Name: Espressione di transgeni nellurotelio vescicale nativo mediante trasduzione mediata da adenovirus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-06T14:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 1 s
Description: Impara a esprimere transgeni nell'urotelio vescicale nativo mediante trasduzione con adenovirus ricombinante. Questo metodo raggiunge quasi il 95% di efficienza nelle cellule uroteliali, facilitando lo studio della biologia vescicale.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Questo lavoro è stato supportato da un progetto pilota attraverso P30DK079307 (a M.G.D.), NIH grant R01DK119183 (a G.A. e MDC), NIH grant R01DK129473 (a G.A.), un premio per lo sviluppo della carriera dell'American Urology Association e una sovvenzione della Winters Foundation (a NM), dal Cell Physiology and Model Organisms Kidney Imaging Cores del Pittsburgh Center for Kidney Research (P30DK079307), e da S10OD028596 (a G.A.), che ha finanziato l'acquisto del sistema confocale utilizzato per catturare alcune delle immagini presentate in questo manoscritto.

<ol><li>Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Urothelium%3A+Life+in+a+liquid+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The Urothelium: Life in a liquid environment.</a> Physiological Reviews. 100 (4), 1621-1705 (2020).</li>
<li>Truschel, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretch-regulated+exocytosis%2Fendocytosis+in+bladder+umbrella+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Stretch-regulated exocytosis/endocytosis in bladder umbrella cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 13 (3), 830-846 (2002).</li>
<li>Lewis, S. A., de Moura, J. L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+cytoplasmic+vesicles+into+apical+membrane+of+mammalian+urinary+bladder+epthelium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+%28London%29%22%5BJournal%5D)">Incorporation of cytoplasmic vesicles into apical membrane of mammalian urinary bladder epthelium.</a> Nature (London). 297 (5868), 685-688 (1982).</li>
<li>Eaton, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+and+contraction+of+the+umbrella+cell+apical+junctional+ring+in+response+to+bladder+filling+and+voiding%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Expansion and contraction of the umbrella cell apical junctional ring in response to bladder filling and voiding.</a> Molecular Biology of the Cell. 30 (16), 2037-2052 (2019).</li>
<li>Yu, W., Khandelwal, P., Apodaca, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+apical+and+basolateral+membrane+requirements+for+stretch-induced+membrane+traffic+at+the+apical+surface+of+bladder+umbrella+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct apical and basolateral membrane requirements for stretch-induced membrane traffic at the apical surface of bladder umbrella cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 20 (1), 282-295 (2009).</li>
<li>Birder, L., Andersson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urothelial+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Urothelial signaling.</a> Physiological Reviews. 93 (2), 653-680 (2013).</li>
<li>Birder, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urinary+bladder%2C+cystitis+and+nerve%2Furothelial+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Autonomic+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Urinary bladder, cystitis and nerve/urothelial interactions.</a> Autonomic Neuroscience. 182, 89-94 (2014).</li>
<li>Apodaca, G., Balestreire, E., Birder, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+uroepithelial-associated+sensory+web%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">The uroepithelial-associated sensory web.</a> Kidney International. 72 (9), 1057-1064 (2007).</li>
<li>Dalghi, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+roles+for+PIEZO1+and+PIEZO2+in+urothelial+mechanotransduction+and+lower+urinary+tract+interoception%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation+Insight%22%5BJournal%5D)">Functional roles for PIEZO1 and PIEZO2 in urothelial mechanotransduction and lower urinary tract interoception.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 6 (19), 152984(2021).</li>
<li>Montalbetti, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+urothelial+paracellular+transport+promotes+cystitis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%3A+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Increased urothelial paracellular transport promotes cystitis.</a> American Journal of Physiology: Renal Physiology. 309 (12), 1070-1081 (2015).</li>
<li>Keay, S. K., Birder, L. A., Chai, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+bladder+urothelial+pathophysiology+in+functional+bladder+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Evidence for bladder urothelial pathophysiology in functional bladder disorders.</a> BioMed Research International. 2014, 865463(2014).</li>
<li>Friedel, R. H., Wurst, W., Wefers, B., Kuhn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+conditional+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Generating conditional knockout mice.</a> Methods in Molecular Biology. 693, 205-231 (2011).</li>
<li>Kashyap, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down-regulation+of+nerve+growth+factor+expression+in+the+bladder+by+antisense+oligonucleotides+as+new+treatment+for+overactive+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Urology%22%5BJournal%5D)">Down-regulation of nerve growth factor expression in the bladder by antisense oligonucleotides as new treatment for overactive bladder.</a> Journal of Urology. 190 (2), 757-764 (2013).</li>
<li>Bolenz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+uptake+and+ex+vivo+urothelial+penetration+by+oligodeoxynucleotides+for+optimizing+treatment+of+transitional+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Quantitative+Cytology+and+Histology%22%5BJournal%5D)">Cellular uptake and ex vivo urothelial penetration by oligodeoxynucleotides for optimizing treatment of transitional cell carcinoma.</a> Analytical and Quantitative Cytology and Histology. 30 (5), 265-273 (2008).</li>
