Name: Saggio spot del vuoto in tempo reale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: Scopri il saggio spot del vuoto in tempo reale per studiare il comportamento di minzione nei topi. Questo metodo fornisce dati temporali, spaziali e volumetrici sugli eventi di minzione durante le fasi di luce e buio.

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Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione NIH R01DK119183 (a G.A. e MDC), un premio per un progetto pilota attraverso P30DK079307 (a M.G.D.), un premio per lo sviluppo della carriera dell'American Urology Association e una sovvenzione della Winters Foundation (a NM), e dal Cell Physiology and Model Organisms Kidney Imaging Cores del Pittsburgh Center for Kidney Research (P30DK079307).

<ol><li>Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+urothelium%3A+life+in+a+liquid+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The urothelium: life in a liquid environment.</a> Physiological Reviews. 100 (4), 1621(2020).</li>
<li>de Groat, W. C., Griffiths, D., Yoshimura, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+control+of+the+lower+urinary+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Comprehensive+Physiology%22%5BJournal%5D)">Neural control of the lower urinary tract.</a> Comprehensive Physiology. 5 (1), 327(2015).</li>
<li>Dalghi, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+roles+for+PIEZO1+and+PIEZO2+in+urothelial+mechanotransduction+and+lower+urinary+tract+interoception%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Functional roles for PIEZO1 and PIEZO2 in urothelial mechanotransduction and lower urinary tract interoception.</a> JCI Insight. 6 (19), (2021).</li>
<li>Montalbetti, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bladder+infection+with+uropathogenic+Escherichia+coli+increases+the+excitability+of+afferent+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Bladder infection with uropathogenic Escherichia coli increases the excitability of afferent neurons.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 322 (1), 1(2022).</li>
<li>Montalbetti, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+urothelial+paracellular+transport+promotes+cystitis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Increased urothelial paracellular transport promotes cystitis.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 309 (12), 1070(2015).</li>
<li>Montalbetti, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urothelial+tight+junction+barrier+dysfunction+sensitizes+bladder+afferents%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Urothelial tight junction barrier dysfunction sensitizes bladder afferents.</a> eNeuro. 4 (3), (2017).</li>
<li>Montalbetti, N., Stocker, S. D., Apodaca, G., Bastacky, S. I., Carattino, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urinary+K%2B+promotes+irritative+voiding+symptoms+and+pain+in+the+face+of+urothelial+barrier+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Urinary K+ promotes irritative voiding symptoms and pain in the face of urothelial barrier dysfunction.</a> Scientific Reports. 9 (1), 5509(2019).</li>
<li>Kim, A. K., Hamadani, C., Zeidel, M. L., Hill, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urological+complications+of+obesity+and+diabetes+in+males+and+females+of+three+mouse+models%3A+temporal+manifestations%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Urological complications of obesity and diabetes in males and females of three mouse models: temporal manifestations.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 318 (1), 160(2020).</li>
<li>Bartolone, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micturition+defects+and+altered+bladder+function+in+the+klotho+mutant+mouse+model+of+aging%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+and+Experimental+Urology%22%5BJournal%5D)">Micturition defects and altered bladder function in the klotho mutant mouse model of aging.</a> American Journal of Clinical and Experimental Urology. 8 (3), (2020).</li>
<li>de Rijk, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging-associated+changes+in+oxidative+stress+negatively+impacts+the+urinary+bladder+urothelium%5BTitle%5D)+AND+%22International+Neurourology+Journal%22%5BJournal%5D)">Aging-associated changes in oxidative stress negatively impacts the urinary bladder urothelium.</a> International Neurourology Journal. 26 (2), 111(2022).</li>
<li>Coyne, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prevalence+of+lower+urinary+tract+symptoms+%28LUTS%29+and+overactive+bladder+%28OAB%29+by+racial%2Fethnic+group+and+age%3A+results+from+OAB-POLL%5BTitle%5D)+AND+%22Neurourology+and+Urodynamics%22%5BJournal%5D)">The prevalence of lower urinary tract symptoms (LUTS) and overactive bladder (OAB) by racial/ethnic group and age: results from OAB-POLL.</a> Neurourology and Urodynamics. 32 (3), 230(2013).</li>
<li>Wittig, L., Carlson, K. V., Andrews, J. M., Crump, R. T., Baverstock, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetic+bladder+dysfunction%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Urology%22%5BJournal%5D)">Diabetic bladder dysfunction: a review.</a> Urology. 123, (2019).</li>
<li>Irwin, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population-based+survey+of+urinary+incontinence%2C+overactive+bladder%2C+and+other+lower+urinary+tract+symptoms+in+five+countries%3A+results+of+the+EPIC+study%5BTitle%5D)+AND+%22European+Urology%22%5BJournal%5D)">Population-based survey of urinary incontinence, overactive bladder, and other lower urinary tract symptoms in five countries: results of the EPIC study.</a> European Urology. 50 (6), 1314(2006).</li>
