Name: Impianto di cannula intracranica per infusioni seriali di cellule T del recettore dellantigene chimerico locoregionale (CAR) nei topi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 22 s
Description: Scopri l'impianto di cannula intracranica per infusioni seriali di cellule CAR-T locoregionali nei topi. Questo metodo consente somministrazioni ripetute senza chirurgie invasive multiple, migliorando lo studio dei tumori del sistema nervoso centrale.

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Il finanziamento per questo lavoro è stato fornito dalla Matthew Larson Foundation, dalla Grayson Saves Foundation, da Hyundai Hope on Wheels Young Investigator Award, dalla Kortney Rose Foundation, dal National Institutes of Health NCI K12 CA076931-19 e 1K08CA263179-01 e dal Dipartimento della Difesa W81XWH-21-1-0221.

Tutte le procedure del protocollo sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee del Children's Hospital di Philadelphia (IAC 19-000907), accreditato dall'AAALAC. Questo studio ha utilizzato topi NOD scid gamma (NSG) di 6-12 settimane con tumori ortotopici dello xenotrapianto; Tuttavia, il protocollo può essere utilizzato su qualsiasi ceppo di mouse. I topi NSG sono stati alloggiati in condizioni di barriera sterile e la chirurgia eseguita sotto armadi sterili di biosicurezza. Quando vengono utilizzati materiali umani come cellule tumorali o cellule T, le procedure e la manipolazione devono essere completate negli armadi di biosicurezza ABSL-2.
1. Preparare il topo per l'intervento chirurgico
<ol><li>Anestetizzare il topo in una camera di induzione con isoflurano (2-4%) ad una portata di ossigeno di 1 L/min fino a raggiungere un adeguato piano di anestesia (circa 5 min).</li>
	<li>Pesare il topo usando una bilancia con l'approssimazione di 0,1 g e somministrare buprenorfina sottocutanea a lento rilascio (SR) (1 mg/kg) o altro analgesico. NOTA: SR buprenorfina fornisce analgesia per 72 ore.</li>
	<li>Rasare la pelliccia sulla parte superiore della testa del topo usando tagliatrici elettriche o agenti depilatori.</li>
	<li>Utilizzare una spatola per aprire delicatamente la parte inferiore del braccio stereotassico e inserire la cannula guida con una pinza. Stringere la vite sul braccio per fissare la cannula in modo che circa 1/2-2/3 della porzione di plastica bianca della cannula sporga dal fondo dell'apertura, insieme all'intera lunghezza metallica di 5 mm della cannula.</li>
	<li>Inserire e fissare i denti superiori del mouse nella barra del morso dell'apparato stereotassico. Tirare il cono del naso in avanti e stringerlo, assicurandosi che il topo stia inalando isoflurano.</li>
	<li>Montare il mouse sull'apparecchio stereotassico riscaldato utilizzando polsini auricolari o barre auricolari, evitando una pressione eccessiva. NOTA: il vassoio riscaldato deve avere un termometro rettale inserito e il vassoio riscaldante deve essere regolato per mantenere una normale temperatura corporea del mouse durante la procedura.</li>
	<li>Applicare un unguento oftalmico sterile su entrambi gli occhi utilizzando un applicatore con punta di cotone.</li>
	<li>Pulire il sito chirurgico con povidone-iodio su un tampone o applicatore, seguito da un tampone imbevuto di alcool. Eseguire questo passaggio tre volte in totale.</li>
	<li>Prima di iniziare la procedura, eseguire un pizzico con pinza per valutare un'adeguata sedazione.</li>
</ol>2. Procedura chirurgica
NOTA: Tutti gli aspetti della procedura chirurgica utilizzano strumenti sterilizzati e tecniche asettiche. I topi continuano in anestesia con isoflurano (2-4%) per tutta la durata della procedura, circa 10-20 minuti.
<ol><li>Raccogliere delicatamente il cuoio capelluto tra le orecchie con una pinza. Usando le forbici sterili, tagliare il cuoio capelluto sollevato parallelamente al cranio e rimuovere un lembo ovale di pelle (0,75-1 cm di lunghezza) per esporre il cranio. NOTA: Le forbici sono preferite a un bisturi per fornire un'apertura pulita di forma ovale e per evitare danni inutili alla pelle e ai tessuti circostanti.</li>
	<li>Spingere via la fascia usando un bisturi o tamponi di cotone e un pellet di cotone emostatico per aiutare a rallentare il sanguinamento eccessivo, se necessario. NOTA: L'uso del lato in legno di una punta di cotone sterile può anche allontanare la fascia e aiutare ad evitare un eccessivo sanguinamento.</li>
	<li>Identificare i punti di riferimento bregma e lambda, i rispettivi segni anteriori e posteriori sul cranio dove le placche craniche si incontrano13. NOTA: L'identificazione può essere aumentata pulendo la parte superiore del cranio esposto con perossido di idrogeno.</li>
	<li>Segna delicatamente il cranio usando un bisturi per creare una superficie per l'acrilico da attaccare. Il punteggio dovrebbe includere più linee lineari di circa 0,5-1 cm di lunghezza ad angoli di 90° l'una rispetto all'altra.</li>
