Name: Ex Vivo Analisi di transitori di Ca2+ attivati meccanicamente in cellule uroteliali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-28T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 35 s
Description: Scopri come analizzare i transitori di Ca²⁺ attivati meccanicamente in cellule uroteliali ex vivo utilizzando il sensore fluorescente GCaMP5G. Questo protocollo permette di studiare la meccanotrasduzione nella vescica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni NIH R01DK119183 (a G.A. e M.D.C.) e S10OD028596 (a G.A.) e dal Cell Physiology and Model Organisms Kidney Imaging Cores del Pittsburgh Center for Kidney Research (P30DK079307).

La cura e la gestione degli animali sono state effettuate in conformità con il Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Pittsburgh. Per il presente studio sono stati utilizzati topi femmina C57Bl/6J di 2-4 mesi. I topi sono stati ottenuti commercialmente (vedi Tabella dei materiali).
1. Assemblaggio e configurazione dell'attrezzatura
<ol><li>Eseguire l'imaging Ca2+ con un microscopio verticale dotato di una fotocamera ad alta risoluzione e di una sorgente luminosa stabile (vedere Tabella dei materiali).<ol><li>Acquisire le immagini con un software compatibile con il microscopio che consente il controllo diretto della telecamera, della sorgente luminosa e dell'attuatore piezoelettrico tramite un dispositivo I/O digitale USB (vedere Tabella dei materiali). Nota : la Figura 1 rappresenta uno schema dell'installazione. GCaMP5G ha una lunghezza d'onda di eccitazione di picco di 470 nm e una lunghezza d'onda di emissione di picco di 497 nm28. Utilizzare un cubo filtro adatto per l'imaging GCaMP5G.</li>
	</ol></li>
	<li>Per la stimolazione delle singole cellule uroteliali nella preparazione della mucosa vescicale (vedere fase 2), utilizzare un attuatore piezoelettrico controllato da un controller piezoelettrico ad anello aperto a canale singolo (vedere Tabella dei materiali). Montare l'attuatore piezoelettrico in un micromanipolatore.<ol><li>Montare le micropipette di vetro in un portapipette fissato all'attuatore piezoelettrico (Figura 1). Azionare a distanza il controllore piezoelettrico tramite un convertitore analogico/digitale controllato da un programma di acquisizione e analisi dei dati elettrofisiologici (vedere Tabella dei materiali). NOTA: Un trigger esterno, sotto forma di un segnale logico transistor-transistor (TTL) avviato dal software di imaging, viene utilizzato per attivare il protocollo di stimolazione nel software di acquisizione e analisi dei dati elettrofisiologici che muove l'attuatore piezoelettrico (Figura 1).</li>
	</ol></li>
	<li>Assicurarsi che il software di imaging (vedere Tabella dei materiali) si interfacci con il dispositivo di I/O digitale. Configurare un canale di uscita digitale nel dispositivo I/O digitale USB per fornire il segnale TTL al convertitore analogico/digitale, che avvierà il protocollo nel software di elettrofisiologia che muove l'attuatore piezoelettrico.<ol><li>Utilizzare un cavo per collegare la porta Start BNC nel convertitore analogico/digitale a terra (GND) e un terminale a vite nel dispositivo I/O digitale USB.</li>
	</ol></li>
	<li>Impostare il protocollo di registrazione nel software di imaging. NOTA: i passaggi seguenti descrivono come generare un protocollo che invierà un segnale TTL e inizierà a raccogliere immagini a intervalli di tempo specificati.<ol><li>Impostare il protocollo di acquisizione nel software di imaging facendo clic su Gestione esperimenti e selezionando Nuovo esperimento. Si aprirà una nuova finestra.</li>
		<li>Selezionare l'icona Time Lapse Loop e trascinarla nella finestra appena aperta; Impostare il numero di cicli su 2 e l'intervallo sull'impostazione più veloce consentita nella configurazione.</li>
		<li>Dall'icona Transmitted Shutter/Manual Shutter, selezionare l'icona NI USB-6501 e trascinarla nella finestra Time Lapse Loop, quindi impostare NI USB-6501 come chiuso. Trascinare un NI USB-6501 aggiuntivo da Transmitted Shutter/Manual Shutter nella finestra Time Lapse Loop e impostarlo come aperto. Per collegare le due icone NI USB-6501, trascinare la punta della freccia sul lato dell'icona chiusa NI USB-6501 e tirare fino a toccare l'icona di apertura di NI USB-6501. Apparirà una linea che collega entrambe le icone.</li>
		<li>Trascina un altro loop Time Lapse nella finestra di Gestione esperimenti e collegalo al primo tirando la punta della freccia. Impostare i parametri per la registrazione. Impostare il numero di cicli del nuovo Time Lapse Loop su 2400.</li>
		<li>Dall'icona Acquisizione immagini , trascinare il filtro GFP nel Time Lapse Loop aperto di recente e impostare il tempo di esposizione su 100 ms.</li>
		<li>Impostare il tipo di immagine della fotocamera su 8 bit, la risoluzione su 576 x 576 (Binning 4 x 4), il pixel clock su 480 MHz e la correzione hot pixel su standard. NOTA: i parametri possono essere regolati in base al livello di espressione del sensore fluorescente, alla sensibilità della fotocamera e alla configurazione di configurazione.</li>
	</ol></li>
	<li>Configurare il banco da laboratorio nel software di elettrofisiologia (vedere Tabella dei materiali). NOTA: questo definirà il segnale di uscita in mV del convertitore analogico/digitale.<ol><li>Andare al menu Configura nel software di elettrofisiologia e selezionare Lab Bench. Nella finestra Segnali di uscita risultante, selezionare Uscita analogica #1, premere il pulsante Aggiungi segnale e assegnargli un nome (ad esempio, "Piezo"). Impostare l'unità di segnale su mV e il fattore di scala (mV/V) su 1.</li>