<li>Bogart, L. M., Berry, S. H., Clemens, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symptoms+of+interstitial+cystitis%2C+painful+bladder+syndrome+and+similar+diseases+in+women%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Urology%22%5BJournal%5D)">Symptoms of interstitial cystitis, painful bladder syndrome and similar diseases in women: a systematic review.</a> The Journal of Urology. 177 (2), 450(2007).</li>
<li>Foxman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urinary+tract+infection+syndromes%3A+occurrence%2C+recurrence%2C+bacteriology%2C+risk+factors%2C+and+disease+burden%5BTitle%5D)+AND+%22Infectious+Disease+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Urinary tract infection syndromes: occurrence, recurrence, bacteriology, risk factors, and disease burden.</a> Infectious Disease Clinics of North America. 28 (1), 1(2014).</li>
<li>Fall, M., Logadottir, Y., Peeker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interstitial+cystitis+is+bladder+pain+syndrome+with+Hunner%27s+lesion%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Urology%22%5BJournal%5D)">Interstitial cystitis is bladder pain syndrome with Hunner's lesion.</a> International Journal of Urology. 21, 79(2014).</li>
<li>Birder, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urinary+bladder%2C+cystitis+and+nerve%2Furothelial+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Autonomic+Neuroscience%3A+Basic+%26+Clinical%22%5BJournal%5D)">Urinary bladder, cystitis and nerve/urothelial interactions.</a> Autonomic Neuroscience: Basic & Clinical. 182, 89(2014).</li>
<li>Rosen, J. M., Klumpp, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+pain+from+urinary+tract+infection%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Urology.+21+Suppl%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of pain from urinary tract infection.</a> International Journal of Urology. 21 Suppl. 1, 26(2014).</li>
<li>Birder, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+control+of+the+lower+urinary+tract%3A+peripheral+and+spinal+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Neurourology+and+Urodynamics%22%5BJournal%5D)">Neural control of the lower urinary tract: peripheral and spinal mechanisms.</a> Neurourology and Urodynamics. 29 (1), 128(2010).</li>
<li>Desjardins, C., Maruniak, J. A., Bronson, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Social+rank+in+house+mice%3A+differentiation+revealed+by+ultraviolet+visualization+of+urinary+marking+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Social rank in house mice: differentiation revealed by ultraviolet visualization of urinary marking patterns.</a> Science. 182 (4115), 939(1973).</li>
<li>Sugino, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voided+stain+on+paper+method+for+analysis+of+mouse+urination%5BTitle%5D)+AND+%22Neurourology+and+Urodynamics%22%5BJournal%5D)">Voided stain on paper method for analysis of mouse urination.</a> Neurourology and Urodynamics. 27 (6), 548(2008).</li>
<li>Hill, W. G., Zeidel, M. L., Bjorling, D. E., Vezina, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Void+spot+assay%3A+recommendations+on+the+use+of+a+simple+micturition+assay+for+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Void spot assay: recommendations on the use of a simple micturition assay for mice.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 315 (5), (2018).</li>
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<li>Birder, L., Andersson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+modelling+of+interstitial+cystitis%2Fbladder+pain+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22International+Neurourology+Journal%22%5BJournal%5D)">Animal modelling of interstitial cystitis/bladder pain syndrome.</a> International Neurourology Journal. 22, (2018).</li>
<li>Okinami, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+detrusor+gap+junction+communications+induce+storage+symptoms+in+bladder+inflammation%3A+a+mouse+cyclophosphamide-induced+model+of+cystitis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Altered detrusor gap junction communications induce storage symptoms in bladder inflammation: a mouse cyclophosphamide-induced model of cystitis.</a> PLoS One. 9 (8), (2014).</li>
<li>Tungtur, S. K., Nishimune, N., Radel, J., Nishimune, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Behavior+Tracker%3A+An+economical+method+for+tracking+behavior+in+home+cages%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Mouse Behavior Tracker: An economical method for tracking behavior in home cages.</a> Biotechniques. 63 (5), (2017).</li>
<li>Negoro, H., Kanematsu, A., Yoshimura, K., Ogawa, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronobiology+of+micturition%3A+putative+role+of+the+circadian+clock%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Urology%22%5BJournal%5D)">Chronobiology of micturition: putative role of the circadian clock.</a> The Journal of Urology. 190 (3), (2013).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

L'incorporazione del video-monitoraggio è una modifica economica che presenta diversi vantaggi rispetto al VSA classico. Nel VSA classico, che viene tipicamente utilizzato come test end-point, è difficile distinguere punti vuoti sovrapposti. Questa non è una preoccupazione banale, poiché i topi tendono a urinare più volte nella stessa area quando il test viene prolungato per diverse ore, in genere negli angoli della loro gabbia. Pertanto, il primo vantaggio di RT-VSA è che lo sperimentatore può facilmente identificare i ...