	<li>Utilizzando il braccio stereotassico, localizzare la cannula al punto di riferimento di interesse (bregma o lambda). Una volta localizzato, sollevare la punta della cannula di 1-2 mm sopra la superficie del cranio e spostarsi alle coordinate desiderate. Per le iniezioni intratumorali, questo utilizza le stesse coordinate A / P e M / L del posizionamento del tumore.</li>
	<li>Sul cranio esposto, lontano dalla zona in cui entrerà la cannula, praticare due fori per viti con un ago da 18 G o un trapano chirurgico. Assicurarsi che i fori siano distanziati per includere spazio sufficiente per la cannula. Usando una punta da trapano, ruotare attraverso i fori delle viti fino a quando non si attaccano al cranio. Inserire e fissare due viti nei fori usando un cacciavite a punta piatta. Quindi, tirare delicatamente le viti verso l'alto per assicurarsi che siano fissate. NOTA: Non inserire le viti fino a quando non sono a filo con il cranio, o potrebbero danneggiare il cervello del topo sottostante. Lasciare almeno uno spazio di 1-2 mm tra la vite e il cranio.</li>
	<li>Utilizzando un ago da 18 G o un trapano chirurgico, perforare il cranio alle coordinate identificate per creare un foro per la cannula da inserire.</li>
	<li>Utilizzando il braccio stereotassico, abbassare la cannula alla coordinata D/V desiderata. NOTA: La coordinata D/V dell'impianto della cannula deve tenere conto della lunghezza di proiezione del manichino e delle cannule di trattamento e può essere più superficiale dell'iniezione ortotopica di cellule tumorali (Figura 1).</li>
	<li>In una lastra di porcellana a 12 pozzetti, riempire un pozzetto con polvere di resina acrilica (circa 0,3 g) e 10-15 gocce (circa 0,5-0,75 ml) di liquido di resina acrilica. Questo produce un materiale viscoso di colore bianco. Aspirare la miscela in una siringa da 1 mL e usarla per rivestire e coprire il cranio, riempiendo gli spazi intorno alla cannula e alle viti. NOTA: Il materiale viscoso si indurisce nel tempo in cemento, quindi questo passaggio deve essere completato immediatamente dopo la miscelazione.</li>
	<li>Mentre il cemento è ancora flessibile, allentare la vite sul braccio stereotassico e utilizzare una spatola nell'apertura in basso per rilasciare delicatamente la cannula dal supporto e ritrarre lentamente il braccio stereotassico verso l'alto lontano dal mouse.</li>
	<li>Una volta che il cemento è completamente asciutto, inserire la cannula fittizia nella cannula di guida e fissarla saldamente ruotando in senso orario.</li>
	<li>Una volta completata la procedura, riposizionare il topo nella sua gabbia domestica riscaldata per monitorare attentamente, assicurando un adeguato recupero e registrando eventuali osservazioni post-procedura, incluso che il topo ha completamente ripreso conoscenza, prima di tornare alla colonia. NOTA: In genere si consiglia di posizionare solo metà della gabbia su una piastra riscaldante per consentire all'animale di spostarsi sul lato più fresco per evitare il surriscaldamento.</li>
	<li>Somministrare analgesici aggiuntivi, se necessario, se i topi mostrano comportamenti indicativi di dolore post-operatorio, come meloxicam 5 mg / kg somministrato per via sottocutanea una volta al giorno per un massimo di 3 giorni.</li>
</ol>3. Preparazione delle cellule T CAR
<ol><li>Misurare la concentrazione di cellule T CAR pre-trasfettate utilizzando un contatore cellulare.</li>
	<li>Centrifugare le cellule T pre-trasfettate a 200 x g per 5 minuti a temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Aspirare il surnatante utilizzando una pipetta sterile Pasteur su un sistema di aspirazione sotto vuoto e risospendere il pellet in soluzione salina tamponata fosfatae (PBS) alla concentrazione desiderata. I volumi di consegna tipici sono 2-5 μL. Le dosi cellulari tipiche sono 0,5-5 x 106 cellule.</li>
</ol>4. Infusioni di cellule T CAR
<ol><li>Preparare la cannula di trattamento alimentando la parte superiore attraverso un piccolo pezzo di tubo PKG.</li>
	<li>Riempire la siringa di trattamento con la sospensione di cellule T CAR e inserirla attraverso l'altra estremità del tubo PKG, sufficiente a coprire la parte superiore della cannula di trattamento.</li>
	<li>Anestetizzare il topo con isoflurano (2-4%) ad una portata di ossigeno di 1 L/min.</li>
	<li>Stabilizzare la cannula di guida utilizzando una pinza alla base, quindi svitare e rimuovere con cura la cannula fittizia, consentendo l'accesso alla cannula di guida. NOTA: una configurazione stereotassica non è necessaria, ma può essere utilizzata per stabilizzare la testa per il trattamento.</li>
	<li>Infondere le cellule T CAR per 1 minuto e tenere la cannula di trattamento in posizione per un ulteriore 1 minuto dopo la cessazione dell'infusione.</li>
	<li>Rimuovere la cannula di trattamento e riavvitare saldamente la cannula fittizia in posizione.</li>
	<li>Somministrare meloxicam per via sottocutanea (5 mg/kg) per il controllo facoltativo del dolore.</li>
</ol>