	</ol></li>
	<li>Generare un protocollo di stimolazione nel software di elettrofisiologia seguendo i passaggi seguenti.<ol><li>Per generare un nuovo protocollo di stimolazione nel software di elettrofisiologia, andare alla voce di menu Acquisisci e selezionare Nuovo protocollo.</li>
		<li>Impostare Modalità/Frequenza su Stimolazione episodica, Corsa/Prova su 1, Sweep/Run su 1 e Durata sweep su 150.</li>
		<li>Nel menu Outputs , selezionare il canale #1 Piezo come uscita analogica.</li>
		<li>Nel menu Trigger , impostare il trigger su Digitizer Start Input e Internal Timer.</li>
		<li>Nel menu Forma d'onda, selezionate il canale #1 e Forma d'onda analogica con epoche. Impostare il passaggio A su Passo, Primo livello su 0, Livello delta su 0, Prima durata su 10000 e Durata delta su 0.</li>
		<li>Impostare il passaggio B su Step, First level su 10, Delta level su 0, First Duration su 1000 e Delta Duration su 0. Impostare il passaggio C su step, First Level su 0, Delta Level su 0, First Duration su 130000 e Delta Duration su 0.</li>
		<li>Salvare il protocollo e denominarlo Protocollo di stimolazione.</li>
	</ol></li>
	<li>Utilizzare un cavo BNC per collegare l'uscita analogica #1 nel convertitore analogico/digitale all'EXT INPUT nella parte anteriore del controller piezoelettrico ad anello aperto a canale singolo (vedere Tabella dei materiali).</li>
	<li>Fabbricare micropipette di vetro per la stimolazione meccanica delle celle a ombrello da tubi di vetro capillari seguendo i passaggi seguenti.<ol><li>Posizionare il vetro capillare in un estrattore (vedere Tabella dei materiali) e regolarlo con le manopole di fissaggio capillare.</li>
		<li>Posizionare l'unità riscaldante alla sua piena altezza. Regolare il primo cursore della posizione di terminazione di trazione dell'estrattore su 5.</li>
		<li>Impostare la prima manopola del riscaldatore su 76,7 e la seconda manopola su 52,7.</li>
		<li>Tirare il capillare di vetro in due passaggi premendo il pulsante di avvio.</li>
		<li>Chiudere la punta della micropipetta con una microforgia (vedere Tabella dei materiali) con la manopola di regolazione del riscaldatore impostata su 60. NOTA: Per il presente protocollo, il diametro finale della punta della micropipetta utilizzata per colpire le singole cellule è ~1-3 μm.</li>
	</ol></li>
	<li>Verificare che la micropipetta stimolante si muova alla distanza specificata nel protocollo di stimolazione. NOTA: I seguenti passaggi servono a garantire che 12,5 s dopo l'avvio del protocollo di stimolazione nel software di elettrofisiologia, venga generato un impulso di tensione con una durata di 1 s, facendo muovere l'attuatore piezoelettrico di 20 μm.<ol><li>Montare una micropipetta nel supporto e collegarla all'attuatore piezoelettrico.</li>
		<li>Posizionare l'attuatore piezoelettrico e la micropipetta collegata parallelamente al centro dello stadio del microscopio e all'interno dell'area di vista.</li>
		<li>Concentrarsi sulla punta della pipetta e immobilizzare l'asta di montaggio piezoelettrica (vedere Tabella dei materiali) con del nastro adesivo. Sotto l'illuminazione a campo chiaro, regolare i parametri della telecamera per ottenere un'immagine chiara della punta della pipetta.</li>
		<li>Apri il protocollo di stimolazione nel software di elettrofisiologia e impostalo per la riproduzione. NOTA: il protocollo di elettrofisiologia non verrà avviato fino a quando non verrà ricevuto il segnale TTL inviato dal software di imaging.</li>
		<li>Da Experiment Manager nel software di imaging, premere Start per avviare l'acquisizione dei dati. NOTA: Questo attiverà il protocollo nel software di elettrofisiologia, che guiderà l'attuatore piezoelettrico. Il protocollo nel software di imaging genererà un file con le immagini dell'esperimento.</li>
	</ol></li>
	<li>Verificare la distanza percorsa dalla pipetta attenendosi alla seguente procedura.<ol><li>Per misurare la distanza percorsa dalla pipetta durante il protocollo di stimolazione, selezionare la voce Conta e misura nel software di imaging.</li>
		<li>Dal menu Misura , seleziona l'opzione Misurazione e ROI e verrà visualizzata una nuova finestra sotto la finestra del filmato.</li>
		<li>Dal menu Misura , scegliete Linea arbitraria.</li>
		<li>Nella finestra del filmato, tracciare una linea arbitraria a partire dalla punta della pipetta. Si noti che la fine della riga arbitraria verrà modificata in seguito.</li>
		<li>Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla linea arbitraria per convertire la linea in una regione di interesse (ROI), che sarà visibile in tutti i fotogrammi del filmato.</li>
		<li>Ispezionare il filmato e regolare la fine della linea arbitraria (ROI) sulla posizione finale percorsa dalla pipetta in risposta allo stimolo. NOTA: la distanza percorsa dalla pipetta in μm verrà visualizzata nella finestra Misurazione e ROI . Il protocollo di stimolazione può essere modificato in base alle esigenze dell'utente.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Trasduzione in situ e isolamento della mucosa vescicale
