Name: Valutazione in vitro e in vivo di composti biologicamente attivi fotocontrollati - potenziali farmaci candidati per la fotofarmacologia del cancro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-29T13:10:00.000+00:00
Duration: 13 min 17 s
Description: Scopri come valutare peptidi antitumorali fotocommutabili con saggi di citotossicità in colture 2D e 3D, fotoisomerizzazione e modelli in vivo. Questo protocollo facilita la ricerca preclinica in fotofarmacologia.

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Gli autori riconoscono il finanziamento dell'UE da parte del programma H2020-MSCA-RISE attraverso i progetti PELICO (#690973) e ALISE (#101007256). Questo lavoro è stato supportato dal DFG-GRK 2039 (SA, TS e ASU), dal programma NACIP della Helmholtz Society (SA e ASU) e dal VIP + del BMBF (OB e ASU). Riconosciamo il Dr. Serhii Koniev, Karlsruhe Institute of Technology, che ha sintetizzato il composto LMB002, lo ha purificato e ha gentilmente fornito il composto per lo studio. Gli autori sono anche grati a Chupryna Maksym che ha filmato e compilato il video in Ucraina, e a tutti i coraggiosi difensori dell'Ucraina che hanno reso possibile il lavoro sperimentale, la scrittura e le riprese di questa pubblicazione.

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</ol>

IVK, OB, SA e ASU sono inventori della famiglia di brevetti rilasciata: "Peptidomimetici che possiedono attività biologica fotocontrollata" (WO2014127919 [A1], EP2958934 [B1], US9481712 [B2], UA113685 [C2]) concessi in licenza a Lumobiotics GmbH. IVK, OB, TS e SA sono fondatori e azionisti di Lumobiotics GmbH. IVK è un consulente scientifico, HK, TM, IP e PB sono dipendenti di Enamine LLC. Gli autori non hanno altre affiliazioni rilevanti o coinvolgimento finanziario con qualsiasi organizzazione o entità con un interesse finanziario o un conflitto finanziario con l'argomento o i materiali discussi nella pubblicazione oltre a quelli divulgati.

I composti fotocontrollati sono senza precedenti nello sviluppo di farmaci; tuttavia, non sono stati stabiliti metodi per la loro valutazione preclinica e clinica. L'analogo monoterapia più vicino, la terapia fotodinamica (PDT), è la modalità di trattamento per uso clinico adottata da molti paesi contro il cancro ed è in fase di sviluppo per altre indicazioni19,20. Analogamente alla fotofarmacologia, anche la PDT si basa sull'uso della luce per attivare la sostanza bioattiva (ossigeno singoletto). Pertanto, alcuni metodi sperimentali utilizzati per studi preclinici e clinici in PDT possono essere adottati per la fotofarmacologia. Ad esempio, le sorgenti luminose, gli approcci di erogazione della luce e i dispositivi medici sono ben sviluppati e approvati per la PDT; Possono essere utilizzati direttamente per la valutazione di farmaci fotocontrollati. Tuttavia, PDT e fotofarmacologia hanno molte distinzioni l'una dall'altra4, il che giustifica la necessità di stabilire metodi specifici per quest'ultima.
In primo luogo, la sostanza non attivata nella PDT (ossigeno) è sempre presente nei tessuti viventi a concentrazioni non tossiche. Al contrario, i composti biologicamente attivi fotocontrollati non attivati possono avere attività residua e tossicità indesiderata. Pertanto, i farmaci fotofarmacologici ideali dovrebbero aver minimizzato l'attività biologica nella loro forma somministrata e devono essere altamente attivi nella loro forma generata dalla luce, la "finestra fototerapeutica"21 deve essere la più ampia possibile. Trovare il colpo ed eseguire l'ottimizzazione hit-to-lead richiede l'identificazione di composti adatti e lo screening di librerie relativamente grandi, già nelle prime fasi dello sviluppo del farmaco. Qui, abbiamo proposto una microscopia fluorescente confocale automatizzata ad alta produttività per identificare composti fotocommutatori efficienti.