<li>Tyagi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravesical+antisense+therapy+for+cystitis+using+TAT-peptide+nucleic+acid+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Intravesical antisense therapy for cystitis using TAT-peptide nucleic acid conjugates.</a> Molecular Pharmaceutics. 3 (4), 398-406 (2006).</li>
<li>Sadoff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interim+results+of+a+phase+1-2a+trial+of+Ad26.COV2.S+Covid-19+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Interim results of a phase 1-2a trial of Ad26.COV2.S Covid-19 vaccine.</a> New England Journal of Medicine. 384 (19), 1824-1835 (2021).</li>
<li>Lee, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+gene+delivery%3A+Potential+applications+for+gene+and+cell-Based+therapies+in+the+new+era+of+personalized+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Diseases%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated gene delivery: Potential applications for gene and cell-Based therapies in the new era of personalized medicine.</a> Genes & Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).</li>
<li>Ramesh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+pretreatment+agents+to+enhance+adenovirus+infection+of+bladder+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Identification of pretreatment agents to enhance adenovirus infection of bladder epithelium.</a> Molecular Therapy. 10 (4), 697-705 (2004).</li>
<li>Khandelwal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab11a-dependent+exocytosis+of+discoidal%2Ffusiform+vesicles+in+bladder+umbrella+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Rab11a-dependent exocytosis of discoidal/fusiform vesicles in bladder umbrella cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15773-15778 (2008).</li>
<li>Khandelwal, P., Ruiz, W. G., Apodaca, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compensatory+endocytosis+in+bladder+umbrella+cells+occurs+through+an+integrin-regulated+and+RhoA-+and+dynamin-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Molecular+Biology+Organization+journal%22%5BJournal%5D)">Compensatory endocytosis in bladder umbrella cells occurs through an integrin-regulated and RhoA- and dynamin-dependent pathway.</a> The European Molecular Biology Organization journal. 29 (12), 1961-1975 (2010).</li>
<li>Khandelwal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rab11a-Rab8a-Myo5B+network+promotes+stretch-regulated+exocytosis+in+bladder+umbrella+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">A Rab11a-Rab8a-Myo5B network promotes stretch-regulated exocytosis in bladder umbrella cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 24 (7), 1007-1019 (2013).</li>
<li>Prakasam, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A1+adenosine+receptor-stimulated+exocytosis+in+bladder+umbrella+cells+requires+phosphorylation+of+ADAM17+Ser811+and+EGF+receptor+transactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">A1 adenosine receptor-stimulated exocytosis in bladder umbrella cells requires phosphorylation of ADAM17 Ser811 and EGF receptor transactivation.</a> Molecular Biology of the Cell. 25 (24), 3798-3812 (2014).</li>
<li>Gallo, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAB27B+requirement+for+stretch-induced+exocytosis+in+bladder+umbrella+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">RAB27B requirement for stretch-induced exocytosis in bladder umbrella cells.</a> American Journal of Physiology Cell Physiology. 314 (3), 349-365 (2018).</li>
<li>Amasheh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Claudin-2+expression+induces+cation-selective+channels+in+tight+junctions+of+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Claudin-2 expression induces cation-selective channels in tight junctions of epithelial cells.</a> Journal of Cell Science. 115, 4969-4976 (2002).</li>
<li>Yu, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+for+cation+selectivity+in+claudin-2-based+paracellular+pores%3A+identification+of+an+electrostatic+interaction+site%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Molecular basis for cation selectivity in claudin-2-based paracellular pores: identification of an electrostatic interaction site.</a> The Journal of General Physiology. 133 (1), 111-127 (2009).</li>
<li>Kasahara, H., Aoki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+using+adenoviral+RNAi+vector+in+vascular+smooth+muscle+cells+and+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Gene silencing using adenoviral RNAi vector in vascular smooth muscle cells and cardiomyocytes.</a> Methods in Molecular Medicine. 112, 155-172 (2005).</li>
<li>Bolognesi, B., Lehner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reaching+the+limit%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Reaching the limit.</a> eLife. 7, 39804(2018).</li>
<li>Atasheva, S., Shayakhmetov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+responses+to+adenovirus+and+adenovirus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Cytokine responses to adenovirus and adenovirus vectors.</a> Viruses. 14 (5), 888(2022).</li>
<li>Sanchez Freire, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+may+mediate+the+down-regulation+of+neurokinin-1+receptor+in+chronic+bladder+pain+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs may mediate the down-regulation of neurokinin-1 receptor in chronic bladder pain syndrome.</a> American Journal of Pathology. 176 (1), 288-303 (2010).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Mentre Ramesh et al. si sono concentrati sullo sviluppo di strategie per utilizzare la trasduzione adenovirale nel trattamento del cancro della vescica 18, rapporti più recenti hanno dimostrato l'utilità di queste tecniche nello studio della normale biologia uroteliale / fisiologia e fisiopatologia 10,18,19,20,21 . Le caratteristiche im...