<ol><li>Trasdurre vescice di topo femmina in situ con un adenovirus che codifica il cDNA di CGaMP5G secondo la procedura descritta nel protocollo di trasduzione del virus31.<ol><li>Quando si trasducono cellule uroteliali per esperimenti di imaging Ca2+ , instillare nelle vesciche 50 μL della soluzione contenente 2 x 107 particelle virali infettive (IVP). NOTA: Questa tecnica tende a limitare l'espressione di CGaMP5G allo strato di cella dell'ombrello. In alternativa, gli esperimenti potrebbero essere condotti con vesciche urinarie raccolte da topi transgenici che esprimono CGaMP5G in cellule uroteliali (cioè espressione di GCaMP5G guidata da un promotore uroplakin-2) o qualsiasi altro tipo di cellula di interesse.</li>
	</ol></li>
	<li>24-72 ore dopo la trasduzione, eutanasia dei topi mediante asfissia CO2 ed eseguire una toracotomia aprendo la cavità toracica con le forbici per causare il collasso dei polmoni.</li>
	<li>Canulare l'uretra con un catetere da 24 G. Esporre la vescica con un'incisione addominale di ~ 1,5 cm attraverso la pelle e il muscolo e utilizzare una sutura 6.0 (vedere Tabella dei materiali) per fissare il catetere all'uretra.</li>
	<li>Raccogliere la vescica e l'uretra32 e fissarle su un cuscinetto di gomma siliconica (vedi Tabella dei materiali) immerso in una soluzione di registrazione contenente (in mM): 135 NaCl, 5,0 KCl, 1 MgCl 2, 2,5 CaCl 2, 10 glucosio, 10 HEPES, pH 7,4 e bollire con 100% O2 (Figura 2A).</li>
	<li>Separare la mucosa della vescica dallo strato muscolare sottostante con una pinza fine seguendo i rapporti32 precedentemente pubblicati (Figura 2B).</li>
	<li>Tagliare la mucosa della vescica e fissarla con l'urotelio rivolto verso l'alto fino a un inserto in elastomero siliconico sul fondo di una capsula di coltura in tessuto di 35 mm di diametro (Figura 2C).</li>
</ol>3. Stimolazione meccanica delle singole cellule uroteliali e imaging Ca2+
<ol><li>Montare il piatto coltivato in tessuto con la mucosa della vescica appuntata nello stadio del microscopio dotato di un incubatore di piatti di coltura con elementi riscaldanti resistivi (Figura 2E). Perfondere (seguendo le istruzioni del produttore, vedere Tabella dei materiali) il piatto di coltura cellulare in modo continuo ad una velocità di 1,7 ml / min con soluzione di registrazione riscaldata a ~ 37 ° C con un riscaldatore in linea.</li>
	<li>Mantenere la temperatura dell'incubatore di piastre tissue e delle soluzioni a ~37 °C con un modello di regolatore di temperatura bipolare a doppio canale (vedere Tabella dei materiali). Equilibrare il tessuto nella camera con perfusione continua per almeno 15 minuti prima di condurre ulteriori procedure sperimentali.</li>
	<li>Per registrare i transitori Ca2+ indotti meccanicamente, immergere la micropipetta nella soluzione bagnando la mucosa della vescica bloccata nel piatto di tessuto. Spostare la micropipetta al centro del campo con l'aiuto di un obiettivo di scansione a basso ingrandimento (4x) utilizzando l'illuminazione a campo luminoso.<ol><li>Spostare la micropipetta vicino alla superficie del tessuto uroteliale spostando coordinatamente il micromanipolatore sul piano verticale e regolando la messa a fuoco.</li>
		<li>Passare l'obiettivo a uno con un ingrandimento maggiore (20x) adatto per l'immunofluorescenza con un'elevata apertura numerica (NA).</li>
		<li>Impostare il micromanipolatore su Fine e spostare la micropipetta vicino alla parte superiore della cella target.</li>
		<li>Modificare il campo visivo sulla fotocamera e premere Live nel software di imaging. NOTA: Questo deve accendere l'otturatore riflesso e consentire l'osservazione del segnale fluorescente emesso dal tessuto nel computer.</li>
		<li>Regolare la messa a fuoco per visualizzare la parte superiore della cella e, se necessario, regolare la posizione della pipetta.</li>
		<li>Apri il protocollo di stimolazione nel software di elettrofisiologia e impostalo per la riproduzione. NOTA: il protocollo nel software di elettrofisiologia non verrà avviato fino a quando non viene ricevuto il segnale TTL inviato dal software di imaging.</li>
		<li>Da Experiment Manager nel software di imaging, premere Start per avviare l'acquisizione dei dati. Ciò attiverà il protocollo nel software di elettrofisiologia, che guiderà l'attuatore piezoelettrico e genererà un file con le immagini dell'esperimento. Il protocollo di stimolazione può essere modificato in base alle esigenze dell'utente.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Analisi dei dati
<ol><li>Quantificare l'intensità della fluorescenza nel tempo seguendo i passaggi seguenti.<ol><li>Aprire il file di immagine nel software di imaging e selezionare la finestra Conteggio e misura . Selezionare lo strumento poligono e disegnare un ROI sui confini della cella che è stata colpita.</li>
		<li>Vai alla finestra Misura, seleziona Profilo di intensità, imposta la misurazione su Nel tempo, Risultati su Media, Sottrazione di sfondo su Nessuno e quindi premi Esegui. L'intensità media della fluorescenza sarà calcolata nel tempo (Figura 3).</li>
		<li>Per esportare i dati del profilo di intensità, fare clic sull'icona Excel nella finestra Risultati profilo intensità. Ciò consentirà all'utente di scegliere la cartella di destinazione e il nome del file e salvare i dati in un formato .xlsx.</li>
	</ol></li>
	<li>Eseguire l'analisi dei dati utilizzando software di grafici e analisi dei dati scientifici (vedi Tabella dei materiali). NOTA: L'ampiezza del picco di Ca2+ evocato dal poking è espressa come variazione dell'intensità di fluorescenza (ΔF/F), dove F è l'intensità di fluorescenza di GCaMP5G al tempo 0 e ΔF è la differenza tra i massimi di intensità di fluorescenza e il basale al tempo 0. Il decadimento della risposta Ca2+ può anche essere calcolato (non mostrato).</li>
</ol>

