Name: In vitro Digestione delle emulsioni in una singola goccia tramite scambio multifase di fluidi gastrointestinali simulati (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-18T13:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: Scopri la digestione in vitro di emulsioni in una singola goccia tramite scambio multifase di fluidi gastrointestinali simulati. Questo metodo permette di monitorare in tempo reale la tensione interfaciale durante la digestione.

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Questa ricerca è stata finanziata dai progetti RTI2018-101309-B-C21 e PID2020-631-116615RAI00, finanziati da MCIN/AEI/10.13039/501100011033 e da "FESR A way of making Europe". Questo lavoro è stato (parzialmente) supportato dal Biocolloid and Fluid Physics Group (ref. PAI-FQM115) dell'Università di Granada (Spagna).

1. Sequenza di pulizia per tutti gli oggetti in vetro utilizzati nella sperimentazione scientifica delle superfici
<ol><li>Strofinare la vetreria con una soluzione detergente concentrata (vedi Tabella dei materiali) diluita in acqua (10%).</li>
	<li>Risciacquare abbondantemente con una sequenza di acqua di rubinetto, propanolo, acqua distillata e acqua ultrapura. Asciugare in una cabina e conservare in un armadietto chiuso fino all'uso.</li>
</ol>2. Preparazione del campione
<ol><li>Preparare mezzi digestivi artificiali secondo i protocolli standardizzati INFOGEST11,20 (vedi Tabella dei materiali). Per i dettagli, vedere la tabella 1 e includere piccoli adattamenti ai requisiti del lavoro interfacciale per prevenire la contaminazione attiva superficiale e la diluizione dei campioni (1:10)10.</li>
	<li>Preparare la soluzione emulsionante seguendo i passaggi seguenti.<ol><li>Preparare 0,01 L di una soluzione concentrata di (1 kg· L−1) emulsionante o una miscela di emulsionanti (vedi Tabella dei materiali) in un tampone iniziale (Tabella 1) e tenere sotto lieve agitazione durante la notte.</li>
		<li>Diluire a 0,1 kg· L−1 (o come richiesto) per saturare l'interfaccia; raggiungere uno pseudo plateau nella tensione interfacciale dopo 1 h di adsorbimento in un'area interfacciale costante seguendo il rapporto21 precedentemente pubblicato.</li>
		<li>Tenere sotto leggera agitazione per 15 minuti prima dell'uso.</li>
	</ol></li>
	<li>Purificare la fase oleosa.<ol><li>Preparare una miscela di olio vegetale (girasole, oliva, trioleina, ecc.) e resine metasilicate di magnesio (vedi Tabella dei materiali) in proporzione di 2:1 p/p in un grande becher. Tenere sotto lieve agitazione meccanica per almeno 3 ore.</li>
		<li>Centrifugare la miscela a 8.000 x g per 30 minuti a temperatura ambiente in una centrifuga commerciale (vedi Tabella dei materiali).</li>
		<li>Filtrare la miscela di olio sotto vuoto con un filtro a siringa (dimensione dei pori di 0,2 μm) (vedere Tabella dei materiali). Conservare in bottiglie ambrate pulite sigillate e bollite con azoto fino all'uso.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Taratura e pulizia dell'OCTOPUS
<ol><li>Risciacquare tutti i tubi con acqua ultrapura impostando una sequenza di pulizia di entrambe le siringhe e di tutte le valvole attraverso un capillare (valvole 6/4) e all'uscita esterna (valvola 8-colore blu). A tale scopo, premere il pulsante di pulizia nella finestra di dialogo a sinistra (Figura supplementare 1A).</li>
	<li>Controllare la tensione superficiale7 dell'acqua a temperatura ambiente formando una goccia d'acqua e misurando in tempo reale per 5 minuti (Figura supplementare 1B, C).<ol><li>Impostare la densità differenziale aria-acqua (0,9982 kg· L−1) nella finestra di dialogo di sinistra, Figura supplementare 1B.</li>
	</ol></li>
	<li>Riempire la cuvetta pulita (vetro ottico) con 0,002 L di olio vegetale pulito e inserirla nel supporto della cuvetta nella cella termostatica (Figura 3).</li>
	<li>Impostare il termostato e consentire l'equilibrio della temperatura a 37 °C.</li>
	<li>Controllare la tensione interfacciale acqua-olio a temperatura ambiente7.<ol><li>Impostare la densità differenziale su olio vegetale-acqua (olio d'oliva: 0,800 kg· L−1) (figura supplementare 1C).</li>
		<li>Iniettare 40 μL ad una velocità di 0,5 μL·s−1 e misurare in tempo reale ogni secondo fino alla fine dell'iniezione. Si tratta di un processo dinamico semplice (figura supplementare 1B, D).</li>
		<li>Tracciare la tensione interfacciale in funzione del volume delle goccioline in una scheda tecnica.</li>
		<li>Verificare che l'intervallo di volume delle gocce fornisca un valore per la tensione interfacciale indipendente dal volume delle gocce. Tracciare l'area interfacciale in funzione del volume delle gocce.</li>
		<li>Programmare un processo contenente due passaggi (Figura supplementare 1B e Figura supplementare 2A) seguendo i passaggi seguenti.<ol><li>Con una siringa interna, iniettare un volume contenuto all'interno di questo intervallo di tensione interfacciale costante.</li>
			<li>Mantenere costante l'area interfacciale al valore selezionato al punto 3.5.4 e registrare la tensione interfacciale per 5 minuti7.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>4. Programmare un processo sperimentale in DINATEN per ogni fase digestiva
NOTA: per i parametri di processo, vedere la figura supplementare 1B.
<ol><li>Eseguire il controllo iniziale.<ol><li>Per la formazione di gocce, iniettare 10 μL (±5 μL) di soluzione emulsionante nel capillare (valvola 6) (Figura supplementare 2A).</li>
		<li>Registrare l'adsorbimento in un'area interfacciale costante 21 di 20 mm 2 (±10 mm2) per 1 ora (figura supplementare 2B).</li>
		<li>Registrare la reologia dilatativa8 (Figura supplementare 2C).<ol><li>Impostare l'ampiezza dell'oscillazione su 1,25 μL, periodo 10 s.</li>