L'urotelio è l'epitelio specializzato che riveste la pelvi renale, gli ureteri, la vescica e l'uretra prossimale1. Comprende tre strati: uno strato di cellule ombrello altamente differenziate e polarizzate spesso bi-nucleate, le cui superfici apicali sono immerse nelle urine; uno strato cellulare intermedio con una popolazione di cellule binucleate che amplificano il transito che possono dare origine a cellule ombrello superficiali in risposta alla loro perdita acuta; e un singolo strato di cellule basali, un sottoinsieme delle quali funziona come cellule staminali in grado di rigenerare l'intero urotelio in risposta a lesioni croniche. Le cellule ombrello sono principalmente responsabili della formazione della barriera uroteliale ad alta resistenza, i cui componenti includono una membrana apicale (ricca di colesterolo e cerebrosidi) con bassa permeabilità all'acqua e ai soluti e un complesso giunzionale apicale ad alta resistenza (composto da giunzioni strette, giunzioni aderenti, desmosomi e un anello di actomiosina associato)1 . Sia la superficie apicale della cellula ombrello che il suo anello giunzionale si espandono durante il riempimento della vescica e ritornano rapidamente al loro stato pre-riempito dopo aver annullato 1,2,3,4,5. Oltre al suo ruolo nella funzione di barriera, si ipotizza che l'urotelio abbia anche funzioni sensoriali e trasduttrici che gli consentono di percepire i cambiamenti nell'ambiente extracellulare (ad esempio, allungare) e trasmettere queste informazioni attraverso il rilascio di mediatori (tra cui ATP, adenosina e acetilcolina) ai tessuti sottostanti, compresi i processi nervosi afferenti suburoteliali 6,7,8 . Recenti prove di questo ruolo si trovano in topi privi di espressione uroteliale sia di Piezo1 che di Piezo2, che si traduce in un'alterata funzione minzionale9. Inoltre, i ratti che sovraesprimono la proteina CLDN2 che forma i pori stretti nello strato cellulare dell'ombrello sviluppano infiammazione e dolore analoghi a quelli osservati nei pazienti con cistite interstiziale10. Si ipotizza che l'interruzione della funzione sensoriale/trasduttore uroteliale o della barriera possa contribuire a diversi disturbi della vescica 6,11.
Una migliore comprensione della biologia dell'urotelio negli stati normali e patologici dipende dalla disponibilità di strumenti che consentiranno ai ricercatori di sottoregolare prontamente l'espressione genica endogena o consentire l'espressione di transgeni nel tessuto nativo. Mentre un approccio per sottoregolare l'espressione genica è quello di generare topi knockout uroteliali condizionali, questo approccio dipende dalla disponibilità di topi con alleli floxati, è laborioso e può richiedere mesi o anni per completarne12. Non sorprende quindi che i ricercatori abbiano sviluppato tecniche per trasfettare o trasdurre l'urotelio, che possono portare a risultati su una scala temporale più breve. I metodi pubblicati per la trasfezione includono l'uso di lipidi cationici13, oligodeossinucleotidi fosforotioati antisenso14 o acidi nucleici antisenso legati alla proteina TAT dell'HIV che penetra il peptide 11-mer15. Tuttavia, il focus di questo protocollo è sull'uso della trasduzione adenovirale-mediata, una metodologia ben studiata che è efficiente nella consegna genica a una vasta gamma di cellule, è stata testata in numerosi studi clinici e più recentemente è stata utilizzata per fornire il cDNA che codifica la proteina del capside COVID-19 ai destinatari di una variante del vaccino COVID-1916, 17. Per una descrizione più approfondita del ciclo di vita dell'adenovirus, dei vettori adenovirali e delle applicazioni cliniche degli adenovirus, il lettore è indirizzato al riferimento17.
Un'importante pietra miliare nell'uso di adenovirus per trasdurre l'urotelio, è stato un rapporto di Ramesh et al. che ha mostrato brevi pretrattamenti con detergenti, tra cui N-dodecil-β-D-maltoside (DDM) drammaticamente aumentato la trasduzione dell'urotelio da parte di un adenovirus che codifica β-galattosidasi18. Utilizzando questo studio proof-of-principle come guida, la trasduzione adenovirale-mediata dell'urotelio è stata ora utilizzata per esprimere una varietà di proteine, tra cui GTPasi della famiglia Rab, fattori di scambio guanina-nucleotide, frammenti motori di miosina, claudine associate alla giunzione stretta che formano pori e ADAM17 10,19,20,21,22 . Lo stesso approccio è stato adattato per esprimere piccoli RNA interferenti (siRNA), i cui effetti sono stati salvati da varianti co-esprimenti resistenti ai siRNA del transgene22. Il protocollo qui descritto include metodi generali per generare grandi quantità di adenovirus altamente concentrato, un requisito per queste tecniche, nonché adattamenti dei metodi di Ramesh et al.18 per esprimere transgeni nell'urotelio con alta efficienza.