<ol><li>Kunau, R. T., Webb, H. L., Borman, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+the+relationship+between+the+flow+rate+of+tubular+fluid+and+potassium+transport+in+the+distal+tubule+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Characteristics of the relationship between the flow rate of tubular fluid and potassium transport in the distal tubule of the rat.</a> Journal of Clinical Investigation. 54 (6), 1488-1495 (1974).</li>
<li>Engbretson, B. G., Stoner, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-dependent+potassium+secretion+by+rabbit+cortical+collecting+tubule+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Flow-dependent potassium secretion by rabbit cortical collecting tubule in vitro.</a> American Journal of Physiology. 253 (5), 896-903 (1987).</li>
<li>Satlin, L. M., Sheng, S., Woda, C. B., Kleyman, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+Na%28%2B%29+channels+are+regulated+by+flow%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Epithelial Na(+) channels are regulated by flow.</a> American Journal of Physiology Renal Physiology. 280 (6), 1010-1018 (2001).</li>
<li>Woda, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+of+flow-stimulated+potassium+secretion+in+rabbit+cortical+collecting+duct%3A+functional+and+molecular+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Ontogeny of flow-stimulated potassium secretion in rabbit cortical collecting duct: functional and molecular aspects.</a> American Journal of Physiology Renal Physiology. 285 (4), 629-639 (2003).</li>
<li>Malnic, G., Berliner, R. W., Giebisch, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+dependence+of+K%2B+secretion+in+cortical+distal+tubules+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Flow dependence of K+ secretion in cortical distal tubules of the rat.</a> American Journal of Physiology. 256 (5), 932-941 (1989).</li>
<li>Khuri, R. N., Strieder, W. N., Giebisch, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+flow+rate+and+potassium+intake+on+distal+tubular+potassium+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Effects of flow rate and potassium intake on distal tubular potassium transfer.</a> American Journal of Physiology. 228 (4), 1249-1261 (1975).</li>
<li>Good, D. W., Wright, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminal+influences+on+potassium+secretion%3A+sodium+concentration+and+fluid+flow+rate%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Luminal influences on potassium secretion: sodium concentration and fluid flow rate.</a> American Journal of Physiology. 236 (2), 192-205 (1979).</li>
<li>Wong, K. R., Berry, C. A., Cogan, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+dependence+of+chloride+transport+in+rat+S1+proximal+tubules%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Flow dependence of chloride transport in rat S1 proximal tubules.</a> American Journal of Physiology. 269 (6), 870-875 (1995).</li>
<li>Garvin, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+absorption+by+isolated+perfused+rat+proximal+straight+tubules%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Glucose absorption by isolated perfused rat proximal straight tubules.</a> American Journal of Physiology. 259 (4), 580-586 (1990).</li>
<li>Malnic, G., Klose, R. M., Giebisch, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropuncture+study+of+renal+potassium+excretion+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Micropuncture study of renal potassium excretion in the rat.</a> American Journal of Physiology. 206 (4), 674-686 (1964).</li>
<li>Malnic, G., Klose, R. M., Giebisch, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropuncture+study+of+distal+tubular+potassium+and+sodium+transport+in+rat+nephron%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Micropuncture study of distal tubular potassium and sodium transport in rat nephron.</a> American Journal of Physiology. 211 (3), 529-547 (1966).</li>
<li>Cabral, P. D., Garvin, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminal+flow+regulates+NO+and+O2%28-%29+along+the+nephron%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Luminal flow regulates NO and O2(-) along the nephron.</a> American Journal of Physiology. 300 (5), 1047-1053 (2011).</li>
<li>Raghavan, V., Rbaibi, Y., Pastor-Soler, N. M., Carattino, M. D., Weisz, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+stress-dependent+regulation+of+apical+endocytosis+in+renal+proximal+tubule+cells+mediated+by+primary+cilia%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Shear stress-dependent regulation of apical endocytosis in renal proximal tubule cells mediated by primary cilia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8506-8511 (2014).</li>
<li>Lewis, S. A., de Moura, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apical+membrane+area+of+rabbit+urinary+bladder+increases+by+fusion+of+intracellular+vesicles%3A+an+electrophysiological+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">Apical membrane area of rabbit urinary bladder increases by fusion of intracellular vesicles: an electrophysiological study.</a> The Journal of Membrane Biology. 82 (2), 123-136 (1984).</li>
<li>Fowler, C. J., Griffiths, D., de Groat, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neural+control+of+micturition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The neural control of micturition.</a> Nature Reviews Neuroscience. 9 (6), 453-466 (2008).</li>
<li>Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+urothelium%3A+life+in+a+liquid+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The urothelium: life in a liquid environment.</a> Physiological Reviews. 100 (4), 1621-1705 (2020).</li>
<li>Khandelwal, P., Abraham, S. N., Apodaca, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+and+physiology+of+the+uroepithelium%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cell biology and physiology of the uroepithelium.</a> American Journal of Physiology Renal Physiology. 297 (6), 1477-1501 (2009).</li>
<li>Sachs, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretch-activated+ion+channels%3A+what+are+they%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">Stretch-activated ion channels: what are they.</a> Physiology. 25 (1), 50-56 (2010).</li>
<li>Martinac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensitive+ion+channels%3A+molecules+of+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanosensitive ion channels: molecules of mechanotransduction.</a> Journal of Cell Science. 117 (12), 2449-2460 (2004).</li>
<li>Ranade, S. S., Syeda, R., Patapoutian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanically+activated+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mechanically activated ion channels.</a> Neuron. 87 (6), 1162-1179 (2015).</li>
<li>Cox, C. D., Bavi, N., Martinac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+principles+of+ion-channel-mediated+mechanosensory+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Biophysical principles of ion-channel-mediated mechanosensory transduction.</a> Cell Reports. 29 (1), 1-12 (2019).</li>
<li>Carattino, M. D., Sheng, S., Kleyman, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+Na%2B+channels+are+activated+by+laminar+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Epithelial Na+ channels are activated by laminar shear stress.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (6), 4120-4126 (2004).</li>
<li>Ross, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+in+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Integrins in mechanotransduction.</a> Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 613-618 (2013).</li>
<li>Dieterle, M. P., Husari, A., Rolauffs, B., Steinberg, T., Tomakidi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins%2C+cadherins+and+channels+in+cartilage+mechanotransduction%3A+perspectives+for+future+regeneration+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Reviews+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Integrins, cadherins and channels in cartilage mechanotransduction: perspectives for future regeneration strategies.</a> Expert Reviews in Molecular Medicine. 23, 14(2021).</li>
<li>Huveneers, S., de Rooij, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensitive+systems+at+the+cadherin-F-actin+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanosensitive systems at the cadherin-F-actin interface.</a> Journal of Cell Science. 126, 403-413 (2013).</li>
<li>Sun, Z., Guo, S. S., Fässler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-mediated+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Integrin-mediated mechanotransduction.</a> Journal of Cell Biology. 215 (4), 445-456 (2016).</li>
<li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches.+Pfl%C3%BCgers+Archiv%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflügers Archiv.</a> European Journal of Physiology. 391 (2), 85-100 (1981).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> The Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+calcium+indicators+for+multi-color+neural+activity+imaging+and+combination+with+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2(2013).</li>
<li>Sun, X. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+GCaMPs+for+improved+tracking+of+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Fast GCaMPs for improved tracking of neuronal activity.</a> Nature Communications. 4, 2170(2013).</li>
<li>Dalghi, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+roles+for+PIEZO1+and+PIEZO2+in+urothelial+mechanotransduction+and+lower+urinary+tract+interoception%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Functional roles for PIEZO1 and PIEZO2 in urothelial mechanotransduction and lower urinary tract interoception.</a> JCI Insight. 6 (19), 152984(2021).</li>
<li>Durnin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ex+vivo+bladder+model+with+detrusor+smooth+muscle+removed+to+analyse+biologically+active+mediators+released+from+the+suburothelium%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">An ex vivo bladder model with detrusor smooth muscle removed to analyse biologically active mediators released from the suburothelium.</a> The Journal of Physiology. 597 (6), 1467-1485 (2019).</li>
<li>Delmas, P., Coste, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechano-gated+ion+channels+in+sensory+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechano-gated ion channels in sensory systems.</a> Cell. 155 (2), 278-284 (2013).</li>
<li>Tavernarakis, N., Driscoll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degenerins.+At+the+core+of+the+metazoan+mechanotransducer%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Degenerins. At the core of the metazoan mechanotransducer.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 940 (1), 28-41 (2001).</li>
<li>Peyronnet, R., Tran, D., Girault, T., Frachisse, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensitive+channels%3A+feeling+tension+in+a+world+under+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanosensitive channels: feeling tension in a world under pressure.</a> Frontiers in Plant Science. 5, 558(2014).</li>
<li>Blount, P., Iscla, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+with+bacterial+mechanosensitive+channels%2C+from+discovery+to+physiology+to+pharmacological+target%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Life with bacterial mechanosensitive channels, from discovery to physiology to pharmacological target.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 84 (1), 00055(2020).</li>
<li>Booth, I. R., Miller, S., Müller, A., Lehtovirta-Morley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+bacterial+mechanosensitive+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">The evolution of bacterial mechanosensitive channels.</a> Cell Calcium. 57 (3), 140-150 (2015).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Tutti gli organismi, e apparentemente la maggior parte dei tipi di cellule, esprimono canali ionici che rispondono agli stimoli meccanici 20,33,34,35,36,37. La funzione di questi canali attivati meccanicamente è stata valutata prevalentemente con la tecnica patch-mors. Tuttavia, a causa di problemi di accessibilità, gli studi...