La conservazione delle urine e la minzione sono coordinate da un circuito centrale (sistema nervoso centrale) che riceve informazioni sullo stato di riempimento della vescica attraverso i nervi pelvico e ipogastrico. L'urotelio, l'epitelio che riveste il tratto urinario dalla pelvi renale all'uretra prossimale, forma una stretta barriera ai prodotti di scarto metabolici e agli agenti patogeni presenti nelle urine. È parte integrante di una rete sensoriale, che rileva e comunica lo stato di riempimento della vescica ai tessuti sottostanti e ai nervi afferenti 1,2. La rottura della barriera uroteliale, o alterazioni nelle vie di meccanotrasduzione uroteliale, possono portare a disfunzioni minzionali insieme a sintomi del tratto urinario inferiore come frequenza, urgenza, nicturia e incontinenza 3,4,5,6,7. Allo stesso modo, l'invecchiamento, il diabete, le infezioni del tratto urinario inferiore, la cistite interstiziale e altri processi patologici che colpiscono la vescica urinaria o i circuiti associati che controllano la sua funzione, sono noti per causare disfunzione della vescica 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17, 18,19. Una migliore comprensione del comportamento minzionale normale e anormale dipende dallo sviluppo di metodi che possono discriminare in modo affidabile tra diversi modelli di minzione.
Tradizionalmente, il comportamento di minzione volontaria dei topi è stato studiato utilizzando il void spot assay (VSA), sviluppato da Desjardins e colleghi20, e ampiamente adottato grazie alla sua semplicità, basso costo e approccio non invasivo 8,21,22,23,24. Questo test viene tipicamente eseguito come test finale, in cui un topo trascorre una quantità definita di tempo in una gabbia rivestita da una carta da filtro, che viene successivamente analizzata contando il numero e valutando la dimensione delle macchie di urina quando la carta da filtro viene posta sotto luce ultravioletta (UV) (le macchie di urina sono fluorescenti in queste condizioni)20. Nonostante questi numerosi vantaggi, il VSA tradizionale presenta alcune importanti limitazioni. Poiché i topi spesso urinano nelle stesse aree, i ricercatori devono limitare la durata del test a un periodo di tempo relativamente breve (≤4 ore)25. Anche quando il VSA viene eseguito su periodi di tempo più brevi, è quasi impossibile risolvere piccoli punti vuoti (SVS) che cadono su grandi macchie vuote o, per discriminare le SVS dal trascinamento di urina aderente alla coda o alle zampe. È anche molto difficile distinguere se le SVS sono una conseguenza di frequenti ma singoli eventi minzionali (un fenotipo che si osserva spesso in risposta alla cistite 4,26), o a causa del dribbling post-minzione (un fenotipo associato all'ostruzione dello sbocco della vescica27). Inoltre, il desiderio di completare il test durante l'orario di lavoro, unito alle difficoltà di accesso alle strutture abitative quando le luci sono spente, spesso limita questi test al periodo di luce del ciclo circadiano di 24 ore. Pertanto, questi vincoli temporali impediscono la valutazione del comportamento minzionale del topo durante la loro fase notturna attiva, diminuendo la capacità di analizzare geni o trattamenti specifici che sono governati dai ritmi circadiani.