Il metodo scelto per la valutazione della citotossicità consente una facile implementazione del requisito più critico: mantenimento del PSS o stabilità del fotoisomero sensibile alla luce visibile. Questo perché, al momento della sua implementazione, l'esposizione alla luce è ridotta al minimo. Quindi, se si selezionano metodi alternativi, dovrebbero essere preferiti quelli automatizzati. Questo approccio è affidabile e informativo. L'uso di colture cellulari 3D (sferoidi) in questa fase fornisce una comprensione olistica della risposta della cellula al trattamento in un microambiente simile a un tessuto più realistico. Inoltre, è possibile ottenere preziose informazioni sul meccanismo d'azione dei composti utilizzando la microscopia come metodo diretto. La microscopia fluorescente confocale con adeguato protocollo di colorazione consente la valutazione visiva della morfologia delle cellule e degli sferoidi; È inoltre possibile rilevare dettagli importanti sulla morte cellulare e sui cambiamenti all'interno delle cellule.
In secondo luogo, l'applicazione leggera richiede un'attenta scelta del dosaggio della luce. Nella PDT, il sovradosaggio leggero è estremamente dannoso per i tessuti22. La terapia fotofarmacologica può essere vantaggiosa in caso di irradiazione luminosa eccessiva. Il limite superiore della sostanza attivata è definito dalla dose somministrata della sostanza non attivata e dalla sua farmacocinetica. Tuttavia, il dosaggio leggero è ancora un problema in fotofarmacologia. Si deve prestare attenzione affinché la densità di potenza irradiante e il tempo di esposizione non siano inferiori ai requisiti per la terapia. In linea di principio, la generazione della sostanza attivata può essere monitorata in vivo. Tuttavia, per ragioni bioetiche, abbiamo proposto un esperimento con un tessuto modello (carne macinata fresca) mescolato con il composto non attivato15. Questo esperimento è semplice e può essere modificato per utilizzare diverse fonti di luce. Può anche essere adattato per la stima fotofisica del dosaggio della luce e la misurazione delle influenze termiche. Anche in questo caso, utilizzando tessuti modello, l'esposizione alla luce è possibile minimizzare, rispetto, ad esempio, alla più accurata determinazione dell'efficienza di fotocommutazione nelle condizioni in vivo , un'alternativa che può essere sempre interessante da considerare.
Infine, i composti che dimostrano caratteristiche superiori negli schermi di tossicità in vitro e sono efficientemente fotocommutati ad almeno 1-1,5 cm di profondità nel tessuto modello possono essere selezionati per studi in vivo costosi, laboriosi e lunghi. In questo protocollo, abbiamo utilizzato la stessa linea cellulare (LLC) della valutazione in vitro per generare il modello di cancro allotrapianto. La dinamica di crescita del tumore, la mortalità e la conta delle metastasi sono i parametri più adatti per valutare l'efficacia antitumorale. Rispetto alla chemioterapia convenzionale, un fattore aggiuntivo viene applicato nel trattamento fotofarmacologico: la luce. Pertanto, sono necessari due gruppi di animali di controllo: uno che riceve solo il veicolo e l'altro che riceve il veicolo e l'irradiazione. Questa configurazione consente di valutare l'impatto della luce sui parametri misurati. Nel nostro esperimento, gli animali dei due gruppi sperimentali hanno ricevuto il composto non attivato e i tumori dei topi in un gruppo sono stati irradiati. Il regime di irradiazione era identico per i gruppi di controllo e di trattamento. Il confronto con la chemioterapia di riferimento non è necessario in questa fase perché lo scopo principale dell'esperimento è dimostrare l'effetto combinato dell'applicazione leggera e composta. I composti più performanti che presentano questo effetto possono quindi essere selezionati per ulteriori studi sulla loro tossicità in vivo e confronto con parametri di riferimento per prendere importanti decisioni go-no-go sul loro sviluppo. Tecnicamente, l'esperimento in vivo che descriviamo può essere facilmente adattato a studi di farmacocinetica o farmacodinamica, ad esempio, di un composto che è già selezionato come farmaco principale.