Le cellule epiteliali nel tratto urinario sono soggette a forze meccaniche mentre il filtrato urinario viaggia attraverso i nefroni e l'urina viene pompata fuori dalla pelvi renale e viaggia attraverso gli ureteri per essere immagazzinata nella vescica urinaria. È stato a lungo riconosciuto che le forze meccaniche (ad esempio, sforzo di taglio e stiramento) esercitate dai fluidi sulle cellule epiteliali che rivestono le vie urinarie regolano il riassorbimento delle proteine nel tubulo prossimale e dei soluti nel nefrone distale 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11, 12,13, così come la conservazione delle urine nella vescica urinaria e la minzione14,15,16,17.
La conversione di stimoli meccanici in segnali elettrici e biochimici, un processo denominato meccanotrasduzione, è mediata da proteine che rispondono alla deformazione delle strutture cellulari o della matrice extracellulare associata 18,19,20,21. I canali ionici attivati meccanicamente sono unici nel senso che passano da uno stato chiuso a uno stato permeabile aperto in risposta a cambiamenti nella tensione della membrana, nella pressione o nello sforzo di taglio 18,19,20,21,22. Inoltre, i transitori di Ca 2+ possono essere iniziati mediante meccanotrasduzione integrina-mediata o mediante attivazione di sistemi di adesione meccano-responsivi alle giunzioni cellula-cellula23,24,25,26. La funzione del canale ionico viene solitamente valutata con la tecnica patch-mord, che comporta la formazione di un sigillo gigaohm tra la membrana cellulare e la pipetta patch27. Tuttavia, le cellule situate in strati di tessuto profondo con una matrice extracellulare densa (ad esempio, tubuli renali) o circondate da una barriera fisica (ad esempio, glicocalice) sono difficili da accedere con una micropipetta di vetro. Allo stesso modo, le cellule incorporate o che sono parti integranti di tessuti con scarsa stabilità meccanica (ad esempio, l'urotelio) non possono essere facilmente studiate con la tecnica patch-clamp. Poiché molti canali ionici attivati meccanicamente sono permeabili al Ca 2+, un approccio alternativo consiste nel valutare la loro attività mediante microscopia fluorescente utilizzando un colorante sensibile al Ca2+ o indicatori di calcio geneticamente codificati (GECI) come GCaMP. I recenti sforzi nell'ingegneria proteica hanno aumentato significativamente la gamma dinamica, la sensibilità e la risposta dei GECI28,29,30, e i progressi nella genetica hanno permesso la loro espressione in specifiche popolazioni cellulari, rendendoli ideali per studiare la meccanotrasduzione.
L'urotelio, l'epitelio stratificato che ricopre l'interno della vescica urinaria, funge da barriera, impedendo la diffusione di soluti urinari nell'interstizio della vescica, ma funziona anche come trasduttore, rilevando la pienezza della vescica e comunicando questi eventi ai nervi e alla muscolatura sottostanti16. Studi precedenti hanno dimostrato che la comunicazione tra l'urotelio e i tessuti sottostanti richiede i canali ionici attivati meccanicamente Piezo1 e Piezo231. Per valutare i transitori di Ca 2+ indotti meccanicamente nelle cellule uroteliali, è stata sviluppata una nuova tecnica descritta che utilizza il trasferimento genico adenovirale per esprimere il sensore Ca2+ GCaMP5G nelle cellule uroteliali. Questa tecnica impiega una preparazione del foglio di mucosa che fornisce un facile accesso allo strato più esterno della cellula dell'ombrello e un sistema assistito da computer per la stimolazione meccanica simultanea delle singole cellule con una micropipetta di vetro chiusa e la registrazione delle variazioni di fluorescenza nel tempo.