			<li>Registrare l'adsorbimento nell'area interfacciale selezionata (punto 4.1.2) per 10 s.</li>
			<li>Ripetere il passaggio 4.1.3 in periodi diversi: 5 s, 20 s, 50 s e 100 s.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Registra la digestione gastrica.<ol><li>Registrare l'adsorbimento21 nell'area interfacciale selezionata per 10 s.</li>
		<li>Scambio di sottofase7 con liquido nella valvola 2 (sSGF) ed enzimi gastrici (Tabella 1) (Figura supplementare 2D).<ol><li>Riempire la siringa sinistra dalla valvola 2. Iniettare 125 μL nella valvola 6-capillare con la siringa sinistra a 5 μL·s−1.</li>
			<li>Estrarre 125 μL dal capillare con la siringa destra a 5 μL·s−1. Scaricare la siringa destra per uscire dalla valvola 8. Ripetere i passaggi 4.2.2.1-4.2.2.2 10 volte per assicurare lo scambio completo.</li>
		</ol></li>
		<li>Registrare l'adsorbimento21 nell'area interfacciale selezionata al punto 4.1.2 per 1 ora (figura supplementare 2B).</li>
		<li>Registrare la reologia dilatativa8 (Figura supplementare 2C).<ol><li>Impostare l'ampiezza dell'oscillazione su 1,25 μL, periodo 10 s.</li>
			<li>Registrare l'adsorbimento dell'area interfacciale selezionata al punto 4.1.2 per 10 s. Ripetere in diversi periodi: 5 s, 20 s, 50 s, 100 s.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Registra la digestione intestinale.<ol><li>Registrare l'adsorbimento21 nell'area interfacciale selezionata al punto 4.1.2 per 10 s (figura supplementare 2B).</li>
		<li>Scambio di sottofase7 con liquido nella valvola 3 (sSIF) ed enzimi intestinali/sali biliari/fosfolipidi (Tabella 1) (Figura supplementare 2D).<ol><li>Riempire la siringa sinistra dalla valvola 2. Iniettare 125 μL nella valvola 6-capillare con la siringa sinistra a 5 μL·s−1. Estrarre 125 μL dal capillare con la siringa destra a 5 μL·s−1.</li>
			<li>Scaricare la siringa destra per uscire dalla valvola 8. Ripetere i passaggi 4.3.2.1-4.3.2.2 10 volte per assicurare lo scambio completo.</li>
		</ol></li>
		<li>Registrare l'adsorbimento21 nell'area interfacciale selezionata al punto 4.1.2 per 1 ora.</li>
		<li>Registrare la reologia dilatativa8 (Figura supplementare 2C).<ol><li>Impostare l'ampiezza dell'oscillazione su 1,25 μL, periodo 10 s.</li>
			<li>Registrare l'adsorbimento nell'area interfacciale selezionata al punto 4.1.2 per 10 s.</li>
			<li>Ripetere in diversi periodi: 5 s, 20 s, 50 s, 100 s.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Registrare il desorbimento seguendo i passaggi seguenti.<ol><li>Registrare l'adsorbimento21 nell'area interfacciale selezionata al punto 4.1.2 per 10 s (figura supplementare 2B).</li>
		<li>Scambio di sottofase7 con liquido nella valvola 5 (sSIF) (Tabella 1, Figura supplementare 2D).<ol><li>Riempire la siringa sinistra dalla valvola 5. Iniettare 125 μL nella valvola 5-capillare con la siringa sinistra a 5 μL·s−1.</li>
			<li>Estrarre 125 μL dal capillare con la siringa destra a 5 μL·s−1. Scaricare la siringa destra per uscire dalla valvola 8. Ripetere i passaggi 4.4.2.1-4.4.2.2 10 volte per assicurare lo scambio completo.</li>
		</ol></li>
		<li>Registrare l'adsorbimento21 nell'area interfacciale selezionata al punto 4.1.2 per 1 ora (figura supplementare 2B).</li>
		<li>Registrare la reologia dilatativa8 (Figura supplementare 2C).<ol><li>Mantenere l'ampiezza di 1,25 μL, periodo 10 s.</li>
			<li>Registrare l'adsorbimento nell'area interfacciale selezionata al punto 4.1.2 per 10 s.</li>
			<li>Ripetere il passaggio 4.4.4 in periodi diversi: 5 s, 20 s, 50 s, 100 s.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>5. Impostazione dell'esperimento
<ol><li>Riempire i tubi della microcentrifuga con il mezzo di digestione artificiale e collegare ciascuno di essi alla rispettiva valvola tramite il tubo corrispondente.</li>
	<li>Riempire il tubo nelle valvole 2-5 pulendo dalla valvola 2, dalla valvola 3, dalla valvola 4 e dalla valvola 5 fino all'uscita esterna (valvola 8) (figura supplementare 1A).</li>
	<li>Riempire il tubo nella valvola 1 pulendo dalla valvola 1 alla valvola 6-capillare 5 volte.</li>
	<li>Posizionare il capillare nella fase oleosa. Caricare la siringa sinistra con la valvola 1 (soluzione iniziale, Tabella 1).</li>
	<li>Avviare l'elaborazione sequenziale della fase 4.1-iniziale, della fase 4.2-gastrica, della fase 4.3-intestino e della fase 4.4-desorbimento, salvando i dati alla fine di ogni processo.</li>
</ol>6. Calcolo dei parametri reologici dilatatori con il software di elaborazione delle immagini CONTACTO8
NOTA: Per i dettagli, vedere Maldonado-Valderrama et al.8.
<ol><li>Caricare le immagini corrispondenti all'oscillazione dell'area ad una determinata frequenza e ampiezza (Figura supplementare 3A).</li>
	<li>Premere Reologia (Figura supplementare 3B) e ottenere i parametri dilatatori (Figura supplementare 3C).</li>
	<li>Copiare e incollare i risultati nel foglio di calcolo dei dati.</li>
</ol>7. Rappresentazione dei risultati sperimentali
<ol><li>Ricalcola la colonna temporale in ciascuna delle fasi del processo di digestione aggiungendo gli ultimi dati dell'ora del passaggio precedente.</li>
	<li>Tracciare la tensione interfacciale rispetto al tempo additivo per ciascuna delle fasi del processo di digestione utilizzato.</li>
	<li>Tracciare la tensione interfacciale/elasticità e viscosità finale dell'interfacciale ottenuta alla fine di ogni fase rispetto alla fase di digestione: digestione iniziale, gastrica, digestione duodenale e desorbimento.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti noti o relazioni personali che potrebbero aver influenzato il lavoro riportato in questo articolo.