<ol><li>Curtin, S. C., Minino, A. M., Anderson, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Declines+in+cancer+death+rates+among+children+and+adolescents+in+the+United+States%2C+1999-2014%5BTitle%5D)+AND+%22NCHS+Data+Brief%22%5BJournal%5D)">Declines in cancer death rates among children and adolescents in the United States, 1999-2014.</a> NCHS Data Brief. 257, 1-8 (2016).</li>
<li>Rohaan, M. W., Wilgenhof, S., Haanen, J. B. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+cellular+therapies%3A+the+current+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Archiv%22%5BJournal%5D)">Adoptive cellular therapies: the current landscape.</a> Virchows Archiv. 474 (4), 449-461 (2019).</li>
<li>Sadelain, M., Brentjens, R., Riviere, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basic+principles+of+chimeric+antigen+receptor+design%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">The basic principles of chimeric antigen receptor design.</a> Cancer Discovery. 3 (4), 388-398 (2013).</li>
<li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tisagenlecleucel+in+children+and+young+adults+with+B-cell+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tisagenlecleucel in children and young adults with B-cell lymphoblastic leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).</li>
<li>Wagner, J., Wickman, E., DeRenzo, C., Gottschalk, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR+T+cell+therapy+for+solid+tumors%3A+Bright+future+or+dark+reality%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">CAR T cell therapy for solid tumors: Bright future or dark reality.</a> Molecular Therapy. 28 (11), 2320-2339 (2020).</li>
<li>Vitanza, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locoregional+infusion+of+HER2-specific+CAR+T+cells+in+children+and+young+adults+with+recurrent+or+refractory+CNS+tumors%3A+an+interim+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Locoregional infusion of HER2-specific CAR T cells in children and young adults with recurrent or refractory CNS tumors: an interim analysis.</a> Nature Medicine. 27 (9), 1544-1552 (2021).</li>
<li>Majzner, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GD2-CAR+T+cell+therapy+for+H3K27M-mutated+diffuse+midline+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">GD2-CAR T cell therapy for H3K27M-mutated diffuse midline gliomas.</a> Nature. 603 (7903), 934-941 (2022).</li>
<li>Vitanza, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraventricular+B7-H3+CAR+T+cells+for+diffuse+intrinsic+pontine+glioma%3A+preliminary+first-in-human+bioactivity+and+safety%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Intraventricular B7-H3 CAR T cells for diffuse intrinsic pontine glioma: preliminary first-in-human bioactivity and safety.</a> Cancer Discovery. 13 (1), 114-131 (2023).</li>
<li>Theruvath, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locoregionally+administered+B7-H3-targeted+CAR+T+cells+for+treatment+of+atypical+teratoid%2Frhabdoid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Locoregionally administered B7-H3-targeted CAR T cells for treatment of atypical teratoid/rhabdoid tumors.</a> Nature Medicine. 26 (5), 712-719 (2020).</li>
<li>Donovan, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locoregional+delivery+of+CAR+T+cells+to+the+cerebrospinal+fluid+for+treatment+of+metastatic+medulloblastoma+and+ependymoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Locoregional delivery of CAR T cells to the cerebrospinal fluid for treatment of metastatic medulloblastoma and ependymoma.</a> Nature Medicine. 26 (5), 720-731 (2020).</li>
<li>Brown, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regression+of+glioblastoma+after+chimeric+antigen+receptor+T-Cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Regression of glioblastoma after chimeric antigen receptor T-Cell therapy.</a> The New England Journal of Medicine. 375 (26), 2561-2569 (2016).</li>
<li>Bourne, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracerebral+microdialysis%3A+30+years+as+a+tool+for+the+neuroscientist%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Pharmacology+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">Intracerebral microdialysis: 30 years as a tool for the neuroscientist.</a> Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 30 (1-2), 16-24 (2003).</li>
<li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatically+detecting+bregma+and+lambda+points+in+rodent+skull+anatomy+images%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Automatically detecting bregma and lambda points in rodent skull anatomy images.</a> PLoS One. 15 (12), 0244378(2020).</li>
<li>Foster, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+GPC2-directed+chimeric+antigen+receptors+using+mRNA+for+pediatric+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+Immunotherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Development of GPC2-directed chimeric antigen receptors using mRNA for pediatric brain tumors.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 10 (9), 004450(2022).</li>
<li>Akhavan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cells+for+brain+tumors%3A+Lessons+learned+and+road+ahead%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">T cells for brain tumors: Lessons learned and road ahead.</a> Immunological Reviews. 290 (1), 60-84 (2019).</li>
</ol>

JBF detiene un brevetto relativo alle immunoterapie dirette al glipicano 2 (GPC2). Tutti gli altri autori non hanno nulla da rivelare.