<table><tbody><tr><td>20x Obiettivo</td><td>Olympus</td><td>UMPlanFL N</td><td></td></tr><tr><td>24 G &frac34; &rdquo; catetere</td><td>Medline&nbsp;</td><td>Suresite IV vetrino&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>4x Obiettivo</td><td>Olympus</td><td>UPlanFL N</td><td></td></tr><tr><td>Convertitore analogico/digitale</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-GFP</td><td>Abcam&nbsp;</td><td>Ab6556</td><td></td></tr><tr><td>Divisore di fascio</td><td>Chroma</td><td>T495lpxr</td><td></td></tr><tr><td>Regolatore di temperatura bipolare&nbsp;</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-344B</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fluka</td><td>21114-1L</td> 1 <td>M soluzione</td></tr><tr><td>cellSens software</td><td>Olympus</td><td></td><td>Imaging</td></tr><tr><td>software CMOS fotocamera</td><td>Hamamatsu</td><td>ORCA fusion</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-coniglio coniugato ad Alexa Fluor 488&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-545-152</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtro</td><td>Crominanza</td><td>ET470/40X</td><td></td></tr><tr><td>Capillari in vetro Corning 8250 in vetro</td><td>Warner Instruments&nbsp;</td><td>G85150T-4</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>Riscaldatore in linea Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Warner Instruments</td><td>SH-27B</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>793590</td><td></td></tr><tr><td>Sorgente luminosa</td><td>Sutter Instruments</td><td>Lambda XL&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Collettore pompa tubo</td><td>Fisherbrand</td><td>14-190-510</td><td>ID 1.52 mm</td></tr><tr><td>Collettore pompa</td> tubo <td>Fisherbrand</td><td>14-190-533</td><td>ID 2.79 mm</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>Mice&nbsp;</td><td>Jackson Lab</td><td>664</td><td>femmina di 2-4 mesi C57BL/6J</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige&nbsp;</td><td>MF-830</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipolatore</td><td>Sutter Instruments</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Olympus</td><td>BX51W</td><td></td></tr><tr><td>Supporti di montaggio con DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>S36964&nbsp;</td><td>Slowfade Diamond Antifade con DAPI</td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>Software Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>pClamp</td><td>Molecular Devices</td><td>Versione 10.4</td><td>Software di acquisizione e analisi dati per elettrofisiologia patch-clamp</td></tr><tr><td>Pompa peristaltica</td><td>Gilson</td><td>Minipuls 3</td><td></td></tr><tr><td>Attuatore piezoelettrico</td><td>Thorlabs</td><td>PAS005</td><td></td></tr><tr><td>Supporto per pipette</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Estrattore per pipette</td><td>Narishige</td><td>PP-830</td><td></td></tr><tr><td>Base riscaldata a scambio rapido con perfusione e kit anello adattatore</td><td>Warner Instruments</td><td>QE-1</td><td>La piattaforma a scambio rapido si adatta a piatti da 35 mm &nbsp;</td></tr><tr><td>Rodamina-falloidina&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>Sigma-Plot</td><td>Systat Software Inc</td><td>Versione 14.0</td><td>Software scientifico per la grafica e l'analisi dei dati&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Elastomero siliconico</td><td>Dow</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Controller piezoelettrico a circuito aperto a canale singolo</td><td>Thorlabs</td><td>MDT694B</td><td></td></tr><tr><td>Cuscinetto portagriglia quadrato</td><td>Ted Pella</td><td>10520</td><td></td></tr><tr><td>Sutura</td><td>AD Surgical</td><td>S-S618R13</td><td>6-0 Sylk</td></tr><tr><td>Asta di montaggio in teflon</td><td>Su</td><td></td> misura <td>Da utilizzare per montare l'attuatore piezoelettrico nel micromanipolatore</td></tr><tr><td>Tubo</td><td>Fisher Scientific</td><td>14171129</td><td>Tygon S3 ID 1/16 IN, OD 1/8 IN USB</td></tr> Digital <tr><td>I/O device&nbsp;</td><td>National Instruments</td><td>NI USB-6501</td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo analisi di transitori di ca2+ attivati meccanicamente in cellule uroteliali

