Espressione di transgeni nell'urotelio vescicale nativo mediante trasduzione mediata da adenovirus
6 ottobre 2022
Vengono descritti metodi per la generazione di grandi quantità di adenovirus ricombinanti, che possono quindi essere utilizzati per trasdurre l'urotelio nativo dei roditori consentendo l'espressione di transgeni o la downregulation di prodotti genici endogeni.
Questo protocollo descrive i metodi che consentono ai ricercatori di esprimere CDNA o SIRNA nell'urotelio vescicale nativo. I principali vantaggi di questa tecnica sono la sua relativa semplicità, la capacità di esprimere cDNA, siRNA nell'urotelio con alta efficienza e in un periodo di tempo relativamente breve. La parte più difficile di questa tecnica è il cateterismo.
Tuttavia, la tecnica complessiva è relativamente facile da padroneggiare una volta appresa. A dimostrare la procedura sarà Giovanni Ruiz, Research Specialist IV nel mio laboratorio. Per iniziare posizionare il topo anestetizzato su una piastra riscaldante vicino ai coni del naso.
Mantenere l'animale sotto anestesia per tutta la durata del protocollo. Confermare che il mouse è completamente anestetizzato con un pizzico di punta. Per evitare l'introduzione di aria nella vescica, riempire la porzione di catetere di plastica di un catetere IV e dell'hub associato con PBS sterile utilizzando una pipetta di trasferimento sterile o una siringa.
Con l'animale in posizione supina tamponare il meato uretrale esterno con alcol al 70%. Quindi afferrare delicatamente il tessuto che forma il meato uretrale esterno ed estenderlo verticalmente lontano dall'animale usando una pinza fine. Inserire il catetere sterile nel meato esterno.
Usando l'altra mano inserire con attenzione il catetere verticalmente di circa tre o quattro millimetri nel meato uretrale. Quindi abbassare il catetere inserito nel meato esterno verso la coda dell'animale, che facilita il suo ingresso nella porzione dell'uretra che passa sotto l'osso pubico e infine nella vescica. Lasciare che l'urina nella vescica fuoriesca.
Rimuovere l'urina residua eseguendo la manovra di Creda massaggiando e premendo delicatamente verso il basso sulla protuberanza della vescica nella zona addominale inferiore. Per rendere l'urotelio ricettivo alla trasduzione, lavare la vescica del topo o del ratto attaccando una siringa sterile da un millilitro piena di PBS all'hub del catetere. Iniettare 100 microlitri di PBS sterile nella vescica del topo.
Dopo aver staccato la siringa dal catetere, lasciare drenare il PBS. Instillare 100 microlitri di 0,1% N-dodecil-beta-D-maltoside sciolto in PBS e filtro da 0,2 micrometri sterilizzato nella vescica del topo utilizzando una siringa sterile da un millilitro. Mantenere la N-dodecil-beta-D-maltoside nella vescica per 10 minuti lasciando la siringa in posizione.
Rimuovere l'N-dodecil-beta-D-maltoside dalla vescica staccando la siringa e lasciandola defluire. Per introdurre il virus nella vescica attaccare una siringa sterile da un millilitro all'hub del catetere e instillare 5.000.000 a 100.000.000 IVP di adenovirus diluito in 100 microlitri di PBS sterile per i topi o 450 microlitri per i ratti nella vescica. Dopo 30 minuti, staccare la siringa e lasciare che la soluzione virale evacui la vescica su un tampone monouso.
Tamponare qualsiasi soluzione di virus residuo con una salvietta assorbente mentre si elimina il tampone e pulire i rifiuti biopericolosi. Per consentire all'animale di riprendersi, cessare il flusso di isoflurano. Consentire all'animale di riprendersi ed essere completamente mobile prima di riportarlo nella sua gabbia, in particolare se gli animali sono alloggiati in gruppo.
Analizzare gli effetti dell'espressione transgenica da 12 a 72 ore dopo il trattamento utilizzando metodi come l'ibridazione mRNA in situ, Western blot o immunofluorescenza. L'analisi Western blot dei lisati uroteliali ha rivelato l'espressione dell'ormone della crescita umano marcato V5 nell'urotelio delle vesciche trasdotte, ma non in quelle non trasdotte. L'espressione è stata confermata anche dall'immunofluorescenza utilizzando anticorpi che hanno riconosciuto l'ormone della crescita umano, o il tag dell'epitopo V5.