La terapia con cellule T CAR ha rivoluzionato il trattamento dei tumori ematologici e mostra un valore promettente nel trattamento dei tumori cerebrali solidi 6,7,8. Questo protocollo è stato progettato per consentire la valutazione preclinica della somministrazione locoregionale di cellule T CAR per il trattamento dei tumori pediatrici del SNC. Il sistema cannula replica un serbatoio Ommaya o Rickham, un sistema di catetere intraventricolare attualmente utilizzato negli studi clinici in corso sulla terapia con cellule T CAR nei tumori pediatrici del SNC 6,7,8, sottolineando la rilevanza e il potenziale traslazionale di questi metodi. Questo sistema consente la somministrazione ripetuta di cellule T CAR che bypassano la barriera emato-encefalica, ancora una volta simile ai metodi impiegati negli studi clinici in corso. Il parto locoregionale può fornire la massima efficacia nel CNS9 e può anche ridurre il rischio di tossicità sistemiche associate al traffico dalla circolazione15. Mentre la somministrazione stereotassica può fornire una singola dose nel SNC, il vantaggio di questo sistema è l'opportunità di fornire più dosi ripetute in una posizione specifica nel SNC senza la necessità di più interventi chirurgici. Le limitazioni di questa procedura includono un sito di consegna fisso senza la possibilità di cambiare posizione o apportare modifiche una volta che la cannula è in posizione e il potenziale di rimozione della cannula.
Un passaggio critico in questo protocollo è l'impianto della cannula guida fissa a una coordinata D/V che prende in considerazione la proiezione delle cannule di trattamento. La cannula di trattamento sporgerà oltre la punta della cannula guida, quindi è necessario prestare attenzione per garantire che il posizionamento comporti la consegna di cellule T CAR nella regione di interesse. Le lunghezze di proiezione della cannula di trattamento possono essere personalizzate e, nell'esperienza dell'autore, 0,5 mm è una lunghezza di proiezione utile. Questa lunghezza garantisce che il terapeutico non rimanga nella cannula guida al momento dell'erogazione, ma non richiede nemmeno un aggiustamento significativo delle coordinate D/V per la cannula guida alla regione di interesse. Un ulteriore passo importante in questo protocollo è il tempo in cui la cannula di trattamento viene lasciata in posizione dopo l'infusione di cellule T CAR. La cannula di trattamento deve essere tenuta in posizione per almeno 1 minuto dopo la fine dell'infusione, per evitare perdite e la perdita della somministrazione locoregionale della terapia con cellule T CAR.
La risoluzione di questo metodo è semplice, con la maggior parte delle complicazioni che coinvolgono difficoltà a rimuovere la cannula fittizia o inserire la cannula di trattamento nella cannula guida fissa, probabilmente a causa del sangue secco all'interno della cannula guida. Questo può essere facilmente risolto facendo passare delicatamente la cannula fittizia attraverso la cannula di guida fino a quando non c'è meno resistenza e i detriti sono stati rimossi. La resina acrilica può occasionalmente staccarsi dal cranio, con conseguente perdita del sistema della cannula. Nella nostra esperienza, questo è generalmente limitato dalla marcatura del cranio con un bisturi e dal posizionamento di due viti. Inoltre, vengono rimossi tutti gli oggetti della gabbia che potrebbero accidentalmente applicare forza alla cannula mentre il mouse si muove, come particolari capanne di arricchimento del topo con piccole aperture.
In conclusione, qui descritto è un protocollo per l'inserimento di un sistema cannula in modelli murini di tumori del SNC per la consegna ripetuta di cellule T CAR. Il posizionamento della cannula può essere regolato su più punti di consegna locoregionali, testando l'efficacia di diversi siti di consegna. Inoltre, questo sistema può essere utilizzato per ulteriori terapie oltre le cellule T CAR per valutare l'efficacia quando si aggira la barriera emato-encefalica e può anche essere utile per la valutazione delle terapie in modelli murini di disturbi non oncologici.

Nonostante i miglioramenti nella chemioterapia, nella radioterapia e nella chirurgia, i tumori del sistema nervoso centrale (SNC) sono i tumori maligni più mortali in pediatria1, sottolineando un'importante necessità di nuovi approcci con risultati più efficaci. Con progressi significativi nel campo dell'immunoterapia, gli approcci di terapia cellulare adottiva (ACT) hanno mostrato risultati promettenti in vari tipi di cancro, in particolare neoplasie ematologiche2. La terapia con cellule T del recettore dell'antigene chimerico (CAR), un tipo specifico di ACT, sfrutta la naturale capacità del sistema immunitario di riconoscere e uccidere le cellule dannose reindirizzando la specificità delle cellule T per generare cellule T mirate al tumore3. La terapia con cellule T CAR ha dimostrato un notevole successo nel trattamento delle leucemie e dei linfomi4, rendendola un approccio immunoterapeutico promettente e incoraggiando la sua indagine nei tumori solidi. Tuttavia, finora, la terapia con cellule T CAR nei tumori solidi ha ottenuto scarso successo clinico e deve affrontare molte sfide, come la penetrazione tumorale inefficiente, gli antigeni bersaglio limitati e il microambiente tumorale soppressivo5.
Recenti studi clinici hanno iniziato a valutare la terapia con cellule T CAR per i tumori pediatrici del SNC, fornendo prove di concetto e prove precoci dell'attività delle cellule T nei rapporti preliminari 6,7,8. Mentre la maggior parte dei dati preclinici iniziali si concentrava sulla somministrazione endovenosa delle cellule T CAR, recenti evidenze precliniche hanno suggerito la superiorità della somministrazione locoregionale nel SNC9,10, che è stata utilizzata con successo anche in diversi studi clinici 6,7,8,11 . Gli studi preclinici fino ad oggi che hanno incorporato la somministrazione locoregionale di cellule T CAR nel SNC si sono basati su una singola dose intracranica di cellule T CAR somministrate stereotassicamente 9,10. Tuttavia, gli studi clinici sull'uomo hanno richiesto infusioni ripetute di cellule T CAR nel SNC 6,7,8,11, sottolineando la necessità di valutare più infusioni ripetute nello sviluppo preclinico. L'obiettivo di questa procedura è testare con successo le infusioni seriali di cellule T CAR utilizzando un catetere in modelli murini ortotopici di tumori cerebrali pediatrici. Il vantaggio di questa tecnica è l'evitare più procedure chirurgiche per fornire ripetuti trattamenti intra-SNC. Le cannule sono state utilizzate principalmente per il campionamento in microdialisi dei neurotrasmettitori e la somministrazione di sostanze neuroattive nelle neuroscienze e nella ricerca comportamentale nei roditori12, con segnalazioni limitate del loro uso per la somministrazione di terapie antitumorali. Basandosi sui rapporti precedenti, questo protocollo utilizza un sistema di cannule a permanenza stereotassicamente posizionato per fornire cellule T CAR in modelli murini xenograft di tumori del SNC. Il protocollo può essere utilizzato per testare terapie aggiuntive in modelli murini di disturbi neurologici o neuro-oncologici e può essere utile per testare nuove terapie in cui bypassare la barriera emato-encefalica è fondamentale per l'efficacia.