Ex Vivo Analysis of Mechanically Activated Ca2+ Transients in Urothelial Cells

I canali ionici attivati meccanicamente sono trasduttori biologici che convertono stimoli meccanici come forze di allungamento o taglio in segnali elettrici e biochimici. Nei mammiferi, i canali attivati meccanicamente sono essenziali per la rilevazione di stimoli esterni e interni in processi diversi come la sensazione tattile, l'udito, la regolazione del volume dei globuli rossi, la regolazione della pressione sanguigna basale e la sensazione di pienezza della vescica urinaria. Mentre la funzione dei canali ionici attivati meccanicamente è stata ampiamente studiata in vitro utilizzando la tecnica patch-clamp, valutare la loro funzione nel loro ambiente nativo rimane un compito difficile, spesso a causa dell'accesso limitato ai siti di espressione di questi canali (ad esempio, terminali afferenti, cellule di Merkel, barocettori e tubuli renali) o difficoltà nell'applicare la tecnica patch-clamp (ad esempio, le superfici apicali delle cellule ombrello uroteliali). Questo protocollo descrive una procedura per valutare i transitori Ca 2+ evocati meccanicamente utilizzando il sensore fluorescente GCaMP5G in una preparazione uroteliale ex vivo, una tecnica che potrebbe essere facilmente adattata per lo studio di eventi di Ca2+ evocati meccanicamente in altre preparazioni tissutali native.

Il presente protocollo descrive una tecnica per valutare i transitori Ca 2+ evocati meccanicamente in celle ombrello utilizzando il sensore fluorescente Ca2+ GCaMP5G. La trasduzione adenovirale è stata impiegata per esprimere GCaMP5G nelle cellule uroteliali grazie alla sua elevata efficienza e perché produce un elevato livello di espressione. Le immagini fluorescenti delle criosezioni colorate da una vescica trasdotta sono mostrate nella Figura 2D. Per questi esperimen...

Questo protocollo descrive una metodologia per valutare la funzione dei canali ionici attivati meccanicamente nelle cellule uroteliali native utilizzando il sensore fluorescente Ca2+ GCaMP5G.

Ex Vivo Analisi di transitori di Ca2+ attivati meccanicamente in cellule uroteliali

Mechanically activated ion channels are biological transducers that convert mechanical stimuli such as stretch or shear forces into electrical and ...

Questo protocollo descrive una tecnica per studiare l'evento di calcio evocato meccanicamente in un preparato uroteliale ex vivo. La tecnica è relativamente facile da eseguire e potrebbe essere adattata per studiare eventi di calcio evocati meccanicamente in altre preparazioni tissutali native. Fabbricare le micropipette posizionando il vetro capillare nell'estrattore e regolandolo con le manopole di fissaggio capillare.Tirare il capillare di vetro in due passaggi secondo le istruzioni del produttore. Chiudere la punta delle micropipette utilizzando una microforgia con la manopola di regolazione del riscaldatore impostata su 60. Dopo aver esposto la vescica e l'osso pelvico del topo eutanasia, rompere l'osso pelvico per esporre l'uretra e cannulare l'uretra con un catetere di calibro 24.Utilizzare una sutura 6-0 per fissare il catetere all'uretra. Raccogliere la vescica e l'uretra e fissarle su un supporto in gomma siliconica immerso nella soluzione di registrazione. Separare la mucosa della vescica dallo strato muscolare sottostante con una pinza fine.Tagliare la mucosa della vescica e fissarla con l'urotelio rivolto verso l'alto fino a un inserto in elastomero siliconico sul fondo di una capsula di coltura tissutale di 35 millimetri di diametro. Montare il piatto di coltura tissutale con la mucosa della vescica appuntata nella fase del microscopio dotata di un incubatore di piatti di coltura con elementi riscaldanti resistivi. Perfondere continuamente il piatto di coltura cellulare ad una velocità di 1,7 millilitri al minuto con una soluzione di registrazione riscaldata a 37 gradi Celsius con un riscaldatore in linea.Mantenere la temperatura dell'incubatore di tessuti e delle soluzioni a circa 37 gradi Celsius con un regolatore di temperatura bipolare a doppio canale. Per registrare i transitori di ioni calcio indotti meccanicamente, immergere la micropipetta nella soluzione di registrazione. Sotto l'illuminazione a campo chiaro, utilizzando un obiettivo di scansione a basso ingrandimento, spostare la micropipetta al centro del campo.Spostare il micromanipolatore sul piano verticale e regolare la messa a fuoco per spostare la pipetta vicino alla superficie del tessuto uroteliale. Passa all'obiettivo con un ingrandimento più elevato e un'apertura numerica adatta all'immunofluorescenza. Impostare il micromanipolatore in modo fine e spostare la pipetta vicino alla parte superiore della cella di destinazione.Se necessario, regolare la messa a fuoco e la posizione della pipetta. Aprire il protocollo di stimolazione nel software di elettrofisiologia e impostarlo per giocare. Regolare lo stato attivo e premere Start in Gestione esperimenti per avviare l'acquisizione dei dati.Questo aziona l'attuatore piezoelettrico e genera un file con le immagini dell'esperimento. Quando la cellula viene stimolata, si osserva un aumento della fluorescenza. Per quantificare l'intensità fluorescente, aprire il file di immagine nel software di imaging e selezionare la finestra di conteggio e misurazione.Riproduci il filmato per identificare la cellula stimolata. Selezionare lo strumento poligono e disegnare un ROI sui confini della cella che è stata colpita. Vai alla finestra di misurazione, seleziona il profilo di intensità, imposta la misurazione su straordinario, i risultati su media, la sottrazione dello sfondo su nessuno, quindi premi Esegui.L'intensità media della fluorescenza sarà calcolata nel tempo. Per esportare i dati del profilo di intensità, fare clic sull'icona Excel nella finestra dei risultati del profilo di intensità ed eseguire l'analisi dei dati utilizzando il software di grafica scientifica e analisi dei dati. In questo studio, la cellula ombrello è stata colpita per valutare i transitori di calcio evocati meccanicamente.L'immagine catturata a 10 secondi mostra una vista fluorescente della pipetta stimolante posizionata sopra una cella ad ombrello che esprime un sensore di calcio fluorescente GCaMP5G. La stimolazione meccanica della cellula ombrello che esprime il sensore di calcio provoca una deformazione seguita da un rapido aumento dell'emissione di fluorescenza. Il grafico mostra un cambiamento nell'intensità della fluorescenza tracciata in funzione del tempo per diverse cellule.Il poking evoca una risposta di calcio nella maggior parte delle cellule ombrello trasdotte con un sensore di calcio fluorescente. Il passo più importante è la raccolta della vescica e dell'uretra, seguita dall'apposizione su un cuscinetto di supporto in gomma siliconica. Evitare danni ai tessuti quando si separa la mucosa della vescica dallo strato muscolare sottostante.I metodi di imaging come quello qui descritto possono fornire una visione unica di come i canali attivati dalla meccanoa inviano cambiamenti nel loro ambiente nativo e generano risposte fisiologiche.