Per superare alcune di queste limitazioni, i ricercatori hanno sviluppato metodi alternativi per valutare il comportamento minzionale in tempo reale 26,28,29,30,31,32. Alcuni di questi approcci prevedono l'uso di attrezzature costose come le gabbie metaboliche26,28,29 o l'uso di telecamere termiche30; Tuttavia, anche questi hanno dei limiti. Ad esempio, nelle gabbie metaboliche, l'urina tende ad aderire ai fili del pavimento della rete e alle pareti dell'imbuto, riducendo la quantità di urina che viene raccolta e misurata. Pertanto, può essere difficile raccogliere con precisione dati su piccoli vuoti. Inoltre, le gabbie metaboliche non forniscono informazioni sulla distribuzione spaziale degli eventi di minzione (cioè la minzione negli angoli rispetto al centro della camera). Dato che la radiazione infrarossa a lunga lunghezza d'onda utilizzata dalle telecamere termografiche non penetra i solidi, l'attività di svuotamento valutata dalla videotermografia deve essere eseguita in un sistema aperto, che può essere difficile con i topi attivi, in quanto possono saltare diversi centimetri nell'aria. Un altro sistema è l'approccio automatizzato aVSOP (automated voided stain on paper)33, che consiste in carta da filtro arrotolata che si avvolge a velocità costante sotto il pavimento in rete metallica di una gabbia per topi. Questo approccio previene i danni alla carta e la sovrapposizione di macchie di urina che si verificano nel VSA classico e la sua implementazione consente allo sperimentatore di eseguire esperimenti per diversi giorni. Tuttavia, non fornisce allo sperimentatore una tempistica precisa degli eventi di minzione e non vi è alcuna capacità di esaminare il comportamento e come si correla con lo spotting. Per ottenere queste informazioni, i ricercatori hanno incorporato il video-monitoraggio ai saggi di minzione, un approccio che consente la valutazione simultanea dell'attività del topo e degli eventi di minzione31,32. Un approccio consiste nel posizionare un diodo a emissione di luce blu (LED) e una videocamera con un filtro proteico a fluorescenza verde posto sotto la gabbia sperimentale per visualizzare gli eventi di svuotamento, e un LED a infrarossi e una videocamera sopra la gabbia per catturare la posizione del mouse32. Questa configurazione è stata utilizzata per monitorare il comportamento dello svuotamento durante l'esecuzione della fotometria delle fibre; Tuttavia, l'ambiente illuminato di questo sistema ha richiesto ai ricercatori di trattare i loro topi con un agente diuretico per stimolare la minzione. In un altro progetto sperimentale, le telecamere grandangolari sono state posizionate sopra e sotto la gabbia sperimentale per visualizzare rispettivamente l'attività motoria del topo e gli eventi di minzione. In questo caso, le macchie di urina depositate su una carta da filtro che riveste il pavimento della gabbia sono state rivelate illuminando la carta da filtro con luci UV poste sotto la gabbia31. Questa configurazione è stata utilizzata in saggi brevi, della durata di 4 minuti, durante la fase luminosa del giorno per studiare i neuroni del tronco cerebrale coinvolti nel comportamento di minzione volontaria31. L'idoneità di questo sistema per il suo utilizzo durante la fase di buio o per periodi di tempo >4 minuti non è stata riportata.
In questo articolo viene descritto un metodo che migliora il VSA tradizionale consentendo il monitoraggio video a lungo termine del comportamento di svuotamento del mouse. Questo approccio economico fornisce informazioni temporali, spaziali e volumetriche sugli eventi di svuotamento per lunghi periodi di tempo durante le fasi di luce e buio del giorno, insieme a dettagli relativi al comportamento del mouse 3,4,34. Vengono fornite informazioni dettagliate per la costruzione delle camere di svuotamento, l'implementazione di un VSA (RT-VSA) in tempo reale e l'analisi dei dati. L'RT-VSA è prezioso per i ricercatori che cercano di comprendere i meccanismi fisiologici che controllano la funzione del sistema urinario, per sviluppare approcci farmacologici per controllare la minzione e per definire le basi molecolari dei processi patologici che colpiscono il tratto urinario inferiore.