Questo articolo descrive un protocollo generalizzato per misurare la digestione in vitro degli strati interfacciali utilizzando apparecchiature per la caduta del pendente. Il protocollo può essere adattato alle esigenze specifiche dell'esperimento regolando la composizione dei tamponi digestivi, che si basano sul protocollo armonizzato INFOGEST11,20 per facilitare il confronto con la letteratura. Gli enzimi digestivi e i biotensioattivi possono essere ag...

Capire come viene digerito il grasso, che comporta la digestione dell'emulsione, è importante per progettare razionalmente prodotti con funzionalità su misura1. Il substrato per la digestione dei grassi è un'emulsione poiché il grasso viene emulsionato al consumo per azione meccanica e miscelazione con biotensioattivi nella bocca e nello stomaco. Inoltre, la maggior parte del grasso consumato dagli esseri umani è già emulsionato (come i prodotti lattiero-caseari), e nel caso di neonati o di alcuni anziani, questa è l'unica forma di consumo. Quindi, la progettazione di prodotti a base di emulsioni con profili digestivi specifici è molto importante nella nutrizione1. Inoltre, le emulsioni possono incapsulare e fornire nutrienti, farmaci o bioattivi lipofili2 per affrontare diverse condizioni gastrointestinali come obesità3, fortificazione dei nutrienti, allergie alimentari e malattie digestive. Nelle emulsioni olio-in-acqua, le goccioline lipidiche sono circondate da strati interfacciali di emulsionanti come proteine, tensioattivi, polimeri, particelle e miscele4. Il ruolo degli emulsionanti è duplice: stabilizzare l'emulsione5 e proteggere/trasportare il composto incapsulato in un sito specifico. Il raggiungimento di una digeribilità su misura delle emulsioni dipende dalla loro composizione iniziale, ma richiede anche il monitoraggio della continua evoluzione di questa interfaccia durante il transito attraverso il tratto gastrointestinale (Figura 1).
<img alt="Diagramma della digestione infantile; Ingegneria interfacciale, matrici di nuovi alimenti, obesità, fortificazione dei nutrienti." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64158/64158fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1: Applicazione dell'ingegneria interfacciale delle emulsioni per affrontare alcune delle principali condizioni gastrointestinali. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64158/64158fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
La digestione lipidica è in definitiva un processo interfacciale perché richiede l'adsorbimento di lipasi (gastriche o pancreatiche) sull'interfaccia olio-acqua delle goccioline lipidiche emulsionate attraverso lo strato interfacciale per raggiungere e idrolizzare i trigliceridi contenuti nell'olio in acidi grassi liberi e monoacilgliceridi6. Questo è schematizzato nella Figura 2. La lipasi gastrica compete con la pepsina e i fosfolipidi nello stomaco per l'interfaccia olio-acqua (Figura 2, digestione gastrica). Quindi, la lipasi / colipasi pancreatica compete con tripsina / chimotripsina, fosfolipidi, sali biliari e prodotti digestivi nell'intestino tenue. Le proteasi possono alterare la copertura interfacciale, impedendo o favorendo l'adsorbimento della lipasi, mentre i sali biliari sono altamente attivi in superficie e spostano la maggior parte dell'emulsionante rimanente per promuovere l'adsorbimento della lipasi (Figura 2, digestione intestinale). Alla fine, la velocità e l'estensione della lipolisi dipendono dalle proprietà interfacciali dell'emulsione digerita iniziale / gastrica, come lo spessore, le connessioni inter / intramolecolari e le interazioni elettrostatiche e steriche. Di conseguenza, il monitoraggio dell'evoluzione dello strato interfacciale mentre viene digerito offre una piattaforma sperimentale per identificare i meccanismi interfacciali e gli eventi che influenzano l'adsorbimento della lipasi e, quindi, la digestione dei lipidi.
<img alt="Schema del processo digestivo; Mostra la digestione gastrica e intestinale delle emulsioni alimentari con enzimi." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64158/64158fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figura 2: Diagramma schematico che illustra il ruolo delle interfacce nella digestione dei lipidi gastrointestinali. L'idrolisi della pepsina altera la composizione interfacciale nella fase gastrica, mentre la lipasi gastrica idrolizza i trigliceridi. Nell'intestino tenue, tripsina/chimotripsina idrolizzano ulteriormente il film interfacciale, mentre la lipolisi procede per adsorbimento di BS/lipasi, idrolisi dei trigliceridi e desorbimento dei prodotti lipolitici mediante solubilizzazione nelle micelle/complesso BS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64158/64158fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
L'apparecchiatura a goccia pendente dell'Università di Granada (UGR) è implementata con una tecnologia brevettata, il doppio capillare coassiale, che consente lo scambio di sottofasi della soluzione sfusa7. Il capillare, che trattiene la goccia pendente, è costituito da una disposizione di due capillari coassiali collegati in modo indipendente a ciascun canale di un doppio microiniettore. Ogni microiniettore può operare in modo indipendente, consentendo lo scambio del contenuto caduto tramite flusso passante7. Di conseguenza, lo scambio di sottofase consiste nell'iniezione simultanea della nuova soluzione con il capillare interno e nell'estrazione della soluzione sfusa con il capillare esterno utilizzando la stessa portata. Questo processo consente la sostituzione della soluzione sfusa senza disturbi dell'area interfacciale o del volume della goccia. Questa procedura è stata successivamente aggiornata a uno scambio multi-sottofase, che consente fino a otto scambi sequenziali di sottofase della soluzione di massa di goccioline8. Ciò consente la simulazione del processo digestivo in una singola goccia acquosa sospesa in mezzi lipidici scambiando sequenzialmente la soluzione bulk con mezzi artificiali che imitano i diversi compartimenti (bocca, stomaco, intestino tenue). L'intera configurazione è rappresentata nella Figura 3, inclusi i dettagli dei componenti. Le siringhe nel microiniettore sono collegate alle otto valvole vias, ciascuna collegata a un tubo di microcentrifuga contenente il fluido digestivo artificiale con i componenti descritti nella Figura 2.
