Impianto di cannula intracranica per infusioni seriali di cellule T del recettore dell'antigene chimerico locoregionale (CAR) nei topi

Questo protocollo replica un sistema di catetere intraventricolare utilizzato negli studi clinici in corso per testare la somministrazione regionale locale della terapia con cellule T CAR diretta contro i tumori del sistema nervoso centrale. Il vantaggio principale di questa tecnica è la capacità di fornire dosi multiple ripetute di terapia regionale locale con cellule T CAR senza eseguire più procedure chirurgiche invasive. Questo sistema potrebbe essere utilizzato per studiare diverse terapie in diversi siti di consegna, e quindi potrebbe fornire informazioni su una miriade di aree di ricerca nelle neuroscienze.

Per iniziare, posizionare il topo anestetizzato con la testa rasata sul tavolo operatorio e aprire delicatamente la parte inferiore del braccio stereotassico usando una spatola. Inserire la cannula con una pinza e fissarla stringendo la vite sul braccio fino a quando da metà a due terzi della porzione di plastica bianca e cinque millimetri della cannula sporgono dal fondo dell'apertura. Inserire e fissare i denti superiori del mouse nella barra del morso dell'apparato stereotassico.

Tirare il cono del naso in avanti e stringerlo, assicurandosi che il topo inali isoflurano. Quindi, montare il mouse sull'apparecchio stereotassico riscaldato utilizzando polsini auricolari o barre auricolari, evitando una pressione eccessiva. Disinfettare il sito chirurgico e fare un taglio parallelo al cranio come descritto nel manoscritto.

Utilizzare tamponi di punta di cotone per spingere via la fascia. Identificare i punti di riferimento, bregma e lambda sul cranio corrispondenti ai segni anteriori e posteriori in cui si incontrano le placche craniche. Per creare una superficie per attaccare l'acrilico, fare delicatamente diverse fessure sul cranio usando un bisturi.

Utilizzando il braccio stereotassico, localizzare la cannula nel punto di interesse. Sollevare la punta della cannula da uno a due millimetri sopra la superficie del cranio e spostarsi alle coordinate desiderate. Utilizzando un ago calibro 18 o un trapano chirurgico, praticare due fori per viti sul cranio esposto lontano da dove entra la cannula, garantendo spazio sufficiente per la cannula.

Ruotare il trapano attraverso il foro della vite fino a quando non si attacca al cranio. Con un cacciavite a punta piatta, inserire e fissare due viti nei fori. Quindi, tirare delicatamente la vite verso l'alto per assicurarsi che sia fissata.

Per inserire una cannula, creare un foro nel cranio alle coordinate identificate utilizzando un ago calibro 18 o un trapano chirurgico. Utilizzando il braccio stereotassico, abbassare la cannula alla coordinata DV desiderata. A circa 0,3 grammi di polvere di resina acrilica e da 10 a 15 gocce di liquido in una piastra di porcellana a 12 pozzetti, caricare il materiale viscoso di colore bianco preparato in una siringa da un millilitro.

Rivestire il cranio e riempire gli spazi intorno alla cannula e alla vite. Allentare la vite sul braccio stereotassico mentre il cemento è flessibile. Utilizzare delicatamente una spatola per rilasciare la cannula dal supporto all'apertura inferiore e ritrarre il braccio stereotassico lontano dal mouse.

Una volta asciugato il cemento, inserire la cannula fittizia nella cannula di guida e ruotare in senso orario per fissarla saldamente. Una volta completata la procedura, riportare il mouse nella sua gabbia domestica riscaldata per il recupero. Per preparare la cannula di trattamento, inserire la sua parte superiore nel tubo PKG.

Quindi, riempire la siringa di trattamento con sospensione di cellule T CAR e inserirla attraverso l'altra estremità del tubo PKG, coprendo la parte superiore della cannula di trattamento. Dopo aver anestetizzato il mouse, fissare la cannula guida alla base usando una pinza. Svitare e rimuovere la cannula fittizia, consentendo l'accesso alla cannula guida.

Infondere le cellule T CAR per un minuto e tenere la cannula di trattamento in posizione per un ulteriore minuto. Dopo aver rimosso la cannula di trattamento, riavvitare saldamente una cannula fittizia. Quindi, somministrare meloxicam per via sottocutanea per il controllo del dolore.

La terapia con cellule T CAR diretta da GPC2 ha indotto una significativa regressione tumorale nel medulloblastoma e una sopravvivenza significativamente prolungata nel modello di glioma talamico diffuso della linea mediana. Quando si inserisce la cannula guida in una posizione intratumorale, è importante capire che le coordinate dorsale-ventrale possono essere più superficiali dell'iniezione tumorale per tenere conto delle lunghezze di proiezione della cannula fittizia e del trattamento.