<table><tbody><tr><td>Aghi da 18 G</td><td>BD</td><td>511097</td><td>mozzo in metallo da 1 1/2 pollice</td></tr><tr><td>Resina acrilica liquida</td><td>Lang Dental&nbsp;</td><td>B1323&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Polvere di resina acrilica</td><td>Lang Dental&nbsp;</td><td>B1323&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Salviette imbevute di alcol</td><td>BD</td><td>326895</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5240</td><td>Eppendorf</td><td>5420000040</td><td>Centrifuge&nbsp;</td></tr><tr><td>Tamponi in cotone con punta</td><td>Puritan</td><td>826-WC</td><td>Larghezza manico = 2,11 mm (0,083), Larghezza testa = 1,27 mm (0,050), Lunghezza manico = 147,62 mm (5,812), Lunghezza totale = 152,4 mm (6), Lunghezza testa = 12,7 mm (0,500)</td></tr><tr><td>Portapunte da trapano&nbsp;</td><td>Tecnologie P1&nbsp;</td><td>DH-1&nbsp;</td><td>Portapunte per D56-D70&nbsp;</td></tr><tr><td>Punta da trapano&nbsp;</td><td>Tecnologie P1&nbsp;</td><td>D58&nbsp;</td><td>1,07 millimetri</td></tr><tr><td>Cannula fittizia&nbsp;</td><td>Tecnologie P1&nbsp;</td><td>C315DCS-5/SPC&nbsp;</td><td>Configurazione: Piccolo maiuscoletto; &nbsp; Lunghezza: Taglio 5,00 mm sotto il piedistallo; Proiezione: 0,50 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>Cacciavite a punta piatta&nbsp;</td><td>Tecnologie P1&nbsp;</td><td>SD-80&nbsp;</td><td>Cacciavite&nbsp;</td></tr><tr><td>Graefe forcipe</td><td>Fine Science Tools</td><td>11051-10</td><td>pinza</td></tr><tr><td>guida cannula&nbsp;</td><td>Tecnologie P1&nbsp;</td><td>C315GS-5/SPC&nbsp;</td><td>Configurazione: altezza piedistallo 5,00 mm; Lunghezza: Taglio 5,00 mm sotto il piedistallo&nbsp;</td></tr><tr><td>Pellet di cotone emostatico con adrenalina racemica&nbsp;</td><td>Pascal</td><td>1151602&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kit contatore di celle automatizzato MOXI Z Mini</td><td>Moxi</td><td>MXZ001</td><td>Contatore di celle</td></tr><tr><td>NOD&nbsp; scid&nbsp; gamma (NSG) topi</td><td>Jackson Laboratory</td><td>5557</td><td>maschi e femmine di età compresa tra 6 e 12 settimane Pipetta</td></tr><tr><td>Pasteur</td><td>VWR</td><td>14673-043</td><td></td></tr><tr><td>Tubo PKG&nbsp;</td><td>Tecnologie P1&nbsp;</td><td>C313CT&nbsp;</td><td>Diametro: 0,58 mm x 1,27 mm</td></tr><tr><td>Piastra in porcellana a 12 pozzetti</td><td>Flinn Scientific</td><td>AP6064&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Iodio povidone</td><td>Medline</td><td>MDS093943</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>World Precision Instrument</td><td>50-822-457</td><td>Bisturi monouso, n. 10, sterile, 10/scatola, manico in plastica con viti per righello da 6 pollici</td></tr><tr><td>...</td><td>Tecnologie P1&nbsp;</td><td>0-80 X 3/32&nbsp;</td><td>2,4 millimetri &nbsp;</td></tr><tr><td>Cornice stereotassica&nbsp;</td><td>David Kopf Strumenti&nbsp;</td><td>940&nbsp;</td><td>Modello 940 Strumento stereotassico per piccoli animali con console di visualizzazione digitale.</td></tr><tr><td>Forbici fini per studenti</td><td>Strumenti di scienze fini</td><td>91460-12</td><td></td></tr><tr><td>Cannula per il trattamento delle forbici&nbsp;</td><td>Tecnologie P1&nbsp;</td><td>C315IS-5/SPC&nbsp;</td><td>33GA; &nbsp; Configurazione: Interno standard; Lunghezza: Taglio 5,00 mm sotto il piedistallo; Proiezione: 0,50 mm&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Siringhe per il trattamento&nbsp;</td><td>Hamilton</td><td>87908</td><td>5 &; L, siringa speciale con ago cementato (SN) modello 75, 75SN/22/0,5"/PT3&nbsp;</td></tr><tr><td>Vactrap XL&nbsp;</td><td>Sistema per vuoto</td> <td>Foxx Life Sciences</td><td>305-4401-FLS</td></tr></tbody></table>