<img alt="Configurazione di microiniezione con sorgente luminosa, micro-posizionatore, telecamera CCD per l'analisi cellulare." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64158/64158fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figura 3: Vista generale di OCTOPUS con tutti i componenti. La telecamera CCD, il microscopio, il microposizionatore, la cella termostabilizzata e il doppio capillare collegati indipendentemente a un doppio microiniettore con due siringhe collegate a otto valvole vias. Ogni siringa si collega con capillare, quattro provette di microcentrifuga con campione e uno scarico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64158/64158fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
La figura 4A mostra come ciascuno dei fluidi digestivi artificiali viene iniettato nella goccia pendente mediante scambio di sottofase attraverso il doppio capillare. Ogni composto digestivo descritto in Figura 2 può essere applicato simultaneamente / sequenzialmente, simulando il passaggio attraverso il tratto gastrointestinale. I fluidi digestivi artificiali contengono diversi enzimi e biotensioattivi, che alterano la tensione interfacciale dell'emulsionante iniziale, come schematizzato nella Figura 4B. Il software DINATEN (vedi Table of Materials), anch'esso sviluppato presso l'UGR, registra l'evoluzione della tensione interfacciale in tempo reale man mano che lo strato interfacciale iniziale viene digerito in vitro. Inoltre, dopo ogni fase digestiva, l'elasticità dilatatoria dello strato interfacciale viene calcolata imponendo oscillazioni periodiche di volume / area interfacciale sullo strato interfacciale stabilizzato e registrando la risposta della tensione interfacciale. Il periodo/frequenza e l'ampiezza dell'oscillazione possono essere variati, e l'elaborazione delle immagini con il software CONTACTO fornisce i parametri reologici dilatatori8.
<img alt="Diagramma e grafico della reazione enzimatica, tensione interfacciale vs. tempo di digestione, proteolisi, lipolisi." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64158/64158fig04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Figura 4: Esempi di profili di digestione . (A) Lo strato emulsionante iniziale è sottoposto a mezzi digestivi artificiali posti nella microcentrifuga mediante scambio sequenziale di sottofasi delle diverse soluzioni nella goccia pendente. (B) L'evoluzione generale della tensione interfacciale (asse y) dell'emulsionante iniziale in funzione del tempo (asse x) in quanto viene digerito in vitro dai vari enzimi/biotensioattivi nei mezzi artificiali. Uno scambio finale di sottofase con fluido intestinale semplice misura il desorbimento del lipide digerito mediante solubilizzazione in micelle miste. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64158/64158fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
Questo studio presenta il protocollo generale progettato per misurare la digestione in vitro degli strati interfacciali con apparecchiature pendenti per la caduta9. Lo strato interfacciale iniziale è soggetto in sequenza a condizioni che imitano il passaggio attraverso il tratto gastrointestinale, come illustrato nella Figura 2. Questi diversi mezzi digestivi vengono iniettati nella goccia del pendente mediante scambio di sottofase delle diverse soluzioni contenute nelle provette della microcentrifuga (Figura 4A). La composizione di questi mezzi può essere personalizzata in base alle condizioni gastrointestinali che verranno valutate, ovvero proteolisi/lipolisi gastrica/intestinale, consentendo di misurare gli effetti cumulativi e le sinergie10. Le condizioni sperimentali utilizzate per imitare il processo di digestione in ciascun compartimento seguono il protocollo di consenso internazionale pubblicato da INFOGEST che dettaglia il pH e le quantità di elettroliti ed enzimi11. Il dispositivo sperimentale basato sulla goccia del pendente consente di registrare la tensione interfacciale in situ durante tutto il processo di digestione simulato. La reologia dilativa dello strato interfacciale viene calcolata alla fine di ogni fase digestiva. In questo modo, ogni emulsionante offre un profilo di digestione che illustra le proprietà delle interfacce digerite, come illustrato nella Figura 4B. Ciò consente l'estrazione di conclusioni riguardanti la sua suscettibilità o resistenza alle diverse fasi del processo digestivo. In generale, i mezzi digestivi artificiali contengono pH acido/basico, elettroliti, proteasi (gastrica e intestinale), lipasi (gastrica e intestinale), sali biliari e fosfolipidi, che vengono disciolti nei rispettivi fluidi digestivi (gastrico o intestinale). La figura 4B mostra un profilo generico dell'evoluzione della tensione interfacciale di un emulsionante, prima sottoposta all'azione della proteasi, seguita dalle lipasi. In generale, la proteolisi dello strato interfacciale favorisce un aumento della tensione interfacciale dovuta al desorbimento dei peptidi idrolizzati9,12, mentre la lipolisi determina una riduzione molto marcata della tensione interfacciale dovuta all'adsorbimento di sali biliari e lipasi 13. Uno scambio finale di sottofase con il fluido intestinale esaurisce la soluzione sfusa di materiale non adsorbito / digerito e promuove il desorbimento dei composti solubili e la solubilizzazione dei lipidi digeriti nelle micelle miste. Questo è quantificato dall'aumento della tensione interfacciale registrata (Figura 4B).
In sintesi, il disegno sperimentale implementato nella goccia pendente per simulare la digestione in vitro in una singola goccia consente di misurare gli effetti cumulativi e le sinergie mentre il processo di digestione viene applicato sequenzialmente allo strato interfacciale iniziale10. La composizione di ciascun mezzo digestivo può essere facilmente sintonizzata per tenere conto delle particolarità delle condizioni digestive, comprese le patologie gastrointestinali o i mezzi digestivi infantili14. Quindi, l'identificazione dei meccanismi interfacciali che influenzano la proteolisi e la lipolisi può essere utilizzata per modulare la digestione mediante l'ingegneria interfacciale delle emulsioni. I risultati ottenuti possono essere applicati nella progettazione di nuove matrici alimentari con funzionalità su misura come bassa allergenicità, apporto energetico controllato e ridotta digeribilità 15,16,17,18,19.