<table><tbody><tr><td>1,00 pollici X 1,00 pollici Profilo con scanalatura a T - Quattro scanalature a T aperte &nbsp; taglio a 10 pollici</td><td>80/20</td><td>1010</td><td>Quantità: 20</td></tr><tr><td>1.00 " X 1,00 pollici Profilo con scanalatura a T - Quattro scanalature a T aperte &nbsp; taglio a 12 pollici</td><td>80/20</td><td>1010</td><td>Quantità: 6</td></tr><tr><td>1.00 " X 1,00 pollici Profilo con scanalatura a T - Quattro scanalature a T aperte &nbsp; taglio a 40 pollici</td><td>80/20</td><td>1010</td><td>Quantità: 4</td></tr><tr><td>1.00 " X 1,00 pollici Profilo con scanalatura a T - Quattro scanalature a T aperte taglio a 14,75 pollici</td><td>80/20</td><td>1010</td><td>Quantità: 12</td></tr><tr><td>1,00" X 1,00 pollici Profilo con scanalatura a T - Quattro scanalature a T aperte taglio a 32 pollici</td><td>80/20</td><td>1010</td><td>Quantità: 5</td></tr><tr><td>1/4-20 Dado a T economico a doppio scorrimento</td><td>80/20</td><td>3280</td><td>Importo: 16</td></tr><tr><td>1/4-20 Dado a T economico a triplo scorrimento</td><td>80/20</td><td>3287</td><td>Quantità: 18</td></tr><tr><td>10 e 25 Serie 2 fori - Staffa angolare interna scanalata da 18 mm con doppio supporto</td><td>80/20</td><td>14061</td><td>Quantità: 6</td></tr><tr><td>Serie 10 3 fori - Piastra piana diritta</td><td>80/20</td><td>4118</td><td>Pezzi: 8</td></tr><tr><td>Serie 10 5 Fori - Piastra Piana "L"</td><td>80/20</td><td>4081</td><td>Pezzi: 8</td></tr><tr><td>Serie 10 5 Fori - Piastra Piana a "T"</td><td>80/20</td><td>4080</td><td>Pezzi: 8</td></tr><tr><td>Serie 10 5 Fori - Piastra Piana a T</td><td>80/20</td><td>4140</td><td>Pezzi: 2</td></tr><tr><td>Serie 10 Cerniera Sollevabile Standard - Gruppo Destro</td><td>80/20</td><td>2064</td><td>Pezzi: 2</td></tr><tr><td>Serie da 10 a 15 a 2 fori - Transizione Lite Staffa angolare interna</td><td>80/20</td><td>4509</td><td>Quantità: 6</td></tr><tr><td>luci a tubo UV lunghe 24"</td><td>ADJ Products LLC</td><td>T8-F20BLB24</td><td>Quantità: 2 lampadina da 20 W &ndash; 24" Lunghezza d'onda: 365nm</td></tr><tr><td>Foglio</td> di <td>specchio acrilico Plastica</td><td></td> professionale <td>Quantità: 1 82,5 cm x 26,5 cm</td></tr><tr><td>Foglio di specchio acrilico</td><td>Plastica</td><td></td> professionale <td>Quantità: 2 26,5 cm x 30,5 cm</td></tr><tr><td>Foglio di specchio</td><td>acrilico Plastica</td><td></td> professionale <td>Quantità: 2 82,5 cm x 30,5 cm</td></tr><tr><td>Policarbonato AR (resistenza ai raggi UV)</td><td>80/20</td><td>65-2641</td><td>Quantità: 2 4,5 mm di spessore, trasparente, 38,5 cm x 26,5 cm</td></tr><tr><td>Policarbonato AR (resistenza ai raggi UV)</td><td>80/20</td><td>65-2641</td><td>Quantità: 4 4,5 mm di spessore, trasparente, 38,5 cm x 21,5 cm</td></tr><tr><td>Policarbonato AR (resistenza ai raggi UV)</td><td>80/20</td><td>65-2641</td><td>Quantità: 4 4,5 mm di spessore, trasparente, 26,5 cm x 21,5 cm</td></tr><tr><td>Policarbonato AR (resistenza ai raggi UV)</td><td>80/20</td><td>65-2641</td><td>Quantità: 4 4,5 mm di spessore, trasparente 37,5 cm x 23,9 cm</td></tr><tr><td>Policarbonato AR (resistenza ai raggi UV)</td><td>80/20</td><td>65-2641</td><td>Quantità: 4 4,5 mm di spessore, trasparente, 24,4 cm x 23,9 cm</td></tr><tr><td>Carta per cromatografia (carta sottile)</td><td>&nbsp; Thermo Fisher Scientific</td><td>57144</td><td></td></tr><tr><td>Cosmos carta assorbente (carta spessa)</td><td>Blick Art Materials</td><td>10422-1005</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad Software</td><td>Versione 9.4.0</td><td>software per grafici e statistiche</td></tr><tr><td>ImageJ FIJI</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Merck</td><td></td><td>film trasparente</td></tr><tr><td>Quick Time Player 10.5 software&nbsp;</td><td>Lettore multimediale</td> <td>Apple</td><td></td></tr><tr><td>Spia di sicurezza</td><td>Ben software</td><td></td><td>sistema software di videosorveglianza</td></tr><tr><td>Standard End Fastener, 1/4-20</td><td>80/20</td><td>3381</td><td>Quantità: 80</td></tr><tr><td>Acrilico a trasmissione UV</td><td>Spartech</td><td>Polycast Solacryl SUVT</td><td>Quantità: 2 38,5 cm x 26,5 cm&nbsp;</td></tr><tr><td>Gel d'acqua: HydroGel</td><td>ClearH2O&nbsp;</td><td>&nbsp; 70-01-5022</td><td>(https://www.clearh2o.com/product/hydrogel/)</td></tr><tr><td>Webcam</td><td>Logitech</td><td>C930e</td><td>Quantità: 4</td></tr></tbody></table>