impianto di cannula intracranica per infusioni seriali di cellule t del recettore dell'antigene chimerico locoregionale (car) nei topi

Intracranial Cannula Implantation for Serial Locoregional Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cell Infusions in Mice

I tumori pediatrici del SNC sono responsabili della maggior parte dei decessi correlati al cancro nei bambini e hanno prognosi infauste, nonostante i progressi nella chemioterapia e nella radioterapia. Poiché molti tumori mancano di trattamenti efficaci, vi è una necessità cruciale di sviluppare opzioni terapeutiche più promettenti, come le immunoterapie; l'uso della terapia con cellule T del recettore dell'antigene chimerico (CAR) diretta contro i tumori del SNC è di particolare interesse. Bersagli della superficie cellulare come B7-H3, IL13RA2 e il disiaaloganglioside GD2 sono altamente espressi sulla superficie di diversi tumori pediatrici e adulti del SNC, aumentando l'opportunità di utilizzare la terapia cellulare T CAR contro questi e altri bersagli di superficie. Per valutare la somministrazione locoregionale ripetuta di cellule T CAR in modelli murini preclinici, è stato istituito un sistema di cateteri a permanenza che ricapitola i cateteri a permanenza attualmente utilizzati negli studi clinici sull'uomo. A differenza della somministrazione stereotassica, il sistema di catetere a permanenza consente dosi ripetute senza l'uso di più interventi chirurgici. Questo protocollo descrive il posizionamento intratumorale di una cannula guida fissa che è stata utilizzata per testare con successo le infusioni seriali di cellule T CAR in modelli murini ortotopici di tumori cerebrali pediatrici. Dopo l'iniezione ortotopica e l'attecchimento delle cellule tumorali nei topi, il posizionamento intratumorale di una cannula guida fissa viene completato su un apparato stereotassico e fissato con viti e resina acrilica. Le cannule di trattamento vengono quindi inserite attraverso la cannula guida fissa per la somministrazione ripetuta di cellule T CAR. Il posizionamento stereotassico della cannula guida può essere regolato per fornire cellule T CAR direttamente nel ventricolo laterale o in altre posizioni nel cervello. Questa piattaforma offre un meccanismo affidabile per la sperimentazione preclinica di infusioni intracraniche ripetute di cellule T CAR e altre nuove terapie per questi devastanti tumori pediatrici.