<table><tbody><tr><td>Alfa-chimotripsina da pancreas bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4129</td><td>Enzima</td></tr><tr><td>Beta-lattoglobulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L0130</td><td>Emulsionatore</td></tr><tr><td>Siero bovino Albumina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9048-46-8</td><td>Emulsionante</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10043-52-4</td> Centrifuga <td>elettrolitica</td></tr><tr><td></td><td>Kronton strumenti</td><td>Centrikon T-124</td><td>Per separare olio e resine</td></tr><tr><td>Pectina di agrumi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9135</td><td>Emulsionante</td></tr><tr><td>co-lipasi DAL PANCREAS SUINO</td><td>Sigma</td><td>C3028</td><td>Enzima</td></tr><tr><td>CONTACTO</td><td>Università di Granada (UGR)</td><td></td><td>https://core.ugr.es/dinaten/, ultimo accesso: 07/18/2022</td></tr><tr><td></td><td>DINATEN Università di Granada (UGR)</td><td></td><td>https://core.ugr.es/dinaten/, ultimo accesso: 07/18/2022</td></tr><tr><td>Lipasi gastrica</td><td>Lipolytech</td><td>RGE15-1G</td><td>Enzima</td></tr><tr><td>Albumina sierica umana</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>70024-90-7</td><td>Emulsionante</td></tr><tr><td>INFOGEST</td><td></td><td></td><td>http://www.proteomics.ch/IVD/</td></tr> <tr><td>Lipasi da pancreas suino, tipo II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L33126</td><td>Enzima</td></tr><tr><td>magnesio metasilicato resine</td><td>Fluka</td><td>1343-88-0</td><td>Resine per purificare l'olio</td></tr><tr><td>Micro 90</td><td>Prodotti internazionali</td><td>M-9051-04</td><td>Detergente</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>7647-14-5</td><td>Elettrolita</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Scharlau</td><td>10049-21-5</td><td>Per preparare il tampone</td></tr><tr><td>OCTOPUS</td><td>Producciones Cient&iacute; ficas y T&eacute; cnicas S.L. (G&oacute; </td><td></td><td>Olio</td></tr><tr><td>d'oliva</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1514</td><td>Olio</td></tr><tr><td>pancreatico da pancreas suino</td><td>Sigma</td><td>P7545-25 g</td><td>Enzima</td></tr><tr><td>Pepsina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6887</td><td>Enzima</td></tr><tr><td>Pluronic F127</td><td>Sigma</td><td>P2443</td><td>Emulsionante</td></tr><tr><td>Pluronic F68</td><td>Sigma</td><td>P1300</td><td>Emulsionante</td></tr><tr><td>Sodio desossicolato</td><td>Sigma</td><td></td><td>Sali biliari</td></tr><tr><td>Glicodesossicolato di sodio</td><td>Sigma</td><td>C9910</td><td>Sali biliari</td></tr><tr><td>Sodio taurocolato</td><td>Sigma</td><td>86339</td><td>Sali</td></tr><tr><td>biliari Filtro siringa</td><td>Millex-DP</td><td>SLGP033R</td><td>&nbsp; Filtro per siringa 0,22 & micro; m dimensione dei pori polietersulfone</td></tr><tr><td>tripsina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1426</td><td>enzima</td></tr></tbody></table>

