Saggio spot del vuoto in tempo reale

Il metodo descritto in questo rapporto può essere utilizzato per comprendere gli aspetti fisiologici e neuro-comportamentali della minzione volontaria negli stati di salute e malattia. Questa tecnica ci consente di monitorare il comportamento del volume del mouse nelle fasi chiare e scure del giorno e fornisce informazioni temporali, spaziali e volumetriche sugli eventi di svuotamento. Per preparare un test spot vuoto in tempo reale o una camera di registrazione RT-VSA, posizionare una carta da filtro sottile o spessa, a seconda dell'ora del giorno, nella parte inferiore della gabbia di registrazione RT-VSA.

Sopra la carta da filtro, posizionare un igloo di plastica per dormire; un tubo sterile da 1,5 ml di microcentrifuga per scopi di arricchimento e un piatto di plastica da 60 mm x 15 mm contenente due o tre pezzi di chow secco di topo e da 14 a 16 grammi di acqua sotto forma di un pacchetto di gel. Una volta che la camera di registrazione è pronta, posizionare delicatamente il mouse sulla carta da filtro. Assicurarsi che il trasferimento del mouse dalla gabbia dell'alloggiamento alla gabbia di registrazione avvenga con il minimo sforzo.

Una volta che il mouse è all'interno della gabbia di registrazione, posizionare il coperchio e coprire la parte superiore del coperchio con un pad blu da banco assorbente per ridurre al minimo i riflessi diretti della luce ambientale sulla superficie del coperchio in plexiglass. Accendere le luci ultraviolette nella camera inferiore. Per registrare video RT-VSA dalle telecamere superiore e inferiore, utilizzare il software di registrazione di videosorveglianza configurato per registrare contemporaneamente da più webcam o telecamere di rete.

Avviare la registrazione premendo Cmd R nella finestra del programma. Esegui registrazioni video a un fotogramma al secondo. Subito dopo aver avviato le registrazioni, esci dalla stanza e chiudi delicatamente la porta.

Assicurati che la stanza rimanga silenziosa per l'intero esperimento. Interrompere le registrazioni premendo Cmd T.Spegnere le luci ultraviolette. Dopo aver interrotto la registrazione, il software genera automaticamente un file filmato in formato m4v per ogni telecamera e lo salva sotto il nome della fotocamera in una cartella di destinazione precedentemente selezionata.

Verificare che all'interno della cartella di ogni fotocamera gli esperimenti siano organizzati in cartelle per data. In ogni cartella di date o esperimenti, verificate che sia presente un file m4v e tutti i singoli file jpeg corrispondenti a ciascun fotogramma filmato. Crea una cartella sul desktop con il nome e la data dell'esperimento e trasferisci i file m4v in questa cartella.

Copiare la cartella del filmato in un'unità flash per l'analisi su un computer esterno. Aprire un filmato raccolto dalla fotocamera inferiore durante la fase di luce o dalla fotocamera superiore durante la fase di buio per l'analisi. Dopo aver valutato la qualità del filmato, analizza gli esperimenti spostandoti nella finestra temporale corretta utilizzando il comando di avanzamento rapido o il dispositivo di scorrimento della barra temporale.

L'attività di svuotamento durante la fase luminosa viene registrata tra le 11:00 e le 17:00 e durante la fase oscura, tra mezzanotte e le 6:00. Riproduci il filmato in modalità di avanzamento rapido facendo clic sull'icona di avanzamento rapido o scorri manualmente il filmato, cercando la prova che il mouse si sta annullando. Cerca l'improvvisa comparsa di macchie luminose di urina sulla carta da filtro o i cambiamenti comportamentali, incluso il movimento agli angoli della gabbia e un breve periodo di inattività quando il topo sta svuotando. Registra l'ora in cui si verifica ogni vuoto.

Come convenzione, il tempo del vuoto viene registrato al primo segno che viene rilevata l'urina. Per misurare il vuoto, utilizzare prima la barra di scorrimento per spostarsi avanti o indietro nel tempo, cercando il punto in cui si è verificata la massima diffusione della macchia urinaria. Metti in pausa il filmato a questo punto e posiziona la freccia del mouse del computer nel punto in analisi per contrassegnare il punto di interesse nello screenshot.

Assegna un nome al file dello screenshot utilizzando numeri correlati per tenere conto dell'ordine di apparizione nel filmato. Una volta analizzati tutti i punti vuoti, misurare l'area totale della carta da filtro catturando uno screenshot e delineando il bordo della carta da filtro. Calcola l'area percentuale di ciascuna delle macchie di urina.

Trasforma i valori dell'area percentuale nel volume di urina per ogni punto vuoto utilizzando le curve di calibrazione e la funzione di interpolazione nel software grafico. Il comportamento minzionale dei topi femmina e maschio Piezo1, 2, knockout e di controllo è stato registrato durante la fase buia e chiara del giorno. Durante la loro fase di luce inattiva, non sono state osservate differenze significative in tutti i parametri analizzati per topi knockout femmina o maschio rispetto al controllo.

Tuttavia, nella fase oscura attiva, i topi knockout femmina e maschio hanno mostrato un fenotipo minzionale alterato, caratterizzato da un aumento significativo del numero e del volume totale di piccole macchie vuote. Non ci sono state differenze significative nei punti di vuoto primario o nel numero di PVS, nel volume medio per PVS o nel volume totale di PVS nei topi knockout femmina o maschio rispetto ai topi di controllo. Il comportamento minzionale dei topi femmina è stato testato in condizioni basali e dopo il trattamento con ciclofosfamide.

Rispetto alle condizioni basali, la quantità di rilascio di urina per vuoto è minore dopo il trattamento con ciclofosfamide e gli eventi di minzione sono molto più frequenti. Un aspetto chiave per la riproducibilità del saggio è manipolare gli animali nel modo più delicato possibile e tenerli sotto stress minimo durante l'intero periodo di prova. Poiché si tratta di un test non invasivo, è possibile eseguire ulteriori procedure in seguito, tra cui citometria ed elettromiografia per valutare rispettivamente le funzioni dello sfintere della vescica e dell'uretra esterna.

L'implementazione di questa tecnica consentirà ai ricercatori di definire il contributo di percorsi specifici al comportamento minzionale negli stati di salute e malattia.