Impianto riuscito della cannula nel SNC del topo I topi con incannulamento riuscito hanno una cannula guida sicura in posizione, che non interferisce con le attività della vita quotidiana (Figura 2A) e che può facilmente passare una cannula di trattamento e fornire fluido senza resistenza (Figura 2B). Nella nostra esperienza, la maggior parte delle cannule rimane in posizione per oltre 4 settimane, anche se lo 0-25% può essere rimosso nel tempo. La verifica del corretto posizionamento può essere confermata con il colorante blu Evans iniettato nella cannula. Ad esempio, una cannula inserita nel ventricolo laterale mostra il colorante blu di Evans in tutto il sistema ventricolare mentre viaggia attraverso il liquido spinale cerebrale, confermando il corretto posizionamento (Figura 2C). Le cannule inserite nel tumore mostrano il colorante blu di Evans nel sito di impianto del tumore.
Consegna efficace delle cellule T CAR nel SNC per il trattamento dei tumori dello xenotrapianto. L'efficacia del sistema di cannule intracranica e l'efficacia terapeutica delle cellule T CAR nei modelli murini possono essere misurate attraverso una varietà di meccanismi, tra cui l'imaging bioluminescente e la sopravvivenza globale. Le cellule T CAR dirette a GPC2 sono state testate contro il medulloblastoma murino e i modelli di glioma diffuso della linea mediana, rispettivamente 7316-4509 e 7316-3058, utilizzando il dosaggio ripetuto delle cellule T CAR tramite il sistema di cannule intracranica dichiarato14. Il posizionamento e l'attecchimento ortotopico del tumore sono stati confermati dall'imaging bioluminescente e le cannule sono state posizionate nel letto tumorale utilizzando le stesse coordinate del posizionamento ortotopico del tumore. I trattamenti consistevano in infusioni di cellule T GPC2 CAR da una a due volte alla settimana per 2-4 settimane, per un totale di quattro o sei dosi. Dopo il trattamento, la terapia con cellule T CAR diretta da GPC2 ha indotto una significativa regressione tumorale nel modello di medulloblastoma 7316-4509 (p &lt; 0.01) (Figura 3A) e una sopravvivenza significativamente prolungata nel glioma talamico diffuso della linea mediana 7316-3058 (p &lt; 0.05) (Figura 3B)14.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64886/64886fig01.jpg"> Figura 1: Cannula guida con manichino di proiezione e cannule di trattamento. (A) Cannula guida con cannule fittizie di proiezione di 0,5 mm e cannule fittizie di proiezione di 2 mm. (B) Cannula guida con cannule di sporgenza di 0,5 mm e di trattamento di proiezione di 2 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64886/64886fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64886/64886fig02.jpg"> Figura 2: Sistema di somministrazione di cannule di trattamento per dosi ripetute di cellule T CAR . (A) Cannula impiantata in un cranio di topo con un cappuccio in posizione quando non in uso. (B) Infusione di cellule T CAR in un tumore pontino attraverso la cannula di trattamento mentre il topo è sotto anestesia. (C) Verifica del posizionamento della cannula nel ventricolo laterale utilizzando il colorante blu di Evans. Il colorante è stato inserito attraverso la cannula, seguito da eutanasia ed escissione cerebrale, con colorante presente in tutti i ventricoli. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64886/64886fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64886/64886fig03.jpg"> Figura 3: Le cellule T CAR dirette a GPC2 mediano le risposte antitumorali e prolungano la sopravvivenza nei tumori cerebrali pediatrici in vivo. (A) Quantificazione della bioluminescenza dello xenotrapianto ortotopico di medulloblastoma del gruppo 4 7316-4509 trattato con cellule T mRNA CAR dirette a GPC2 o CD19. Le dosi sono indicate da frecce sul grafico. Dati visualizzati come media con SD, n = 9-11 topi per braccio. (B) Sopravvivenza globale di topi impiantati con xenotrapianto di DMG talamico 7316-3058 trattati con sei dosi ripetute di 2 x 106 cellule T CAR. Le dosi sono indicate da frecce sul grafico. n = 7 topi per braccio. **p &lt; 0,01; *p &lt; 0,05; ns = non significativo. Questa figura è stata riprodotta con il permesso di Foster et al.14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64886/64886fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>

I tumori del sistema nervoso centrale (SNC) sono la principale causa di morte correlata al cancro nei bambini e le terapie locoregionali a base immunitaria vengono sempre più testate per i pazienti negli studi clinici. Questo protocollo descrive i metodi per l'impianto di cannule locoregionali nei topi per la valutazione preclinica di infusioni immunoterapeutiche mirate ai tumori del SNC.

Impianto di cannula intracranica per infusioni seriali di cellule T del recettore dell'antigene chimerico locoregionale (CAR) nei topi

Pediatric CNS tumors are responsible for the majority of cancer-related deaths in children and have poor prognoses, despite advancements in chemotherapy ...