in vitro digestione delle emulsioni in una singola goccia tramite scambio multifase di fluidi gastrointestinali simulati

In vitro Digestion of Emulsions in a Single Droplet via Multi Subphase Exchange of Simulated Gastrointestinal Fluids

Le emulsioni vengono attualmente utilizzate per incapsulare e fornire nutrienti e farmaci per affrontare diverse condizioni gastrointestinali come obesità, fortificazione dei nutrienti, allergie alimentari e malattie digestive. La capacità di un'emulsione di fornire la funzionalità desiderata, vale a dire, raggiungere un sito specifico all'interno del tratto gastrointestinale, inibire / ritardare la lipolisi o facilitare la digeribilità, dipende in ultima analisi dalla sua suscettibilità alla degradazione enzimatica nel tratto gastrointestinale. Nelle emulsioni olio-in-acqua, le goccioline lipidiche sono circondate da strati interfacciali, dove gli emulsionanti stabilizzano l'emulsione e proteggono il composto incapsulato. Ottenere una digeribilità su misura delle emulsioni dipende dalla loro composizione iniziale, ma richiede anche il monitoraggio dell'evoluzione di quegli strati interfacciali in quanto sono sottoposti a diverse fasi della digestione gastrointestinale. Una bilancia del film superficiale a goccia pendente implementata con uno scambio multi-sottofase consente di simulare la digestione in vitro delle emulsioni in una singola goccia acquosa immersa nell'olio applicando un modello di digestione statica personalizzato. Il transito attraverso il tratto gastrointestinale è imitato dallo scambio di sottofase della soluzione originale di goccioline bulk con mezzi artificiali, imitando le condizioni fisiologiche di ciascun compartimento / fase del tratto gastrointestinale. L'evoluzione dinamica della tensione interfacciale è registrata in situ durante l'intera digestione gastrointestinale simulata. Le proprietà meccaniche delle interfacce digerite, come l'elasticità e la viscosità dilatatoria interfacciale, vengono misurate dopo ogni fase di digestione (orale, gastrica, intestino tenue). La composizione di ciascun mezzo digestivo può essere regolata per tenere conto delle particolarità delle condizioni digestive, comprese le patologie gastrointestinali e i mezzi digestivi infantili. Vengono identificati i meccanismi interfacciali specifici che influenzano la proteolisi e la lipolisi, fornendo strumenti per modulare la digestione mediante l'ingegneria interfacciale delle emulsioni. I risultati ottenuti possono essere manipolati per la progettazione di nuove matrici alimentari con funzionalità su misura come bassa allergenicità, apporto energetico controllato e ridotta digeribilità.