L'analisi Western blot ha confermato l'espressione di Claudin-2 nei ratti trasdotti con adenovirus, ma non in quelli trasdotti con un virus codificante GFP controllato. L'analisi di immunofluorescenza ha ulteriormente confermato l'espressione esogena di Claudin-2 in cellule ombrello uroteliali trasdotte con il cDNA di Claudin-2 codificante il virus. Il rilevamento di Claudin-2 esogeno nella Tight Junction Protein 1 mediante immunofluorescenza e microscopia confocale dell'intero urotelio montato o in sezione trasversale ha rivelato la presenza di Tight Junction e accumuli intracellulari di Claudin-2 nel citoplasma cellulare.
Il campo dell'immagine mostra che il conteggio del numero di cellule ombrello trasdotte rivela un'efficienza che si avvicina al 95% e nella totalità della parete della vescica viene trasdotto solo l'urotelio e nessun altro tessuto è preso di mira dall'adenovirus instillato. Il cateterismo è fondamentale affinché il protocollo funzioni come previsto. Questa tecnica consente ai ricercatori di studiare la normale biologia uroteliale, nonché di comprendere le condizioni in cui la sovraespressione proteica, o sottoespressione, porta alla malattia.
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Panoramica
Questo studio presenta un protocollo per la trasduzione efficiente dell'urotelio nativo di roditori utilizzando adenovirus ricombinanti, che consente l'espressione di cDNA e siRNA. I risultati chiave includono il raggiungimento di un'efficienza di trasduzione di quasi il 95% nelle cellule uroteliali, facilitando la ricerca sulla biologia uroteliale e sulle malattie correlate.
Componenti chiave dello studio
Area di ricerca
- Biologia uroteliale
- Regolazione dell'espressione genica
- Tecniche di trasduzione
Sfondo
- Importanza dell'urotelio nella funzione vescicale
- Sfide nello studio dell'espressione genica in vivo
- Necessità di metodi di trasduzione efficaci
Metodi utilizzati
- Utilizzo di adenovirus ricombinante per la consegna genica
- Modelli di topo e ratto
- Assaggi Western blot e immunofluorescenza per l'analisi
Principali risultati
- Ha dimostrato un'elevata efficienza di espressione del transgene nelle cellule uroteliali
- Ha confermato l'espressione di proteine specifiche, come Claudin-2 e ormone della crescita umano
- Ha stabilito che l'adenovirus trasduce specificamente l'urotelio senza influenzare i tessuti adiacenti
Conclusioni
- Questo protocollo consente studi approfonditi della funzione genica nell'urotelio
- Offre informazioni sulle condizioni che influenzano la biologia della vescica, contribuendo alla più ampia ricerca biologica
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Adenovirus-mediated transgene delivery in native bladder urothelium enables rapid, high-efficiency modulation of gene expression in vivo, addressing a critical bottleneck in functional target validation for lower urinary tract research. This approach supports mechanistic de-risking and predictive confidence at the discovery and preclinical interface, facilitating portfolio decisions for programs targeting urothelial biology. The method's specificity and scalability position it as a reusable platform for interrogating gene function and disease mechanisms in rodent models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of gene function in native urothelial tissue for mechanistic de-risking.
- Supports functional validation of candidate targets through controlled overexpression or knockdown.
- Facilitates rapid hypothesis testing in disease-relevant rodent models.
Screening & Assay Development
- Prepares validated in vivo systems for downstream phenotypic or biomarker assays.
- Delivers reproducible, high-efficiency transduction for quantitative protein expression analysis.
- Enables robust comparison of transgene effects using standardized readouts such as Western blot and immunofluorescence.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for translational biomarker exploration in bladder research.
- Provides continuity from discovery-stage gene modulation to preclinical functional assessment.
- Supports risk-adjusted advancement of urothelial targets based on in vivo functional data.
Pipeline & Workflow Integration
This adenoviral transduction protocol integrates at the interface of early discovery and preclinical validation, enabling rapid target interrogation and functional assessment in rodent models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven testing of gene function and pathway involvement in urothelial tissue.
- Screening: Provides a reproducible platform for quantitative assessment of transgene expression and downstream effects.
- Analytics: Enables robust measurement of protein expression via Western blot and immunofluorescence for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical stages by enabling disease-relevant gene modulation in vivo.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, adaptable protocol for repeated use across multiple gene targets and rodent models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in urothelial target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, high-efficiency gene delivery with reproducible outcomes.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital allocation by providing rapid in vivo functional data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of urothelial targets for advancement or deprioritization.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in rodent catheterization and in vivo gene delivery.
- Needs access to high-titer adenoviral vectors and analytical tools for protein detection.
- Demands rigorous cross-team standardization for reproducibility and data comparability.
- Adaptation to other tissues or species may require protocol optimization.
- Catheterization is a critical step and may present a learning curve for new operators.