saggio spot del vuoto in tempo reale

Real-Time Void Spot Assay

Il normale comportamento minzionale è il risultato della funzione coordinata della vescica, dell'uretra e degli sfinteri uretrali sotto il corretto controllo del sistema nervoso. Per studiare il comportamento di minzione volontaria nei modelli murini, i ricercatori hanno sviluppato il void spot assay (VSA), un metodo che misura il numero e l'area di macchie di urina depositate su una carta da filtro che riveste il pavimento della gabbia di un animale. Sebbene tecnicamente semplice e poco costoso, questo test presenta dei limiti quando viene utilizzato come test end-point, tra cui la mancanza di risoluzione temporale degli eventi minzionali e le difficoltà nel quantificare le macchie di urina sovrapposte. Per superare queste limitazioni, abbiamo sviluppato un VSA video-monitorato, che chiamiamo VSA IN TEMPO REALE (RT-VSA), e che ci consente di determinare la frequenza di svuotamento, valutare il volume vuoto e i modelli di svuotamento ed effettuare misurazioni su finestre temporali di 6 ore durante le fasi buie e chiare del giorno. Il metodo descritto in questo rapporto può essere applicato a un'ampia varietà di studi basati sui topi che esplorano gli aspetti fisiologici e neurocomportamentali della minzione volontaria negli stati di salute e malattia.

Comportamento minzionale dei topi knockout uroteliali piezo1/2 
Durante la fase di conservazione del ciclo di minzione, si ipotizza che l'urotelio percepisca la tensione esercitata dall'urina accumulata nella vescica e trasduca questo stimolo meccanico in risposte cellulari come il rilascio sieroso di ATP 1,3. Abbiamo precedentemente dimostrato che i canali PIEZO1 e PIEZO2 attivati meccanicamente sono espressi...

Questo articolo descrive un nuovo metodo per studiare il comportamento di minzione del topo incorporando il monitoraggio video nel test convenzionale del punto vuoto. Questo approccio fornisce informazioni temporali, spaziali e volumetriche sugli eventi di svuotamento e sui dettagli del comportamento del mouse durante le fasi di luce e buio del giorno.

Saggio spot del vuoto in tempo reale

Normal voiding behavior is the result of the coordinated function of the bladder, the urethra, and the urethral sphincters under the proper control of the ...