Questa sezione mostra diversi esempi di profili di digestione misurati con OCTOPUS. L'aspetto generale delle corrispondenze del profilo di digestione simulato è mostrato nella Figura 4B. La tensione interfacciale è solitamente rappresentata contro il tempo nel profilo della digestione. Le diverse fasi/fasi di digestione considerate sono rappresentate in diversi colori. La prima fase forma lo strato iniziale e corrisponde alla fase di adsorbimento dell'emulsionante o della proteina/tensioatti...

Una bilancia del film superficiale a goccia pendente implementata con uno scambio multi-sottofase, soprannominato OCTOPUS, consente di imitare le condizioni digestive mediante lo scambio sequenziale di sottofase della soluzione originale di massa con fluidi gastrointestinali simulati. La digestione simulata in vitro viene monitorata registrando in situ la tensione interfacciale dello strato interfacciale digerito.

In vitro Digestione delle emulsioni in una singola goccia tramite scambio multifase di fluidi gastrointestinali simulati

Emulsions are currently being used to encapsulate and deliver nutrients and drugs to tackle different gastrointestinal conditions such as obesity, ...

Il nostro metodo fornisce un modello per indagare come le emozioni vengono digerite simulando il processo di digestione in una singola goccia di aquas, che viene coperta da emulsionante e immersa in fase oleosa. Possiamo valutare l'impatto di diversi emulsionanti e l'azione di diversi componenti digestivi e progettare interfacce in grado di resistere o ritardare la digestione in diverse posizioni all'interno del tratto gastrointestinale. Possiamo misurare la tensione interfacciale in C2 durante l'intero processo di digestione simulato e l'elasticità e la viscosità dello strato interfacciale alla fine della fase di digestione.Le concentrazioni e le condizioni della digestione possono essere adattate alle esigenze dell'esperimento, e questo può essere applicato sequenzialmente, o contemporaneamente permettendo di valutare sinergismo ed effetti cumulativi. E lavoriamo con una singola goccia, quindi abbiamo bisogno di una quantità molto bassa di campione, e abbiamo un controllo ad alta precisione delle variabili sperimentali. Abbiamo applicato questa tecnica per progettare una strategia per prendere il sopravvento.Uno di questi approcci è quello di progettare nello strato fossile che ritira o riceve il processo di lipolisi. Un altro approccio è l'uso di innovatori della lipasi e abbiamo studiato il meccanismo d'azione interfacciale della lipasi. Questo dispositivo è stato originariamente sviluppato per studiare la digestione in vitro.Tuttavia, può essere utilizzato per lo studio mono e l'interazione con i lipidi, e può anche essere applicato per studiare automaticamente la microconcentrazione critica. La tecnica sperimentale è accessibile. Un ricercatore manuale è stato addestrato a usarlo in una settimana.È necessario pulire accuratamente l'apparecchiatura e purificare i campioni e l'olio per prevenire la presenza di contaminanti attivi superficiali. È necessario acquisire familiarità con il computer del software e imparare a controllare le luci e la posizione delle capacità e sbarazzarsi di minuscole bolle. Per iniziare, goccia d'acqua formale per controllare la tensione superficiale dell'acqua a temperatura ambiente.Imposta la densità differenziale dell'acqua dell'aria nella finestra di dialogo a sinistra e misura la tensione superficiale in tempo reale. per cinque minuti. Riempire la cuvetta pulita con almeno 0,002 litri di olio vegetale pulito e posizionarla nel supporto della cuvetta nella cella termostatica.Impostare la densità differenziale all'acqua dell'olio vegetale e iniettare 40 microlitri ad una velocità di 0,5 microlitri al secondo. Misurare la tensione in tempo reale ogni secondo fino alla fine dell'iniezione. Questo è un semplice processo dinamico.Quindi, salvare i dati e tracciare la tensione interfacciale in funzione del volume delle goccioline e di una scheda tecnica. Verificare che l'intervallo di volume delle gocce fornisca un valore per la tensione interfacciale indipendente dal volume delle gocce per l'acqua pulita. Tracciare l'area interfacciale in funzione del volume delle gocce.Questa curva verrà utilizzata in seguito per abbinare il volume con l'area interfacciale corrispondente. Con la siringa sinistra, iniettare il volume entro l'intervallo di tensione interfacciale costante e registrare la tensione interfacciale per cinque minuti. Questo per verificare l'assenza di componenti tensioattivi nel sistema.Per eseguire il controllo iniziale, iniettare circa 10 microlitri della soluzione emulsionante nel capillare per la formazione di gocce e registrare l'assorbimento in un'area interfacciale costante di circa 20 millimetri quadrati per un'ora. I valori esatti di volume e area possono essere ottenuti dalla curva di calibrazione tracciata in precedenza. Programmare la reologia diluitiva impostando l'ampiezza dell'oscillazione a 1,25 microlitri nel periodo a 10 secondi.Quindi programmare l'assorbimento nell'area interfacciale selezionata per 10 secondi. Successivamente, per registrare il programma di digestione gastrica l'assorbimento nell'area interfacciale selezionata per 10 secondi. Riempire la siringa sinistra con il liquido della valvola due.Iniettare 125 microlitri