I composti biologicamente attivi fotocontrollati sono emersi negli ultimi decenni come componente promettente delle chemioterapie sicure per le malattie umane e per sradicare specificamente i tumori solidi maligni1. Questi composti contengono frammenti reversibilmente fotoisomerizzabili (fotointerruttori molecolari) e possono alternare tra fotoisomeri inattivi e attivi dopo irradiazione con luce di diverse lunghezze d'onda.
Rispetto ai loro analoghi non fotocontrollabili, i farmaci fotocontrollati possono essere più sicuri perché possono essere introdotti sistemicamente nel corpo del paziente in forme meno attive ed essenzialmente non tossiche, e sono quindi attivati dalla luce solo dove necessario, come nei tumori, nelle ulcere e nelle ferite. Sebbene molteplici dimostrazioni entusiasmanti di tali prototipi di farmaci molecolari possano essere trovate in recenti articoli accademici 2,3,4,5,6,7, il campo della fotofarmacologia clinica - un'applicazione di combinazioni di farmaci / dispositivi medici / malattie approvate - non esiste. La fotofarmacologia è ancora in fase di scoperta di farmaci e gli studi preclinici sistematici sono sconosciuti.
Solo recentemente abbiamo dimostrato il vantaggio di sicurezza in vivo per alcuni peptidi antitumorali fotocontrollati, vale a dire, gli analoghi del peptide antibiotico gramicidina S8. Questi derivati fotocontrollati contengono un fotointerruttore diariletene (DAE), che subisce trasformazioni fotoindotte reversibili tra le cosiddette fotoforme "anulari" generate dalla luce rossa e "ad anello" generate dai raggi UV (illustrate nella Figura 1 per uno dei derivati, composto LMB002).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig01.jpg"> Figura 1: Peptide citotossico fotocontrollato LMB002 e sua fotoisomerizzazione. Il frammento di diariletene è mostrato in rosso. Abbreviazione: DAE = diariletene. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
Trovare hit ed eseguire l'ottimizzazione hit-to-lead spesso richiede lo screening in vitro e in vivo di librerie di composti appropriate 9,10. Qui, dimostriamo una metodologia adatta per lo screening sistematico ad alto rendimento della citotossicità di composti fotocontrollati. Determiniamo anche l'efficienza della fotoisomerizzazione, stimiamo la dose di luce nei tessuti modello e valutiamo l'efficacia in vivo dei candidati con le migliori prestazioni. L'approccio è conforme alle considerazioni di bioetica e cura degli animali.
In questo lavoro, i metodi preclinici tradizionali sono modificati per evitare la fotoisomerizzazione non controllata dei composti testati. L'obiettivo generale dell'applicazione di questi metodi modificati nel presente documento è quello di sviluppare una strategia generale che sia semplice e veloce e produca dati statisticamente significativi per confrontare in modo affidabile le attività in vitro e razionalizzare i test di efficacia in vivo dei composti fotocommutabili per l'identificazione del piombo e l'ulteriore sviluppo.
La strategia consiste in tre fasi consecutive. Il primo passo prevede la determinazione di IC 50 (vitalità cellulare apparente del50 %) in diluizioni seriali per le fotoforme attive e inattive di composti biologicamente attivi fotocontrollati selezionati utilizzando colture cellulari bidimensionali (2D, monostrato) e tridimensionali (3D, sferoidi) e microscopia a fluorescenza confocale ad alta produttività. Le finestre fototerapeutiche vengono confrontate rispetto alla differenza IC50 tra le due fotoforme e vengono selezionati i candidati più performanti. Non vi è alcun vantaggio specifico nella valutazione della tossicità mediante microscopia automatizzata e altre piattaforme di screening della citotossicità (saggi)11; Modelli tumorali più complessi basati su cellule12 potrebbero essere facilmente implementati in questa fase.
