Ipertermia generata da ultrasuoni focalizzati ad alta intensità guidata da risonanza magnetica: un metodo di trattamento fattibile in un modello di rabdomiosarcoma murino

Questo protocollo consente nuovi test preclinici di ipertermia mirata al tumore in combinazione con farmaci termosensibili, che possono essere applicati per migliorare la sopravvivenza e ridurre la tossicità sistemica nei pazienti con sarcoma. Il vantaggio principale di questa tecnica è che il rilascio della chemioterapia è limitato alla regione riscaldata massimizzando il rilascio del farmaco all'interno del tumore riducendo al minimo il rilascio sistemico del farmaco nel tessuto sano. I nostri metodi possono essere tradotti clinicamente per trattare i sarcomi.

Inoltre, il nostro lavoro sta imparando come l'ipotermia localizzata può incitare il sistema immunitario ad aiutare il corpo a colpire il cancro insieme alla chemioterapia standard. A dimostrare la procedura saranno il Dr.Warren Foltz, il fisico capo della risonanza magnetica presso lo Star Innovation Center, il Dr.Adam Waspe, il fisico capo HIFU presso l'Hospital for Sick Children, e Suzanne Wong, laureata in scienze applicate presso il Drake Lab presso l'ospedale per bambini malati di Toronto. Per iniziare a radersi la zampa posteriore del mouse trattenuto usando le tosatrici e pulirla con etanolo al 70%.

Aspirare circa 10.000 cellule in 10 microlitri di soluzione di sospensione cellulare utilizzando una siringa da microlitro. Estendere la zampa posteriore destra del topo e iniettare la sospensione cellulare con un movimento costante nella muscolatura della coscia usando una siringa da microlitro con un ago calibro 26. L'ago deve essere inserito parallelamente al femore verso il ginocchio, facendo attenzione a non colpire il nervo sciatico.

Rimuovere l'ago e riportare il mouse in una seconda gabbia. Valutare gli animali quotidianamente e monitorare i loro arti posteriori per la crescita del tumore attraverso la palpazione. Immagine del mouse anestetizzato utilizzando lo scanner MRI.

Sull'immagine pesata T2 prendere nota delle dimensioni in plaine e del numero di fette assiali in cui appare il tumore. Si noti la posizione del tumore in riferimento al femore e alla superficie laterale della coscia in cui entrerebbe l'onda ultrasonica. Per preparare il sistema HIFU di piccolo diametro, accendere il generatore, posizionare la membrana sul trasduttore e riempire il trasduttore con acqua deionizzata sufficiente fino a quando la membrana non viene espansa sotto il trasduttore.

Ma non così fermo da comprimere il mouse. Degasare l'acqua nel circuito del trasduttore per 30 minuti per rimuovere l'ossigeno disciolto dal mezzo. Dopo aver anestetizzato il topo e averlo trasferito su un cono nasale, applicare un lubrificante corneale sugli occhi per prevenire danni dovuti alla mancanza di riflesso del battito delle palpebre in anestesia.

Rasare l'arto posteriore destro del topo. Applicare la crema depilatoria sulla zona rasata compreso l'intero arto posteriore destro. Posizionare il mouse sotto una lampada di calore mentre si è nell'armadio di biosicurezza per facilitare la regolazione termica.

E rimuovere i capelli e la crema depilatoria un minuto dopo l'applicazione. Spostare il mouse su un cono nasale compatibile con la risonanza magnetica sulla slitta MRI e posizionare il topo con il lato rivolto verso il basso e il tumore superiore all'interno di un supporto per mouse stampato in 3D sulla slitta. Posizionare una lampada termica vicino al mouse per tenerlo al caldo.

Se necessario, tagliare a segmento di gel gel ad ultrasuoni compresso per mettere sotto il mouse foderare il fondo del supporto con uno spessore per livellare il tumore verso la parte superiore del supporto. Allontanare la gamba non coinvolta dalla gamba tumorale, sotto il topo o estesa con la gamba tumorale flessa. Assicurarsi che i piedi non siano nel campo vicino o lontano del percorso del tumore e del fascio di ultrasuoni.