<table><tbody><tr><td>Pipetta da 10 mL</td><td>Corning Costar (Millipore Sigma)</td><td>CLS4488</td><td>pipetta sierologica sterile, confezionata singolarmente</td></tr><tr><td>Provetta per ultracentrifuga da 12 mL</td><td>ThermoFisher</td><td>06-752</td><td>Provetta per ultracentrifuga a parete sottile in PET Provetta</td>per</tr><tr><td>centrifuga conica da 15 mL</td><td>Falcon (Corning)</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>sterile ago da 18 G</td><td>BD&nbsp;</td><td>305196</td><td>18 G x 1,5 pollici ago</td></tr><tr><td>Pipetta da 20 mL</td><td>Corning Costar (Millipore Sigma)</td><td>CLS4489</td><td>pipetta sierologica sterile, confezionata singolarmente</td></tr><tr><td>Provetta da centrifuga conica da 50 mL</td><td>Falcon (Corning)</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>pipetta sterile da 5 mL</td><td>Corning Costar (Millipore Sigma)</td><td>CLS4487</td><td>pipetta sierologica sterile, confezionata singolarmente</td></tr><tr><td>Cavicide</td><td>Henry Schein</td><td>6400012</td><td>Soluzione antivirale</td></tr><tr><td>Piatto per colture cellulari - 15 cm</td><td>Falcon (Corning)</td><td>353025</td><td>sterile, trattato per colture tissutali&nbsp; (piatto da 150 mm x 25 mm)</td></tr><tr><td>Raschietto cellulare</td><td>Sarstedt</td><td>893.1832</td><td>lunghezza manico 24 cm, lunghezza lama 1,7 cm</td></tr><tr><td>CsCl</td><td>Millipore Sigma</td><td>C-4306</td><td>Grado di biologia molecolare &ge; 98%</td></tr><tr><td>Terreno di coltura DMEM (alto glucosio)</td><td>Gibco (ThermoFisher)</td><td>11965092</td><td>con 4,5 g/L di glucosio + L-glutammina + fenolo rosso</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Millipore Sigma</td><td>EDS</td><td>Bioiultra grado &ge; 99%</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino&nbsp;</td><td>Hyclone (Cytiva)</td><td>SH30070.03</td><td>siero definito</td></tr><tr><td>Pipetta di vetro</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20A</td><td>5,75 in pipetta di vetro, autoclavata</td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Millipore Sigma</td><td>G-5516</td><td>Grado di biologia molecolare &ge; 99%</td></tr><tr><td>cellule HEK293</td> Le cellule <td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td>HEK293T sono una variante delle cellule HEK293 che esprimono l'isoflurano SV40 grande antigene T</td></tr><tr><td></td><td>Catetere IV Covetrus</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>- topo</td><td>Smith Medical Jelco</td><td>3063</td><td>24 G x 3/4 in Catetere IV di sicurezza &nbsp; catetere IV radiopaco</td></tr><tr><td>- ratto</td><td>Smith Medical Jelco</td><td>3060</td><td>22 G x 1 in catetere IV di sicurezza radiopaco</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Millipore Sigma</td><td>P-9541</td><td>Grado di biologia molecolare &ge; 99%</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Millipore