In vivo Imaging del calcio a campo largo e a due fotoni da un topo utilizzando una grande finestra cranica

Questo protocollo mostra una creazione di una grande finestra cranica per misurare le attività di prenotazione a campo largo e a singola cellula nello stesso topo. Utilizzando il nostro metodo, la finestra cranica grande e stabile può essere realizzata con un involucro alimentare a basso costo. Questo metodo è efficace per studiare le attività neurali e gliali durante il comportamento a livello macroscopico e microscopico.

Si consiglia di iniziare con una piccola finestra cranica. Quindi, se ci riesce, aumentare le dimensioni della finestra. Inizia rimuovendo il cemento extra sul cranio con un trapano dentale.

Segna l'area da tagliare con una penna. Tagliare l'osso usando un bisturi con una punta smussata per assicurarsi che la punta non penetri nel cranio. Raschiare ripetutamente l'osso con un bisturi per approfondire il solco fino a quando l'osso nella zona da tagliare si muove quando viene leggermente toccato.

Rimuovere l'osso inciso con una pinzetta sottile. Fai attenzione a non spingere il lembo osseo nel cervello che potrebbe danneggiare il cervello. Per rimuovere la dura madre, tagliare la dura usando una pipetta di vetro tirata con una punta affusolata di circa 10 micrometri.

Utilizzare un ago a forma di U per espandere questo taglio su tutta la finestra. Sotto un microscopio stereo impostato su zoom da 60 a 100x, rimuovere la dura madre recisa con pinzette ultra sottili. In caso di sanguinamento, Risciacquare con aCSF o utilizzare una spugna di gelatina per fermare l'emorragia.

Quindi, sterilizzare un grande pezzo di involucro PVDC in autoclave e con etanolo al 70%. Sotto un microscopio stereo, utilizzare una pinzetta e un bisturi per ritagliare un involucro della dimensione richiesta. Posizionare l'involucro sulla superficie del cervello lasciando l'aCSF sulla superficie.

Aspirare l'aCSF dal bordo dell'involucro, permettendo all'involucro di aderire saldamente alla superficie del cervello. Tagliare l'involucro con un bisturi e una pinzetta in modo tale che ci sia un margine di circa un millimetro tra il bordo della finestra cranica e l'involucro. Una volta che l'involucro è in posizione, incollare il bordo dell'involucro al cranio con un adesivo biologico.

Lasciare asciugare l'adesivo per circa 30 minuti. Utilizzando un dosatore con una punta di miscelazione, applicare un elastomero di silicone trasparente sulla parte superiore dell'involucro. Posizionare il vetro di copertura di spessore da 0,12 a 0,17 millimetri sulla parte superiore.

Sigillare il perimetro del vetro di copertura con pellicola impermeabile, supercolla o cemento dentale. In primo luogo, mescolare soluzioni di fibroina e AAV in un rapporto da uno a quattro in una piccola provetta di campione. Far cadere un'aliquota della soluzione sull'involucro di plastica per la finestra cranica e asciugarla per almeno tre ore.

Quindi attaccare l'involucro alla superficie del cervello come mostrato nella sezione precedente. Controlla regolarmente le condizioni dei topi e delle finestre, da due a quattro settimane. A questo punto, gli indicatori di calcio geneticamente codificati saranno espressi sufficientemente dopo aver creato la finestra trattata con AAV.

Utilizzando questo protocollo, le finestre craniche potrebbero essere mantenute in otto topi su 10 per un massimo di 10 settimane. Viene creata un'ampia finestra con un involucro di plastica, silicone trasparente e vetro di copertura in un topo transgenico che esprime un indicatore di calcio geneticamente codificato ancorato alla membrana negli astrociti. L'imaging del calcio ad ampio campo è stato eseguito attraverso questa finestra e sono stati osservati cambiamenti di fluorescenza quando la stimolazione del soffio d'aria è stata applicata ai baffi controlaterali.

Il decorso temporale del cambiamento di fluorescenza nella corteccia somatosensoriale ha mostrato attività corticale. L'imaging a due fotoni ha permesso l'osservazione di immagini di fluorescenza a singola cellula specifiche per le cellule gliali. I cambiamenti di fluorescenza indotti dalla stimolazione sensoriale sono stati osservati in singole cellule provenienti da diverse regioni corticali.

Avvolgere codificato con AAV che esprime un indicatore di calcio geneticamente codificato e la fibroina è stata utilizzata per creare la finestra cranica. L'imaging del calcio ad ampio campo ha mostrato un'attività corticale che si propaga attraverso la corteccia indotta dalla stimolazione sensoriale da due a quattro settimane dopo l'intervento chirurgico. Poiché la finestra era grande, sono state visualizzate diverse aree corticali dello stesso topo e sono stati osservati cambiamenti di fluorescenza indotti dalla stimolazione sensoriale nelle singole cellule.

È importante evitare danni al cervello quando si crea una finestra cranica. Si possono eseguire compiti comportamentali su topi con una grande finestra cranica. Ciò consentirà di esaminare la relazione tra attività neurale e comportamento del topo.

Questo metodo può essere applicato a una varietà di studi neuroscientifici. Ad esempio, può essere utilizzato per osservare l'attività corticale durante i compiti decisionali, la corsa motoria e in modelli di massa di lesioni cerebrali e malattie.