Il metodo descritto in questo rapporto può essere utilizzato per comprendere gli aspetti fisiologici e neuro-comportamentali della minzione volontaria negli stati di salute e malattia. Questa tecnica ci consente di monitorare il comportamento del volume del mouse nelle fasi chiare e scure del giorno e fornisce informazioni temporali, spaziali e volumetriche sugli eventi di svuotamento. Per preparare un test spot vuoto in tempo reale o una camera di registrazione RT-VSA, posizionare una carta da filtro sottile o spessa, a seconda dell'ora del giorno, nella parte inferiore della gabbia di registrazione RT-VSA.Sopra la carta da filtro, posizionare un igloo di plastica per dormire; un tubo sterile da 1,5 ml di microcentrifuga per scopi di arricchimento e un piatto di plastica da 60 mm x 15 mm contenente due o tre pezzi di chow secco di topo e da 14 a 16 grammi di acqua sotto forma di un pacchetto di gel. Una volta che la camera di registrazione è pronta, posizionare delicatamente il mouse sulla carta da filtro. Assicurarsi che il trasferimento del mouse dalla gabbia dell'alloggiamento alla gabbia di registrazione avvenga con il minimo sforzo.Una volta che il mouse è all'interno della gabbia di registrazione, posizionare il coperchio e coprire la parte superiore del coperchio con un pad blu da banco assorbente per ridurre al minimo i riflessi diretti della luce ambientale sulla superficie del coperchio in plexiglass. Accendere le luci ultraviolette nella camera inferiore. Per registrare video RT-VSA dalle telecamere superiore e inferiore, utilizzare il software di registrazione di videosorveglianza configurato per registrare contemporaneamente da più webcam o telecamere di rete.Avviare la registrazione premendo Cmd R nella finestra del programma. Esegui registrazioni video a un fotogramma al secondo. Subito dopo aver avviato le registrazioni, esci dalla stanza e chiudi delicatamente la porta.Assicurati che la stanza rimanga silenziosa per l'intero esperimento. Interrompere le registrazioni premendo Cmd T.Spegnere le luci ultraviolette. Dopo aver interrotto la registrazione, il software genera automaticamente un file filmato in formato m4v per ogni telecamera e lo salva sotto il nome della fotocamera in una cartella di destinazione precedentemente selezionata.Verificare che all'interno della cartella di ogni fotocamera gli esperimenti siano organizzati in cartelle per data. In ogni cartella di date o esperimenti, verificate che sia presente un file m4v e tutti i singoli file jpeg corrispondenti a ciascun fotogramma filmato. Crea una cartella sul desktop con il nome e la data dell'esperimento e trasferisci i file m4v in questa cartella.Copiare la cartella del filmato in un'unità flash per l'analisi su un computer esterno. Aprire un filmato raccolto dalla fotocamera inferiore durante la fase di luce o dalla fotocamera superiore durante la fase di buio per l'analisi. Dopo aver valutato la qualità del filmato, analizza gli esperimenti spostandoti nella finestra temporale corretta utilizzando il comando di avanzamento rapido o il dispositivo di scorrimento della barra temporale.L'attività di svuotamento durante la fase luminosa viene registrata tra le 11:00 e le 17:00 e durante la fase oscura, tra mezzanotte e le 6:00. Riproduci il filmato in modalità di avanzamento rapido facendo clic sull'icona di avanzamento rapido o scorri manualmente il filmato, cercando la prova che il mouse si sta annullando. Cerca l'improvvisa comparsa di macchie luminose di urina sulla carta da filtro o i cambiamenti comportamentali, incluso il movimento agli angoli della gabbia e un breve periodo di inattività quando il topo sta svuotando. Registra l'ora in cui si verifica ogni vuoto.Come convenzione, il tempo del vuoto viene registrato al primo segno che viene rilevata l'urina. Per misurare il vuoto, utilizzare prima la barra di scorrimento per spostarsi avanti o indietro nel tempo, cercando il punto in cui si è verificata la massima diffusione della macchia urinaria. Metti in pausa il filmato a questo punto e posiziona la freccia del mouse del computer nel punto in analisi per contrassegnare il punto di interesse nello screenshot.Assegna un nome al file dello screenshot utilizzando numeri correlati per tenere conto dell'ordine di apparizione nel filmato. Una volta analizzati tutti i punti vuoti, misurare l'area totale della carta da filtro catturando uno screenshot e delineando il bordo della carta da filtro. Calcola l'area percentuale di ciascuna delle macchie di urina.Trasforma i valori dell'area percentuale nel volume di urina per ogni punto vuoto utilizzando le curve di calibrazione e la funzione di interpolazione nel software grafico. Il comportamento minzionale dei topi femmina e maschio Piezo1, 2, knockout e di controllo è stato registrato durante la fase buia e chiara del giorno. Durante la loro fase di luce inattiva, non sono state osservate differenze significative in tutti i parametri analizzati per topi knockout femmina o maschio rispetto al controllo.Tuttavia, nella fase oscura attiva, i topi knockout femmina e maschio hanno mostrato un fenotipo minzionale alterato, caratterizzato da un aumento significativo del numero e del volume totale di piccole macchie vuote. Non ci sono state differenze significative nei punti di vuoto primario o nel numero di PVS, nel volume medio per PVS o nel volume totale di PVS nei topi knockout femmina o maschio rispetto ai topi di controllo. Il comportamento minzionale dei topi femmina è stato testato in condizioni basali e dopo il trattamento con ciclofosfamide.Rispetto alle condizioni basali, la quantità di rilascio di urina per vuoto è minore dopo il trattamento con ciclofosfamide e gli eventi di minzione sono molto più frequenti. Un aspetto chiave per la riproducibilità del saggio è manipolare gli animali nel modo più delicato possibile e tenerli sotto stress minimo durante l'intero periodo di prova. Poiché si tratta di un test non invasivo, è possibile eseguire ulteriori procedure in seguito, tra cui citometria ed elettromiografia per valutare rispettivamente le funzioni dello sfintere della vescica e dell'uretra esterna.L'implementazione di questa tecnica consentirà ai ricercatori di definire il contributo di percorsi specifici al comportamento minzionale negli stati di salute e malattia.

Research

Ricerca

JoVE Journal

Behavior

Comportamento

L'identificazione di bersagli microbici di immunità adattativa nelle malattie idiopatica può essere realizzato tramite l'uso delle analisi enzima-collegata immunospot.

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT): Quantificazione di Th-1 risposte cellulari immunitarie contro antigeni microbici

Noi descriviamo un metodo per la determinazione quantitativa, misurazione in tempo reale di DNA glicosilasi e attività di endonucleasi di AP in lisati cellulari nucleari. Il test produce tassi di attività DNA Repair suscettibili di analisi cinetica ed è adattabile per la quantificazione delle attività di riparazione del DNA nei tessuti e lisati tumorali o con le proteine ​​purificate.