Questo protocollo replica un sistema di catetere intraventricolare utilizzato negli studi clinici in corso per testare la somministrazione regionale locale della terapia con cellule T CAR diretta contro i tumori del sistema nervoso centrale. Il vantaggio principale di questa tecnica è la capacità di fornire dosi multiple ripetute di terapia regionale locale con cellule T CAR senza eseguire più procedure chirurgiche invasive. Questo sistema potrebbe essere utilizzato per studiare diverse terapie in diversi siti di consegna, e quindi potrebbe fornire informazioni su una miriade di aree di ricerca nelle neuroscienze.Per iniziare, posizionare il topo anestetizzato con la testa rasata sul tavolo operatorio e aprire delicatamente la parte inferiore del braccio stereotassico usando una spatola. Inserire la cannula con una pinza e fissarla stringendo la vite sul braccio fino a quando da metà a due terzi della porzione di plastica bianca e cinque millimetri della cannula sporgono dal fondo dell'apertura. Inserire e fissare i denti superiori del mouse nella barra del morso dell'apparato stereotassico.Tirare il cono del naso in avanti e stringerlo, assicurandosi che il topo inali isoflurano. Quindi, montare il mouse sull'apparecchio stereotassico riscaldato utilizzando polsini auricolari o barre auricolari, evitando una pressione eccessiva. Disinfettare il sito chirurgico e fare un taglio parallelo al cranio come descritto nel manoscritto.Utilizzare tamponi di punta di cotone per spingere via la fascia. Identificare i punti di riferimento, bregma e lambda sul cranio corrispondenti ai segni anteriori e posteriori in cui si incontrano le placche craniche. Per creare una superficie per attaccare l'acrilico, fare delicatamente diverse fessure sul cranio usando un bisturi.Utilizzando il braccio stereotassico, localizzare la cannula nel punto di interesse. Sollevare la punta della cannula da uno a due millimetri sopra la superficie del cranio e spostarsi alle coordinate desiderate. Utilizzando un ago calibro 18 o un trapano chirurgico, praticare due fori per viti sul cranio esposto lontano da dove entra la cannula, garantendo spazio sufficiente per la cannula.Ruotare il trapano attraverso il foro della vite fino a quando non si attacca al cranio. Con un cacciavite a punta piatta, inserire e fissare due viti nei fori. Quindi, tirare delicatamente la vite verso l'alto per assicurarsi che sia fissata.Per inserire una cannula, creare un foro nel cranio alle coordinate identificate utilizzando un ago calibro 18 o un trapano chirurgico. Utilizzando il braccio stereotassico, abbassare la cannula alla coordinata DV desiderata. A circa 0,3 grammi di polvere di resina acrilica e da 10 a 15 gocce di liquido in una piastra di porcellana a 12 pozzetti, caricare il materiale viscoso di colore bianco preparato in una siringa da un millilitro.Rivestire il cranio e riempire gli spazi intorno alla cannula e alla vite. Allentare la vite sul braccio stereotassico mentre il cemento è flessibile. Utilizzare delicatamente una spatola per rilasciare la cannula dal supporto all'apertura inferiore e ritrarre il braccio stereotassico lontano dal mouse.Una volta asciugato il cemento, inserire la cannula fittizia nella cannula di guida e ruotare in senso orario per fissarla saldamente. Una volta completata la procedura, riportare il mouse nella sua gabbia domestica riscaldata per il recupero. Per preparare la cannula di trattamento, inserire la sua parte superiore nel tubo PKG.Quindi, riempire la siringa di trattamento con sospensione di cellule T CAR e inserirla attraverso l'altra estremità del tubo PKG, coprendo la parte superiore della cannula di trattamento. Dopo aver anestetizzato il mouse, fissare la cannula guida alla base usando una pinza. Svitare e rimuovere la cannula fittizia, consentendo l'accesso alla cannula guida.Infondere le cellule T CAR per un minuto e tenere la cannula di trattamento in posizione per un ulteriore minuto. Dopo aver rimosso la cannula di trattamento, riavvitare saldamente una cannula fittizia. Quindi, somministrare meloxicam per via sottocutanea per il controllo del dolore.La terapia con cellule T CAR diretta da GPC2 ha indotto una significativa regressione tumorale nel medulloblastoma e una sopravvivenza significativamente prolungata nel modello di glioma talamico diffuso della linea mediana. Quando si inserisce la cannula guida in una posizione intratumorale, è importante capire che le coordinate dorsale-ventrale possono essere più superficiali dell'iniezione tumorale per tenere conto delle lunghezze di proiezione della cannula fittizia e del trattamento.

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Questo video presenta una procedura per l'impianto di cannula intracranica in un modello murino di tumore cerebrale, per facilitare la somministrazione di un agente immunoterapeutico. La somministrazione di cellule T del recettore dell'antigene chimerico specifico per glipicano-2 nel microambiente tumorale innesca l'attivazione delle cellule T, con conseguente lisi tumorale e regressione del tumore.

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Gli effetti linfodepletivi e immunomodulatori della chemioterapia e dello standard di cura delle radiazioni possono essere sfruttati per migliorare l'efficacia antitumorale dell'immunoterapia con cellule T. Descriviamo un metodo per generare cellule T del recettore chimerico dell'antigene (CAR) specifiche per EGFRvIII e somministrarle nel contesto dello standard di cura del glioblastoma.

Generazione di cellule CAR T per adottiva terapia nel contesto di Glioblastoma standard di cura

Cervello metastasi è diventato un bisogno medico non soddisfatto urgente come la sua incidenza è aumentata mentre le opzioni terapeutiche sono rimaste palliative. La creazione di modelli animali sperimentali di metastasi cerebrali tramite iniezione arteriosa intracarotidea delle cellule tumorali facilita gli studi meccanicistici della biologia della malattia e la valutazione dei regimi di intervento innovative.

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Qui, presentiamo un protocollo per la preparazione e la somministrazione stereotassica di linfociti umani allogenici in topi immunodeficienti portatori di tumori cerebrali primari umano ortotopico. Questo studio fornisce un proof-of-concept per sia la fattibilità e l'efficacia antitumorale di immunoterapie cellulari intrabrain-consegnato.

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Questo protocollo semplifica la produzione di vettori retrovirali e la trasduzione delle cellule T murine, facilitando la generazione efficiente di cellule CAR-T di topo.

Generazione efficiente di cellule T del recettore chimerico murino dell'antigene (CAR)-T

La riparazione dell'arteria intracarotide in un modello murino dopo l'iniezione restituisce il flusso sanguigno all'arteria senza influire negativamente sulla distribuzione del materiale iniettato. La riparazione del sito di iniezione facilita le iniezioni successive attraverso la stessa arteria e previene l'ischemia cerebrale nei ceppi di topo privi di un Circle of Willis completo.

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L'obiettivo di questo protocollo è fornire ai ricercatori una tecnica altamente riproducibile per le impianti intracraniche.

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Scopri l'impianto di cannula intracranica per infusioni seriali di cellule CAR-T locoregionali nei topi. Questo metodo consente somministrazioni ripetute senza chirurgie invasive multiple, migliorando lo studio dei tumori del sistema nervoso centrale.

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