Per i composti selezionati nella fase 1, il secondo passo consiste nel stimare realisticamente la loro efficienza di fotocommutazione all'interno dei tessuti in funzione della profondità dalla superficie del tessuto irradiato quantificando l'efficienza di fotocommutazione delle fotoforme meno attive in un surrogato tissutale utilizzando la cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) rilevata dai raggi UV di estratti di campioni irradiati. In vivo , l'efficienza della fotocommutazione potrebbe essere studiata, ma proponiamo di utilizzare un semplice surrogato tissutale: carne di maiale macinata. Abbiamo testato la validità di questo approccio. Abbiamo misurato la conversione dei nostri composti fotocommutabili in vivo su un modello di cancro di topi e osservato approssimativamente la stessa fotoconversione a una profondità misurata in precedenti esperimenti con topi8. È possibile utilizzare qualsiasi tessuto artificiale alternativo adatto13, tessuto / organo biostampato 3D14, materiali bioptici o altro materiale animale esente. Tuttavia, questa configurazione è un buon compromesso in quanto è economica, veloce ed etica.
Il terzo passo è la determinazione dell'efficacia antitumorale in vivo in un modello di cancro murino. I composti che dimostrano caratteristiche superiori negli esperimenti in vitro e la commutazione fotografica efficiente a una profondità di almeno 1-1,5 cm nei tessuti modello sono selezionati per questo esperimento.
Questo protocollo può essere applicato a composti che possiedono diversi tipi di fotointerruttori, a condizione che le loro fotoforme (o i loro stati fotostazionari, PSS) siano stabili per un tempo ragionevole (alcuni giorni o più). A titolo illustrativo, viene utilizzato un LMB002 derivato da DAE descritto in precedenza15. Le fotoforme LMB002 sono termicamente stabili e possono essere conservate a -20 °C per almeno un anno senza degradazione sostanziale. Le cellule del carcinoma polmonare di Lewis (LLC) sono scelte per questa dimostrazione in vitro e in vivo, ma non sono imposte restrizioni sul tipo di cellula. Le cellule LLC sono aderenti, facilmente coltivabili in 3D e utilizzate per generare tumoroidi (come descritto nel riferimento16). In vivo Le cellule LLC sono utilizzate per modellare i processi metastatici e possono facilmente generare tumori solidi in topi immunocompetenti dopo iniezione sottocutanea. Questa metodologia in vivo può essere universalmente applicata ad altri modelli di cancro17,18. L'attuazione dettagliata di questa strategia è descritta di seguito.

<table><tbody><tr><td>Sistema LC capillare Agilent serie 1100</td><td>ALSI-Chrom (distributore Agilent)</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>ATCC CRL-1642, LL/2 (LLC1) Linea cellulare di carcinoma polmonare di Lewis</td><td>ECACC</td><td>90020104</td><td></td></tr><tr><td>Topi C57BL/6NCrl, femmina, consanguinea</td><td>Charles River</td><td>Codice ceppo: 027</td><td></td></tr><tr><td>CelCulture, CO2 incubatore</td><td>Esco Micro</td><td>CCL-170B</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel Matrice della membrana basale</td><td>Merck</td><td>CLS354234</td><td></td></tr><tr><td>Corning, micropiastre sferoidi a 384 pozzetti</td><td>Merck</td><td>CLS3830</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Merck</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>Gibco, DPBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21600044</td><td></td></tr><tr><td>Gramicidina S</td><td>Lumobiotici</td><td></td><td>Sintesi personalizzata</td></tr><tr><td>HyClone, DMEM/alto glucosio</td><td>Cytiva</td><td>SH30003.04</td><td></td></tr><tr><td>IN Cell Analyzer 6500HS, sistema di imaging</td><td>Cytiva</td><td>29240358</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen, Calcein AM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C1430</td><td></td></tr><tr><td>Macchina per anestesia isoflurano</td><td>ASA</td><td>S/N ASA 1305</td><td></td></tr><tr><td>L-glutammina, soluzione 200 mM</td><td>Merck</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>LIKA-chirurgo, laser</td> <td>per chirurgia a diodiFotonika</td><td></td> plus-LMB002 <td></td></tr><tr><td></td><td>Lumobiotics</td><td></td><td>Sintesi personalizzata</td></tr><tr><td>Penicillina&ndash; Streptomicina, stabilizzata in soluzione</td><td>Merck</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>PhenoPlate, piastre a 96 pozzetti</td><td>Fotometro a</td><td>6055302</td><td></td>PerkinElmer</tr><tr><td>PCE-LED 20</td><td>PCE Instruments</td><td>PCE-LED 20</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific, Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific, ioduro di propidio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J66764-MC</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue, soluzione allo 0,4%</td><td>Merck</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina&ndash; EDTA, 10 x soluzione</td><td>Merck</td><td>T4174</td><td></td></tr><tr><td>UltraCruz Fiasche per colture cellulari con tappi ventilati, 75 cm2</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-200263</td><td></td></tr><tr><td>UltraCruz, filtri per flaconi, PES, 0,22 &mu; m</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-360882</td><td></td></tr><tr><td>Vydac 218TP, colonna HPLC C18 (4,6 mm &volte; 250 mm, 5 &; m)</td><td>Altmann Analytik (distributore Avantor)</td><td>GR5103827</td><td></td></tr></tbody></table>

valutazione in vitro e in vivo di composti biologicamente attivi fotocontrollati - potenziali farmaci candidati per la fotofarmacologia del cancro

In Vitro and In Vivo Evaluation of Photocontrolled Biologically Active Compounds - Potential Drug Candidates for Cancer Photopharmacology

I composti fotocontrollati e biologicamente attivi sono una classe emergente di candidati farmaci "intelligenti". Forniscono ulteriore sicurezza nella chemioterapia sistemica grazie alla loro precisa attivazione spaziotemporale dirigendo una luce benigna e non ionizzabile in una posizione specifica all'interno del corpo del paziente. Questo articolo presenta una serie di metodi per valutare la potenza in vitro e l'efficienza ex vivo della fotoattivazione di composti fotocontrollati e biologicamente attivi, nonché l'efficacia in vivo nelle prime fasi dello sviluppo di farmaci. La metodologia viene applicata ai peptidi citotossici antitumorali, vale a dire gli analoghi contenenti diariletene di un noto antibiotico, la gramicidina S. Gli esperimenti vengono eseguiti utilizzando colture cellulari 2D (cellule aderenti) e 3D (sferoidi) di una linea cellulare tumorale (carcinoma polmonare di Lewis, LLC), surrogati di tessuto vivo (carne di maiale macinata) e un modello di cancro allogenico (LLC sottocutaneo) in topi immunocompetenti. La selezione dei composti più efficaci e la stima di finestre fototerapeutiche realistiche vengono eseguite tramite microscopia a fluorescenza automatizzata. L'efficienza di fotoattivazione a diversi regimi di illuminazione viene determinata a diverse profondità in un tessuto modello e il dosaggio ottimale della luce viene applicato nell'esperimento terapeutico finale in vivo .

In questo lavoro, sono stati condotti esperimenti su cellule 2D e 3D per determinare l'IC50 per le forme "ring-closed" e "ring-open" di LMB002 (vedi Figura 1) in diversi tempi di incubazione. Questi valori sono stati confrontati con quelli ottenuti per il prototipo di peptide, la gramicidina S (utilizzata come controllo positivo). Un tipico insieme di immagini dell'incubazione nella coltura LLC coltivata in 2D dopo la colorazione è mostrato nella Figura 5. La co-colorazione con Hoechst 33342 (blu) e ioduro di propidio (rosso) con conseguente diverse tonalità di viola in una frazione maggiore di cellule nel caso del trattamento con forma "ring-open" rispetto a "ring-closed" indica una notevole differenza di citotossicità tra due forme che può essere facilmente quantificata. L'esempio dimostrato di un esperimento riuscito si basa sui dati raccolti utilizzando il formato a piastra a 96 pozzetti, in cui sono state aggiunte le varianti peptidiche a concentrazioni variabili, come mostrato nella Figura 2. Dati simili possono essere acquisiti con pozzetti a 384 pozzetti e piastre ad alta densità. Tuttavia, poiché i volumi per pozzo sono ridotti, gli errori tecnici e sistematici e, di conseguenza, l'accuratezza della determinazione IC50 diminuiranno con l'aumentare della densità del pozzo.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig05.jpg"> Figura 5: Immagini rappresentative del saggio di citotossicità nella LLC coltivata a monostrato. Le cellule sono state colorate con Hoechst 33342 (blu) e ioduro di propidio (rosso). I tempi indicati: 10 min, 60 min, 24 h e 72 h sono tempi di incubazione con composti. Barre di scala = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