Quantitativa, in tempo reale Analisi dell&#39;attività riparazione per escissione Base in lisati cellulari Utilizzando Molecular Beacons Lesione specifici

Questo video dimostra l'azione capillare radiale differenziale del saggio del ligando, una tecnica per lo screening sistematico ad alto rendimento delle proteine leganti il secondo messaggero nucleotidico intracellulare. Questa tecnica consente il legame diretto dei messaggeri con la proteina bersaglio sovraespressa nel lisato cellulare, bypassando la necessità di purificazione delle proteine.

Azione capillare radiale differenziale del saggio del ligando: una tecnica ad alto rendimento per identificare le proteine intracellulari leganti il secondo messaggero nucleotidico batterico

Dimostriamo una tecnologia di chip di snap per l'esecuzione di test immunologici cross-reactivity-gratis multiplex panino semplicemente schioccando due diapositive. Un'apparecchiatura di snap è utilizzata per il trasferimento in modo affidabile i reagenti da microarray a DNA-microarray. Il chip di snap può essere utilizzato per eventuali reazioni biochimiche che richiedono colocalizzazione di reagenti diversi senza la contaminazione incrociata.

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Un metodo non-radio-isotopica non etichettata per correzione di bozze della polimerasi del DNA e un saggio di riparazione del DNA è stato sviluppato utilizzando la spettrometria di massa MALDI-TOF ad alta risoluzione e una strategia di estensione di singolo nucleotide. Il test ha dimostrato di essere molto specifico, semplice, rapida e facile da eseguire per la correzione di bozze e riparare le patch inferiore 9-nucleotidi.

Correzione di bozze e saggio di riparazione del DNA usando l'analisi di spettrometria di massa di singolo Nucleotide estensione e MALDI-TOF

Qui, descriviamo un metodo per purificare enzimi pyrophosphokinase istidina-etichettate e utilizzando la cromatografia su strato sottile di radiomarcato substrati e prodotti di test per l' attività enzimatica in vitro. L'analisi di attività dell'enzima è ampiamente applicabile a qualsiasi chinasi, ciclasi del nucleotide o reazione di fosforo-trasferimento cui meccanismo include idrolisi di trifosfato del nucleotide.

Una purificazione e l'analisi di attività In Vitro per un ppGpp (p) sintetasi da Clostridium difficile

Qui, rappresentiamo un protocollo per la radioetichettatura completamente automatizzata di [11C]SNAP-7941 e l'analisi della cinetica in tempo reale di questo PET-tracer su P-gp che esprime e non esprime.

Aspetto tecnico della sintesi automatizzata e valutazione cinetica in tempo reale di [11C]SNAP-7941

Introduciamo un protocollo per misurare la risposta del farmaco in tempo reale nelle fette di tessuto tumorale organotipico. La strategia sperimentale qui descritta fornisce una piattaforma per effettuare schermi di farmaci a medio-alta produzione su fette di tessuto derivate da tumori clinici o murini in condizioni di ex vivo.

Misurazione della risposta dei farmaci in tempo reale nelle fette di tessuto tumorale organotipico

Questo protocollo presenta test rapidi di suscettibilità antimicrobica (AST) entro 2,5 ore mediante imaging Raman scattering stimolato da singole cellule del metabolismo di D2O. Questo metodo si applica ai batteri nelle urine o nell'ambiente del sangue intero, che è trasformativo per l'AST fenotipico a singola cellula rapida nella clinica.

Test rapidi di sensibilità antimicrobica mediante imaging Raman scattering stimolato dell'incorporazione del deuterio in un singolo batterio

Un metodo non marcato, non radio-isotopico per analizzare l'attività della glicosilasi uracil-DNA, è stato sviluppato utilizzando la spettrometria di massa MALDI-TOF per l'analisi diretta del prodotto contenente sito apurinico/aprimidinico. Il test si è rivelato abbastanza semplice, specifico, rapido e facile da usare per la misurazione della glicosilasi del DNA.

Saggio di glicosilasi uracil-DNA mediante desorbimento laser assistito da matrice/analisi spettrometria di massa a tempo di volo

Descriviamo una piattaforma di immunodosaggio di recente sviluppo basata sui principi della biologia sintetica cell-free e sulla tecnica dot-blot per il rilevamento personalizzabile della risposta anticorpale in sieri umani e animali.

Cell-Free Dot Blot come piattaforma di immunodosaggio pratica e adattabile per il rilevamento della risposta anticorpale in sieri umani e animali

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Saggio spot del vuoto in tempo reale

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