dalla valvola due a cinque microlitri al secondo con la siringa sinistra e contemporaneamente estrarre lo stesso volume alla stessa velocità con la siringa destra. Questa è una visualizzazione del processo di scambio di sottofase dell'acqua con il blu di metilene. Scaricare la siringa destra per uscire dalla valvola otto e caricare nuovamente la siringa sinistra con il liquido della valvola due.Ripetere questi due passaggi 10 volte per assicurare lo scambio completo della sottofase con liquido e valvola due ed enzimi gastrici. Quindi, registrare l'assorbimento nell'area interfacciale selezionata per un'ora e registrare la reologia diluitiva come mostrato in precedenza. Per registrare la digestione intestinale dopo aver registrato l'assorbimento nell'area interfacciale selezionata, riempire la siringa sinistra con liquido dalla valvola tre e seguire gli stessi passaggi mostrati in precedenza per registrare la digestione gastrica.Allo stesso modo, per registrare il desorbimento, dopo aver registrato l'assorbimento nell'area interfacciale selezionata, riempire la siringa sinistra con il liquido della valvola cinque e ripetere il resto dei passaggi utilizzati per registrare la digestione gastrica. Riempire i tubi della microcentrifuga con il mezzo di digestione artificiale e collegare ciascuno di essi alla rispettiva valvola tramite il tubo corrispondente. Riempire il tubo nelle valvole da due a otto pulendo dalla valvola due, dalla valvola tre, dalla valvola quattro e dalla valvola cinque fino all'uscita esterna che è la valvola otto.Riempire il tubo nella valvola uno pulendo dalla valvola uno alla valvola sei capillari cinque volte. Posizionare il capillare nella fase oleosa e caricare la siringa sinistra con la valvola uno. Inizia a elaborare in sequenza il controllo iniziale della digestione gastrica, della digestione intestinale e del desorbimento, salvando i dati alla fine di ogni processo.I risultati sperimentali ottenuti per la digestione gastrica degli emulsionanti sono mostrati in queste figure. Qui viene presentata la proteolisi gastrica dell'albumina sierica umana. I mezzi digestivi vengono applicati mediante scambio di sottofasi con soluzioni a 37 gradi Celsius.Qui il blu rappresenta il tampone iniziale con proteine e il rosso rappresenta SGF semplificato con pepsina. Durante lo scambio di sottofase con SGF semplificato e pepsina, la tensione interfacciale aumenta a causa dell'idrolisi della proteina, che diluisce lo strato proteico iniziale. L'immagine grafica rappresenta la lipolisi gastrica della pectina di agrumi.Qui, il blu rappresenta il buffer iniziale con pectina di agrumi, il giallo rappresenta SGF semplificato con lipasi gastrica e il grigio rappresenta SGF semplificato. Lo scambio di sottofasi con la lipasi gastrica diminuisce la tensione superficiale mentre lo scambio di sottofasi con SGF semplificato, fornisce una risposta nulla della tensione interfacciale. Di seguito è riportato un esempio dei profili di digestione intestinale.Assorbimento, desorbimento, profili di sali biologici, lipasi e lipasi più sali biliari in SIF semplificato a 37 gradi Celsius sono presentati qui. L'immagine grafica mostra l'evoluzione della tensione interfacciale per lipolisi di due varianti di plueronic F127 e F68. Una forte diminuzione può essere osservata nella tensione interfacciale dovuta all'assorbimento di lipasi e sali biliari e alla produzione di acidi grassi liberi su film interfacciali precedentemente formati di F68 e F127 all'interfaccia olio.La fase di desorbimento mostra lo scambio di sottofase con SIF semplificato da sali biliari, F68 e F127. Profilo di digestione in vitro del film assorbito da AS48 all'interfaccia aria-acqua nei film di albumina sierica umana e bovina all'interfaccia olio-acqua. Le immagini rappresentative mostrano la tensione interfacciale, l'elasticità della dilatazione e la viscosità di dilatazione della digestione in vitro del film assorbito dalla beta lattoglobulina all'interfaccia olio-acqua.I parametri di dilatazione sono stati misurati a 1 hertz, 0,1 hertz e 0,01 hertz dopo che l'interfaccia digerita è stata equilibrata in ogni passaggio. È importante abbinare le sfere quando si programma il processo con i corrispondenti tubi di centrifuga, capillare o asse, l'evoluzione della distribuzione del sito di caduta, quindi, la mobilità elettroforetica imposta un potenziale di goccioline e l'acido grasso libero amminico produce nella lipolisi offre informazioni complementari alla corrispondenza con i risultati della tensione interfacciale. Questa tecnica fornisce strati interfacciali con diversi profili di digeribilità per fornire nutrienti e farmaci in diverse posizioni all'interno del tratto gastrointestinale e anche per sviluppare nuovi sistemi di incapsulamento.

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In vitro Ricostituzione di reti citoscheletriche all'interno di vescicole unilamellari giganti separate di fase (GUV)

Scopri la digestione in vitro di emulsioni in una singola goccia tramite scambio multifase di fluidi gastrointestinali simulati. Questo metodo permette di monitorare in tempo reale la tensione interfaciale durante la digestione.

In vitro Digestione delle emulsioni in una singola goccia tramite scambio multifase di fluidi gastrointestinali simulati

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