmonare ipossia di topo. Le procedure qui presenti sono risultati importanti per i ricercatori interessati alla radice IV della piattaforma di somministrazione di composti per sviluppare un trattamento per l'ipertensione arteriosa primaria.I ricercatori possono utilizzare questo metodo di iniezione in bolo della vena giugulare per lo screening dei composti per lo sviluppo di farmaci in qualsiasi modello murino di malattia. L'iniezione in bolo endovenoso e le misurazioni della pressione sanguigna richiedono molta pratica. Per iniziare, rimuovere il topo dalla camera di anestesia.Posizionare il topo anestetizzato in posizione supina su una piattaforma di iniezione sotto un microscopio da dissezione. Mantenere l'anestesia tramite un cono nasale con isoflurano all'1,5% e trattenere delicatamente le quattro gambe con nastro adesivo per immobilizzare il corpo. Strofinare delicatamente l'area chirurgica tre volte con tre cicli alternati di soluzione di iodio povidone ed etanolo al 70%.Dopo aver eseguito un taglio longitudinale di 0,5 centimetri, utilizzare una pinza per separare il muscolo e i tessuti adiposi e individuare la vena giugulare esterna destra. Quindi inserire un ago sterile da 28 G nella vena giugulare. Con lo smusso dell'ago rivolto verso l'alto.Premere lentamente lo stantuffo della siringa per iniettare il composto nella vena. Lasciare che l'ago rimanga all'interno della vena per altri 10 secondi per evitare il riflusso. Rimuovere l'ago e utilizzare un batuffolo di cotone per esercitare pressione sul sito di iniezione per prevenire il sanguinamento.Suturare la pelle con sutura 5/0 e posizionare l'animale in una gabbia di recupero con il fondo della gabbia coperto da un tovagliolo di carta senza lettiera. Innanzitutto, misurare la distanza tra il sito di inserimento del catetere e la posizione desiderata della punta del catetere. Segnare due contrassegni di distanza del catetere per fornire un'indicazione visiva della profondità di inserimento, applicare l'unguento veterinario direttamente sulla superficie oculare degli occhi del topo per prevenire la secchezza.Posizionare il topo in posizione supina su una piattaforma di iniezione sotto un microscopio da dissezione. Dopo aver inciso la pelle dalla mandibola allo sterno, separare le ghiandole salivari ed esporre la trachea. Metti 0,5 millilitri di PBS nella cavità per rallentare lo sviluppo dello spasmo vascolare mentre manipoli l'arteria carotide.Isolare con cura una sezione di cinque millimetri dell'arteria carotide destra posizionando un pezzo di carta bianca sotto il vaso come sfondo. Usando un 8-0 sutura, fare un nodo permanente per chiudere l'estremità cranica del vaso. Successivamente, fai il primo nodo sciolto per occludere temporaneamente il flusso sanguigno dall'aorta.Quindi fare il secondo nodo sciolto tra le prime due suture. Utilizzando un ago da 25G, praticare un piccolo foro abbastanza grande da far passare il catetere in linea con il vaso tra il nodo permanente e il secondo nodo sciolto. Tenere il catetere a 1,5 pollici dalla punta e inserire delicatamente la punta del catetere attraverso il foro dell'arteria.Stringere il secondo nodo sciolto attorno al catetere e al vaso che consente ancora il passaggio del catetere. Sciogliere delicatamente il primo nodo sciolto. Continuare a inserire il catetere verso l'aorta ascendente in base al segno sul catetere fino a quando l'analisi della pressione non mostra un profilo della pressione arteriosa.Registra i dati della pressione arteriosa sistemica utilizzando il sistema di acquisizione dati e il software. Allentare il nodo di sutura centrale per consentire l'estrazione del catetere. Quindi allacciare il primo nodo sciolto per evitare sanguinamenti ed estrarre il catetere dall'arteria carotide.Isolare con cura la vena giugulare esterna destra dal tessuto connettivo circostante. Usando un 8-0 sutura, legare tutti i piccoli rami e fare un nodo permanente per chiudere l'estremità cranica del vaso. Quindi fai un nodo sciolto sull'estremità caudale del vaso.Usa un ago da 25G per fare un piccolo foro prossimale al nodo permanente. Tenere il catetere e inserire il catetere nel taglio della vena e stringere il nodo caudale attorno al catetere e al vaso. Spingere lentamente il catetere nel cuore destro.Monitorare la profondità della punta del catetere in base al segno del catetere. Valutare la posizione della punta del catetere in base al tracciamento dell'onda di pressione nel software. Quando la punta del catetere si trova nel ventricolo destro, il monitor mostrerà un tipico tracciato della pressione sistolica del ventricolo destro.Tenere stabile il catetere e raccogliere i dati per cinque minuti. Al termine della registrazione, estrarre con cautela il catetere e osservare che non vi sia alcuna registrazione della pressione. Annoda il nodo caudale attorno al recipiente.Riposizionare il catetere nella soluzione PBS. Durante il cateterismo del ventricolo destro in un topo C57 nero controllato da normossia, è stato ottenuto un accesso riuscito alla camera ventricolare destra, come si è visto dal cambiamento della forma d'onda emodinamica in diverse regioni del sistema venoso. La pressione arteriosa sistemica e la pressione sistolica ventricolare destra sono state misurate in un topo a torace chiuso quattro settimane dopo l'esposizione a ipossia o normossia.Rispetto al gruppo normossia, la pressione sistolica ventricolare destra è risultata significativamente aumentata nel gruppo ipossia. Il trattamento con il composto di micro RNA 7C1/let-7 ha determinato una significativa diminuzione della pressione sistolica ventricolare destra rispetto al gruppo ipossia, mentre la pressione arteriosa sistemica non è cambiata in nessun gruppo. La valutazione della pressione sistolica del ventricolo rosso nei topi a torace chiuso è una sfida a causa della complessa anatomia del ventricolo rosso.Gli sperimentatori devono evitare tentativi prolungati e ripetuti di cateterismo ventricolare rosso. La nostra procedura di dosaggio giugulare e bolo può essere utilizzata per lo screening di composti per lo sviluppo di farmaci in qualsiasi modello murino di malattia. Possiamo utilizzare la radice IV della piattaforma di somministrazione del composto per sviluppare un trattamento per l'ipertensione arteriosa polmonare.

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Dosaggio multiplo in bolo endovenoso e valutazione emodinamica invasiva in un modello murino di ipertensione arteriosa polmonare indotta da ipossia (Video) | JoVE Journal

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