Sigma</td><td>P5655</td><td>Grado di coltura cellulare&nbsp; &ge; 99%</td></tr><tr><td>Na2HPO4&bull; 7 H2O</td><td>Millipore Sigma</td><td>431478</td><td>&nbsp; &ge; 99,99%</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Millipore Sigma</td><td>S3014</td><td>Grado di biologia molecolare &ge; 99%</td></tr><tr><td>N-dodecil-&beta;-D-maltoside&nbsp;</td><td>Millipore Sigma</td><td>D4641</td><td>&nbsp; &ge; 98%</td></tr><tr><td>Cono nasale per più animali</td> le opzioni commerciali <td>progettate</td><td></td> su misura <td>includono una colonna Parkland Scientific (RES3200)</td></tr><tr><td>PD-10</td><td>GE Healthcare</td><td>17-085-01</td><td>Colonne preimpaccate riempite con Sephadex G-25M</td></tr><tr><td>Penicillina/streptomicina antibiotico (100x)</td><td>Gibco (ThermoFisher)</td><td>15070063</td><td>100x soluzione concentrata</td></tr><tr><td>Spettrofotometro</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>Biofotometro</td><td></td></tr><tr><td>Supporto e pinza</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-679Q e 05-769-8FQ</td><td>disponibile presso numerosi fornitori</td></tr><tr><td>Unità filtrante sterile</td><td>Fisher Scientific (Nalgene)</td><td>09-740-65B</td><td>0.2 &; m unità filtrante a flusso rapido (150 mL)</td></tr><tr><td>Unità filtrante sterile 0,2 & micro; m (siringa)</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>SLGV004SL</td><td>Millipore Sigma Milex 0.22 &micro; m unità filtrante che si collega alla siringa</td></tr><tr><td>Centrifuga super veloce</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>5810R</td><td>con rotore ad angolo fisso Eppendorf F34-6-38 (12.000 giri/min)</td></tr><tr><td>Siringa (1 mL)</td><td>BD&nbsp;</td><td>309628</td><td>Siringa da 1 ml Punta Luer-lok - siringa sterile</td></tr><tr><td>(3 ml)</td><td>BD&nbsp;</td><td>309656</td><td>Siringa da 3 mL con puntale a slittamento - Centrifuga da</td></tr><tr><td>tavolo sterile (bassa velocità)</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>5702</td><td>con rotore a secchiello oscillante</td></tr><tr><td>Pipette di trasferimento</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-9AM</td><td>polietilene 3,4 mL pipetta di trasferimento</td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Millipore Sigma</td><td>648310-M</td><td>Grado di biologia molecolare</td></tr><tr><td>TrypLE select proteasi soluzione</td><td>Gibco (ThermoFisher)</td><td>12604013</td><td>enzima espresso TrypLE (1x), senza rosso fenolo</td></tr><tr><td>Ultracentrifuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima L-80 XP</td><td>con rotore Beckman SW41 (41.000 giri/min)</td></tr><tr><td>Vaporizzatore&nbsp;</td><td>Servizi di anestesia generale, Inc.</td><td>Tec 3</td><td>Vaporizzatore di isoflurano</td></tr><tr><td>Vortex Mixer</td><td>VWR</td><td>10153-838</td><td>Miscelatore a vortice analogico</td></tr></tbody></table>