ex-vivo-analysis-mechanically-activated-ca2-transients-urothelial

Research

Ricerca

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Dettagli di metodi ad alta risoluzione...

Focale Ca 2 + Rilevamento transitoria nel muscolo liscio

Questo video dimostra la caratterizzazione delle correnti cationiche dai canali ionici della melastatina di tipo 4 (TRPM4) con potenziale recettore transitorio nelle cellule muscolari lisce detrusoriali utilizzando la tecnica del patch-clamp perforato mediato da amfotericina-B. La tecnica aiuta a valutare le proprietà biofisiche e farmacologiche dei canali ionici.

Analisi del patch-clamp perforato mediato da amfotericina-B: una tecnica elettrofisiologica per studiare le correnti ioniche nelle cellule della vescica urinaria

La stimolazione meccanica indotta calcio Wave Propagation in monostrati cellulari: l&#39;esempio di bovini cellule endoteliali corneali

Indicatori di codificato geneticamente Ca2 + (GECIs) hanno cambiato radicalmente come in situ Ca2 + imaging viene eseguita. Per massimizzare il recupero dei dati da tali registrazioni, analisi appropriata di Ca2 + segnali è necessaria. I protocolli in questa carta facilitano la quantificazione di Ca2 + segnali registrati in situ utilizzando spatiotemporal mappatura e analisi delle particelle.

Applicazioni di mappatura spazio-temporale e tecniche di analisi delle particelle per quantificare la segnalazione intracellulare Ca2 + In Situ

Descriviamo un metodo per la preparazione delle singole cellule muscolari lisce dei detrusivi appena isolate da campioni di vescica urinaria umana utilizzando una procedura enzimatica in due fasi. Le cellule DSM vitali ottenute possono essere studiate con varie tecniche a cella singola, tra cui l'elettrofisiologia patch-clamp amphotericin-B descritta per rivelare proprietà fisiologiche e farmacologiche.

Preparazione e utilizzo di cellule muscolari lisce del detrusore umano appena isolate per la caratterizzazione delle correnti di Cazione sensibili a 9-Phenanthrol

Il modello di vescica privo di detrusivi consente l'accesso diretto al suburothelium per studiare i meccanismi locali per la regolazione della disponibilità del mediatore biologicamente attivo in suburothelium/lamina propria durante lo stoccaggio e lo svuotamento delle urine. La preparazione assomiglia da vicino al riempimento di una vescica intatta e consente di eseguire studi sul volume di pressione senza influenze sistemiche.

Un modello di vescica murine decentralizzato (Ex Vivo) con il muscolo del detrusore rimosso per l'accesso diretto al Suburothelium durante il riempimento della vescica

Viene dimostrato un modello murino di inoculazione transuretrale uropatogena di E. coli (UPEC) per stabilire serbatoi latenti della vescica intracellulare e la successiva esposizione della vescica a G. vaginalis per indurre UPEC UTI ricorrente. Sono inoltre dimostrati l'enumerazione dei batteri, la citologia delle urine e la fissazione e l'elaborazione della vescica in situ per la microscopia elettronica a scansione.

Infezione ricorrente del tratto urinario da Escherichia coli innescata dall'esposizione alla vescica di Gardnerella vaginalis nei topi

Questo protocollo descrive la procedura per misurare le concentrazioni di ATP nel lume della vescica in un roditore anestetizzato.

In vivo Misurazione luminale del rilascio uroteliale di ATP evocato dalla distensione nei roditori

Vengono descritti metodi per la generazione di grandi quantità di adenovirus ricombinanti, che possono quindi essere utilizzati per trasdurre l'urotelio nativo dei roditori consentendo l'espressione di transgeni o la downregulation di prodotti genici endogeni.

Espressione di transgeni nell'urotelio vescicale nativo mediante trasduzione mediata da adenovirus

Questo protocollo presenta un metodo ottimizzato per isolare il rivestimento epiteliale dell'uretra femmina adulta del topo per analisi a valle, inclusi citometria a flusso, immunocolorazione e coltura organoide. I metodi hanno prodotto cellule epiteliali uretrali arricchite e vitali, come dimostrato dall'analisi della citometria a flusso, dall'imaging a montaggio completo e dalla formazione efficiente di organoidi.

Un metodo ottimizzato per isolare l'epitelio uretrale femmina di topo per analisi unicellulare e immunofluorescenza

Scopri come analizzare i transitori di Ca²⁺ attivati meccanicamente in cellule uroteliali ex vivo utilizzando il sensore fluorescente GCaMP5G. Questo protocollo permette di studiare la meccanotrasduzione nella vescica.

Ex Vivo Analisi di transitori di Ca²⁺ attivati meccanicamente in cellule uroteliali

Esplora altri video