Per inserire la sonda di temperatura esofagea infilare la sonda esofagea attraverso il cono del naso e collottola il collo del mouse. Inclina il naso del topo verso l'alto per creare una linea dalla bocca direttamente allo stomaco estendendo la testa. Far scorrere la sonda termica sopra la lingua di circa 0,5 centimetri nell'esofago del topo e sostituire il cono del naso intorno al naso del topo.

Fissare la sonda esofagea e il cono del naso nella parte superiore della slitta. Quindi, inserire la sonda di temperatura rettale e fissarla con del nastro adesivo. Inserire un altro cuscinetto in gel se necessario e applicare lubrificante per gli occhi o gel ad ultrasuoni intorno all'arto posteriore destro per colmare eventuali lacune.

Inserire un catetere per la vena della coda ad ago a farfalla calibro 27 in una vena laterale della coda attaccata a un micro tubo con 40 microlitri di spazio morto e nastro adesivo in modo sicuro. Posizionare il monitor respiratorio con il cavo di collegamento verso la testa del mouse in modo che non interferisca con il posizionamento del trasduttore a ultrasuoni, fissato con nastro adesivo. Utilizzare due persone per trasportare il mouse preparato, la slitta del topo, la linea di anestesia, la linea respiratoria, il catetere delle vene della coda e i cavi della sonda termica nello scanner MRI e posizionarli nel supporto della slitta MRI.

Tutti sono stati sottoposti a screening e nulla viene portato nella suite MR, che è ferromagnetica o potrebbe essere danneggiata all'interno del forte campo magnetico del sistema. Dopo che l'operatore del software HIFU sposta il menisco del trasduttore direttamente sul tumore per un allineamento iniziale, applicare lubrificante per gli occhi, o gel ad ultrasuoni degassato, sulla pelle glabra sopra il tumore e accoppiare il trasduttore HIFU all'area del tumore. Collegare la linea di somministrazione del farmaco dalla pompa automatica al catetere della vena caudale e calcolare la quantità di spazio morto nella linea della vena della coda e nella linea di collegamento.

Far scorrere la slitta HIFU del mouse sulle guide MRI al centro della risonanza magnetica e posizionare il dispositivo di riscaldamento a convezione dell'aria sull'impostazione più calda. Puntare il tubo che soffia aria verso il mouse al centro del foro MRI e fissarlo con del nastro adesivo. Il dispositivo di riscaldamento verrà successivamente impostato al più basso per evitare il surriscaldamento del mouse durante la sonicazione.

Acquisire le immagini MR di indagine sia assiale che sagittale per determinare la posizione del tumore per il targeting sonico, compresa la profondità. Regolare la posizione del trasduttore di conseguenza utilizzando il software HIFU inserendo la distanza di movimento desiderata misurata sull'immagine, quindi facendo clic sulla direzione della freccia per spostarsi. Inoltre, nota la posizione del tubo di deriva.

Ripetere se necessario. Determinare la posizione del punto focale del trasduttore nel piano cornal eseguendo una breve sonicazione continua del colpo di prova da 50 millivolt per cinque secondi durante l'acquisizione della termometria del colpo di prova. Allinea le immagini del rilevamento MR con la vista cornal del punto focale all'interno del software HIFU.

Rivedere le immagini per la posizione del tumore rispetto alla struttura ossea e al retto e rivedere il posizionamento del trasduttore come ritenuto necessario. Ripetere la sonicazione del colpo di prova durante la termografia a nove ripetizioni per confermare se c'è un riscaldamento uniforme e accurato nel volume del tumore con un riscaldamento off-target minimo. Regolare la posizione della fetta, la posizione del trasduttore e la profondità dello sterzo e confermare le prestazioni di riscaldamento con ripetuti colpi di prova se ritenuto necessario.