espressione di transgeni nell'urotelio vescicale nativo mediante trasduzione mediata da adenovirus

Expression of Transgenes in Native Bladder Urothelium Using Adenovirus-Mediated Transduction

Oltre a formare una barriera ad alta resistenza, si ipotizza che l'urotelio che riveste la pelvi renale, gli ureteri, la vescica e l'uretra prossimale percepisca e trasmetta informazioni sul suo ambiente ai tessuti sottostanti, promuovendo la funzione e il comportamento minzionale. La rottura della barriera uroteliale, o della sua funzione sensoriale / trasduttore, può portare a malattie. Lo studio di questi eventi complessi è ostacolato dalla mancanza di strategie semplici per alterare l'espressione genica e proteica nell'urotelio. Qui sono descritti metodi che consentono ai ricercatori di generare grandi quantità di adenovirus ad alto titolo, che può quindi essere utilizzato per trasdurre l'urotelio dei roditori con alta efficienza e in modo relativamente semplice. Sia i cDNA che i piccoli RNA interferenti possono essere espressi utilizzando la trasduzione adenovirale e l'impatto dell'espressione del transgene sulla funzione uroteliale può essere valutato da 12 ore a diversi giorni dopo. Questi metodi hanno un'ampia applicabilità agli studi di biologia uroteliale normale e anormale utilizzando modelli animali murini o ratti.

Preparazione del virus Un esempio di purificazione del virus mediante centrifugazione a gradiente di densità è mostrato nella Figura 1A. La banda rosa chiaro, che si trova all'interfaccia tra il materiale cellulare caricato e lo strato di CsCl da 1,25 g/ml, è composta principalmente da cellule disgregate e dai loro detriti (vedi freccia magenta in Figura 1A). Deriva il suo colore rosato dalla piccola quantità di terreno di coltura che viene r...

Vengono descritti metodi per la generazione di grandi quantità di adenovirus ricombinanti, che possono quindi essere utilizzati per trasdurre l'urotelio nativo dei roditori consentendo l'espressione di transgeni o la downregulation di prodotti genici endogeni.

Espressione di transgeni nell'urotelio vescicale nativo mediante trasduzione mediata da adenovirus

In addition to forming a high-resistance barrier, the urothelium lining the renal pelvis, ureters, bladder, and proximal urethra is hypothesized to sense ...

Questo protocollo descrive i metodi che consentono ai ricercatori di esprimere CDNA o SIRNA nell'urotelio vescicale nativo. I principali vantaggi di questa tecnica sono la sua relativa semplicità, la capacità di esprimere cDNA, siRNA nell'urotelio con alta efficienza e in un periodo di tempo relativamente breve. La parte più difficile di questa tecnica è il cateterismo.Tuttavia, la tecnica complessiva è relativamente facile da padroneggiare una volta appresa. A dimostrare la procedura sarà Giovanni Ruiz, Research Specialist IV nel mio laboratorio. Per iniziare posizionare il topo anestetizzato su una piastra riscaldante vicino ai coni del naso.Mantenere l'animale sotto anestesia per tutta la durata del protocollo. Confermare che il mouse è completamente anestetizzato con un pizzico di punta. Per evitare l'introduzione di aria nella vescica, riempire la porzione di catetere di plastica di un catetere IV e dell'hub associato con PBS sterile utilizzando una pipetta di trasferimento sterile o una siringa.Con l'animale in posizione supina tamponare il meato uretrale esterno con alcol al 70%. Quindi afferrare delicatamente il tessuto che forma il meato uretrale esterno ed estenderlo vert

expression-transgenes-native-bladder-urothelium-using-adenovirus

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Vescica iniezione del mouse muro è un approccio utile per lo studio delle cellule staminali ortotopicamente della vescica e della biologia del cancro. Questo metodo microchirurgico delicato può essere padroneggiato con tecnica attenta e pratica.

