Creazione di un ginocchio joint-on-a-chip per la modellazione delle malattie articolari e la sperimentazione di farmaci

La nostra capacità di prevedere con precisione come gli esseri umani rispondono ai farmaci durante gli studi clinici è limitata a causa della mancanza di modelli preclinici fisiologicamente rilevanti. Questo sistema microfisiologico può affrontare tale disparità. Questo sistema derivato da cellule umane imita accuratamente l'intera natura della malattia articolare dell'osteoartrite nel ginocchio umano, che consente di testare i farmaci per l'osteoartrite modificanti la malattia prima degli studi clinici, risparmiando potenzialmente milioni di dollari.

Iniziare a preparare gelatina metacrilata, o GelMA, aggiungendo 17 grammi di gelatina di tipo B a 500 millilitri di acqua distillata. Mescolare per 30 minuti su uno shaker a 37 gradi Celsius e aggiungere 13 millilitri di anidride metacrilica prima di mescolare durante la notte su uno shaker. Il giorno successivo, preparare circa 60 millilitri di aliquote del GelMA in sacche di dialisi.

Mettere tutte le sacche di dialisi in acqua distillata con una barra di mescolamento per sette giorni. Cambia l'acqua più volte al giorno e lascia i sacchetti a quattro gradi Celsius durante la notte. Il settimo giorno, versare il GelMA in un piatto e congelarlo a meno 80 gradi Celsius prima della liofilizzazione.

Quindi, liofilizzare il GelMA posizionandolo nella camera a vuoto di un liofilizzatore. Assicurarsi la completa asciugatura prima della rimozione dal liofilizzatore. Quindi, sciogliere il GelMA liofilizzato nella soluzione salina bilanciata di Hanks al 15% di concentrazione e regolare il pH a 7,4 utilizzando una piccola quantità di idrossido di sodio.

Sulla base del volume acquisito, integrare la soluzione con antibiotico antimicotico e 0,15% litio fenil fosfinato, o LAP. Proteggere la soluzione GelMA dalla luce e conservarla a meno 20 gradi Celsius fino a un ulteriore utilizzo. Camere di bioreattore a doppio flusso stampate in 3D in autoclave, coperchi e inserti in sacchetti per autoclave a 121 gradi Celsius per 20 minuti con vapore.

E poi, per 20 minuti con calore secco. Dopo la sterilizzazione, immergere le camere del bioreattore, i coperchi e gli inserti in 15 millilitri di PBS sterile durante la notte all'interno dell'armadio di biosicurezza, seguito da un'asciugatura completa. Utilizzando una pipetta da 1000 microlitri, risospendere 20 volte 10 alla sesta cellula staminalizzata mesenchimale derivata dal midollo osseo umano, o MSC, per millilitro di cellule in una soluzione di GelMA al 15%.

Quindi, premere uno stampo di silicone sterile e asciutto contro una capsula di Petri, usando guanti sterili. Inserire un inserto in ciascun foro dello stampo in silicone con una pinza con il lato del foro dell'inserto rivolto verso il basso. Una volta fatto, aggiungere circa 50 microlitri di sospensione cellulare per inserto utilizzando una pipetta da 200 microlitri.

Reticolare il gel all'interno dell'inserto esponendo la parte superiore a una torcia UV a lunghezza d'onda di 395 nanometri per 1,5 minuti, quindi illuminando l'altro lato per 30 secondi. Con una pinza sterile, trasferire immediatamente gli inserti in otto millilitri di terreno di coltura in una piastra a sei pozzetti di coltura non tissutale e consentire alle cellule di recuperare durante la notte. Per avviare la differenziazione del tessuto adiposo, trasferire gli inserti in otto millilitri di terreno adipogeno e coltivarli per 28 giorni con cambio giornaliero del mezzo.

Per progettare le unità osteocondrali, posizionare gli inserti nelle camere del bioreattore a doppio flusso, tappare i pozzetti e infondere i due flussi separatamente a una portata di cinque microlitri al minuto con 35 millilitri di mezzo osteogenico e 35 millilitri di mezzo condrogeno. Mantenere le cellule per la differenziazione per 28 giorni eseguendo cambi di siringa bisettimanali con i rispettivi tipi di mezzo. Per ricavare i fibroblasti, differenziare le MSC in coltura 2D in un matraccio di coltura di cellule tissutali T di 150 centimetri quadrati contenente 20 millilitri di terreno fibrogenico per 21 giorni.

Mantenere il cambio settimanale del mezzo. Dopo 21 giorni, utilizzare quattro millilitri di tripsina per staccare le cellule. Incapsula i gel 3D all'interno degli inserti.

Per ottenere tessuto fibroso simil-sinoviale, o SFT, seguire un protocollo simile. Collegare il tubo in silicone, con un diametro interno di 0,062 pollici e un diametro esterno di 0,125 pollici, alla barra del bioreattore minijoint a un'estremità e ai connettori di blocco esca F 1/16th all'altra estremità. Quindi, autoclavare i bioreattori minijoint 3D insieme ai tubi e ai coperchi in silicone.