Utilizzando il software di monitoraggio del trattamento HIFU, definire la regione di interesse, o ROI, per il monitoraggio termometrico all'interno del profilo di riscaldamento finale misurando la distanza da percorrere e quindi modificando le coordinate della griglia nel programma. Impostare un ROI all'interno del segnale del fluido dal tubo di deriva per la correzione della deriva dell'uscita termometrica. Se questo segnale fluido non è ben definito all'interno dell'immagine di pianificazione assiale a livello del tumore, l'uscita diretta dalla sonda di temperatura in fibra ottica all'interno del tubo di deriva viene utilizzata per la correzione della deriva.

Immettere la temperatura di base in base alla temperatura della sonda rettale per le misurazioni termometriche. Aprire le specifiche di trattamento dell'ipertermia di 20 minuti nel software e avviare la sonicazione una volta raccolte le immagini MR di riferimento e iniziata la termometria. Eseguire un trattamento di 20 minuti durante la termografia utilizzando il software di controllo integrato integrato proporzionale derivato o PID.

Iniettare il farmaco selezionato 1,5 minuti dopo che la temperatura nel ROI si riscalda alla temperatura desiderata. Se la temperatura rettale aumenta rapidamente durante il trattamento e supera i 40 gradi Celsius, interrompere la sonicazione e consentire alla temperatura rettale di scendere prima di ricominciare. Dopo il completamento del trattamento, rimuovere il topo dal foro della risonanza magnetica, assicurando l'emostasi nel sito di inserimento del catetere della vena caudale e trasferirlo nell'armadio di biosicurezza.

Lavare via il gel ad ultrasuoni e il lubrificante dalla zampa posteriore usando acqua. Trasferire il mouse nella sua gabbia e monitorarne il recupero. Punta la lampada termica a un'estremità della gabbia per aiutare con la regolazione termica durante il recupero.

Utilizzando questo protocollo di ipertermia, i tumori nell'arto posteriore sono stati in grado di essere costantemente riscaldati alla temperatura impostata desiderata per tutta la durata del trattamento. La temperatura monitorata durante il trattamento rappresentativo è mostrata in questa figura. Le temperature medie del 10° percentile superiore e del 90° percentile superiore di tutti i voxel nel ROI sono presentate qui.

Le temperature medie durante il trattamento all'interno del ROI per ciascun topo sono state testate durante la fase di ottimizzazione con la deviazione standard. Viene mostrata anche la temperatura media complessiva. Anche le percentuali di successo del trattamento di ipertermia sono migliorate nel tempo.

Il successo del trattamento dipendeva dai criteri di inclusione. Cioè la temperatura sistemica, la temperatura del tumore e la variazione con il ROI e nessun riscaldamento distale. Qui, la linea blu rappresenta la percentuale di topi per i quali il trattamento ha avuto successo e le barre arancioni rappresentano il numero di topi trattati.

Ogni trattamento si riferisce a una data separata in cui sono stati condotti gli esperimenti. Per determinare il tempo ottimale di trattamento dell'ipotermia per ulteriori studi, sono state testate due durate di trattamento, 10 minuti e 20 minuti. La cromatografia liquida ad alte prestazioni e la spettrometria di massa, o HPLC MS, sono state utilizzate per valutare la quantità di doxorubicina nei tumori e quantificare la differenza nell'accumulo di doxorubicina tra le durate testate.

I risultati dimostrano il significato tra la quantità di doxorubicina nel tumore nel gruppo di doxorubicina liposomiale termosensibile di 20 minuti più ipertermia rispetto al normale controllo della termia. Non sono state osservate differenze nel tumore nei gruppi di doxorubicina libera. Quando si prepara e si posiziona la massa è imperativo che il raggio HIFU non sia ostruito.

Le bolle d'aria nel gel o nell'osso nel percorso del fascio devono essere evitate. Raccogliamo tessuti e sangue per analizzare la farmacocinetica e i livelli di tossicità in vari organi, nonché esaminare la risposta immediata e ritardata del sistema immunitario al trattamento.