Topo iniezione parete della vescica

Stabilire un modello di tumore della vescica ortotopica per valutare gli effetti antitumorali di sarna via endovescicale consegnate e monitoraggio della crescita tumorale con l'ecografia e imaging bioluminescente.

Un modello ortotopico tumore della vescica e la valutazione del trattamento intravescicale sarna

Questo video dimostra la somministrazione di plasmidi di DNA nell'urotelio della vescica del topo utilizzando una combinazione di tecniche di cateterismo uretrale ed elettroporazione. La procedura descritta consente la generazione di modelli di cancro della vescica di topo.

Somministrazione di plasmidi di DNA nell'urotelio della vescica di topo: una procedura basata sull'elettroporazione per erogare in modo efficiente plasmidi di DNA nelle cellule uroteliali della vescica murina per generare modelli geneticamente modificati

Impianto di cellule tumorali nell'organo di origine può servire come un modello preclinico utile per valutare nuove terapie. Cellule di carcinoma della vescica MB49 possono essere coltivate all'interno della vescica seguente instillazione intravescicale. Questo protocollo dimostra cateterizzazione della vescica topo a scopo di impianto tumorale e consegna adenovirale.

Un ortotopico cancro della vescica Modello di Gene Studi di consegna

Un N-butil-N-(4-idrossibutil) nitrosamine indotta modello di cancro alla vescica è stato sviluppato in mucina umano 1 (MUC1) topi transgenici per la fine del controllo MUC1-diretto immunoterapia. Dopo la somministrazione di un vaccino peptidico MUC1-mirata, una risposta di linfociti T citotossici per MUC1 è stata confermata misurando i livelli sierici di citochine e l'attività delle cellule T specifiche.

Induzione di Invasive Transitional cellulare Bladder Carcinoma in immunitario intatto umani MUC1 topi transgenici: un modello di sviluppo Immunoterapia

Questo protocollo descrive un metodo neoformato per la consegna di virus alla prostata murina. Utilizzando la tecnologia CRISPR/Cas9, sovraespressione genica o consegna di Cre ricombinasi, la tecnica permette di orthotopic alterazione dell'espressione genica e implementa nuovi modelli murini per carcinoma della prostata.

Consegna di virus di CRISPR guide alla prostata per alterazione del Gene murina

Descriviamo un metodo novello per la consegna del plasmide del DNA nelle cellule uroteliali del mouse della vescica in vivo tramite cateterizzazione dell'uretra e l'elettroporazione. Offre un modo veloce e conveniente per la generazione di modelli murini autoctoni di malattie di vescica.

Nuovo metodo di consegna plasmide DNA Urothelium della vescica del Mouse mediante elettroporazione

Questo protocollo fornisce passaggi sperimentali dettagliati per stabilire una coltura tridimensionale in vitro degli organoidi tumorali della vescica derivati dal cancro della miscite della vescica indotta da cancerogeni cancero. Sono descritti metodi di coltura tra cui passaggio, ingegneria genetica e trapianto ortotopico di organoidi tumorali.

Cultura, manipolazione e trapianto ortotopico di organidi tumorali della vescica del topo

Questo protocollo descrive il processo di generazione e caratterizzazione di organoidi uroteliali di topo che ospitano delezioni in geni di interesse. I metodi includono la raccolta di cellule uroteliali di topo, la trasduzione ex vivo con adenovirus che guida l'espressione di Cre con un promotore CMV e la caratterizzazione in vitro e in vivo .

Ex Vivo Modello organoide delle delezioni geniche mediate da Adenovirus-Cre in cellule uroteliali di topo

Questo protocollo descrive una metodologia per valutare la funzione dei canali ionici attivati meccanicamente nelle cellule uroteliali native utilizzando il sensore fluorescente Ca2+ GCaMP5G.

Ex Vivo Analisi di transitori di Ca2+ attivati meccanicamente in cellule uroteliali

Impara a esprimere transgeni nell'urotelio vescicale nativo mediante trasduzione con adenovirus ricombinante. Questo metodo raggiunge quasi il 95% di efficienza nelle cellule uroteliali, facilitando lo studio della biologia vescicale.

Espressione di transgeni nell'urotelio vescicale nativo mediante trasduzione mediata da adenovirus

Esplora altri video