Preparare e caricare 35 millilitri di terreno da utilizzare per la coltura miniarticolare nei serbatoi medi. Utilizzare una pinza dritta per trasferire le unità osteocondrali dal bioreattore a doppio flusso al pozzetto destro del bioreattore miniarticolare. Trasferire l'inserto di tessuto adiposo e l'inserto di tessuto fibroso nei pozzetti sinistro e centrale, rispettivamente, prima di coprire tutti i pozzetti con coperchi sterilizzati.

Collegare le prese a clip minijoint ai serbatoi medi e le uscite alle siringhe. Quindi, montare le siringhe su una pompa a siringa. Trasferire la pompa e i trucioli in un'incubatrice.

Posizionare i serbatoi medi sul ghiaccio all'esterno dell'incubatore. Far funzionare la pompa in modalità di prelievo, aspirando il mezzo dal serbatoio del mezzo nella camera del bioreattore minijoint. Continuare questo processo di coltura miniarticolare per 28 giorni.

Per modellare l'infiammazione articolare e la degenerazione della cartilagine, aggiungere l'interleuchina una beta al ceppo medio fibrogenico a 10 nanogrammi per millilitro per sette giorni. Assicurarsi di sostituire la siringa il terzo giorno prima di fornire interleuchina fresca una beta al mezzo fibrogenico. Per il test farmacologico, dopo tre giorni di trattamento con interleuchina una beta, somministrare il farmaco sia nel mezzo condiviso, simulando una somministrazione intraarticolare, sia in tutti i tipi di mezzo, simulando una somministrazione sistemica.

Dopo sette giorni di trattamento con interleuchina una beta, raccogliere singoli tessuti per l'analisi. Dopo aver rimosso gli inserti con una pinza sterile, spingere un pugno bioptico attraverso il centro dell'inserto per rimuovere il gel e posizionare il gel in PBS. Quindi, tagliare i gel osteocondrali a metà mentre si valuta l'espressione genica.

Raccogliere e centrifugare circa 1,5 millilitri di terreno da ciascuna fonte di mezzo a 14.000 G per 10 minuti. Dopo aver scartato il sedimento, congelare i mezzi condizionati in azoto liquido. Per la colorazione istologica e la colorazione immuno, in primo luogo, fissare il tessuto fibroso osteocondrale e simil-sinoviale, o campioni SFT, in formalina tamponata al 10% e disidratarli in etanolo di concentrazioni ascendenti.

Eliminare il campione in xilene, incorporarli in paraffina e, infine, sezionare i campioni in uno spessore di sei micrometri. Nel caso del tessuto adiposo, colorare direttamente i campioni formali e fissi tamponati al 10%, con una soluzione di O rosso olio o BODIPY. I fenotipi specifici del tessuto erano ben mantenuti per i singoli micro tessuti.

Tutti i tessuti della miniarticolazione sono stati raccolti per analizzare i loro fenotipi dopo 28 giorni di coltura. La componente ossea dei microtessuti delle unità osteocondrali esprimeva alti livelli di osteocalcina. Nella porzione cartilaginea dell'osteocondrale, i tessuti esprimevano livelli significativamente elevati di collagene di tipo due e aggrecano.

I livelli di espressione dei geni adipogenici rappresentativi, dell'adiponectina e della leptina erano più alti nel tessuto adiposo. La deposizione di minerali di calcio, fosfatasi alcalina e proteina osteocalcina è stata osservata principalmente nelle dimensioni ossee dei micro tessuti osteocondrali. Il lato cartilagineo dei tessuti osteocondrali ha mostrato glicosaminoglicani e collagene di tipo due ben conservati.

L'espressione dei marcatori associati all'ipertrofia dei condrociti, collagene di tipo 10 e riccio indiano, è stata significativamente sotto-regolata dopo 28 giorni di coltura. Un'abbondante deposizione di goccioline lipidiche è stata trovata nel tessuto adiposo. La colorazione immunofluorescente ha mostrato una robusta espressione di lubricina e caderina 11 da parte della SFT dopo quattro settimane di coltura.

In un modello di malattia, il trattamento con IL one beta ha provocato apoptosi cellulare e livelli elevati di MMP-13 nella SFT. La degradazione della cartilagine è stata trattata con IL one beta, suggerendo l'insorgenza di diafonia tra i tessuti osteocondrali e SFT. L'efficacia terapeutica del naprossene attraverso la somministrazione sistemica ha mostrato una ridotta degradazione della cartilagine in IL one beta minijoint.

La PCR in tempo reale ha indicato che i quattro potenziali farmaci modificanti l'osteoartrite hanno parzialmente invertito la perdita di cartilagine. I passaggi più importanti di questa procedura includono la reticolazione dei gel negli inserti e il posizionamento dell'inserto nel bioreattore. Il chip consente di studiare il contributo di altri fattori di rischio offerti nell'osteoartrite, come l'obesità e le lesioni meccaniche.

Può anche essere usato per studiare altre malattie articolari.