La fotoconversione di LMB002 mediante irradiazione di luce laser in un tessuto modello - carne di maiale fresca macinata - è stata determinata utilizzando un campione composto da carne macinata mescolata con LMB002 "ring-closed" (inattiva) forma disciolta in PBS e misurando la conversione di questa forma inattiva nella forma LMB002 "ring-open" (attivata) nella direzione della propagazione della radiazione. Il campione è stato posto in una siringa e irradiato da un lato con un fascio piatto di radiazione laser per il tempo di esposizione di ~ 10 minuti (solitamente utilizzato negli esperimenti in vivo ), come mostrato nella Figura 3. Dopo l'esposizione, il cilindro del campione è stato diviso in parti premendo il pistone della siringa e tagliando le fette della stessa altezza con un bisturi. La concentrazione di LMB002 "ring-open" negli estratti delle fette è stata determinata utilizzando RP HPLC.
La figura 6 illustra le curve dose-effetto ottenute dalla figura 6A-D dall'analisi dei dati. Per identificare la percentuale di cellule morte con co-colorazione nucleare di Hoechst 33342 e coloranti PI, abbiamo utilizzato uno strumento di classificazione integrato che imposta soglie numeriche a parametri misurati selezionati per dividere tutti i conteggi delle celle in diverse categorie. Ad esempio, quando il segnale del canale rosso (ioduro di propidio) nel controllo era alla soglia (circa 110-130 unità), le cellule potrebbero essere classificate come PI-positive, considerate come morte, o PI-negative, considerate come non influenzate dai composti. Per LMB002, si possono osservare dipendenze sigmoidali della percentuale di cellule positive allo ioduro di propidio sulla concentrazione del composto. Da questi dati è possibile determinare i valori IC50.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig06.jpg"> Figura 6: Analisi della citotossicità in coltura 2D. I sigmoidi si adattano come sono stati ottenuti nella coltura LLC per (A) 10 min, (B) 60 min, (C) 24 h e (D) 72 h-intervalli di tempo presi per l'incubazione con composti. Il raccordo consente la determinazione accurata dei valori IC50 (non mostrati). Le barre di errore sono SEM. Abbreviazioni: LLC = carcinoma polmonare di Lewis; PI = ioduro di propidio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig06large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
Considerando i valori IC50 ottenuti, possiamo concludere che la tossicità di tutti e tre i composti è aumentata con il tempo di incubazione. Il nostro esperimento ha rivelato che la forma "ad anello" di LMB002 è circa una fase di diluizione meno tossica del peptide prototipo, la gramicidina S. Mentre la forma "ad anello chiuso" dimostra da tre a quattro fasi di diluizione una tossicità inferiore, che aumenta con il tempo di incubazione. La differenza tra le due fasi di diluizione non è influenzata dall'aumento del tempo di incubazione e può essere utilizzata numericamente come finestra fototerapeutica 6 determinata sperimentalmenteper il confronto con altri composti in un potenziale screening di libreria. Il valore IC50 per la gramicidina S è stato fissato come punto di riferimento per correggere errori sperimentali o output differenziali in repliche biologiche.
Gli esperimenti sulle cellule 3D hanno prodotto lo stesso tipo di dati grezzi: le immagini sferoidi risolte a singola cellula una per pozzetto. L'inclusione della calceina come terzo colorante colorante consente la quantificazione della frazione di cellule metabolicamente attive (osservate nel canale verde). Utilizzando piastre a 384 pozzetti, aumentando il numero di repliche tecniche, escludendo i punti temporali di co-incubazione ridondanti e modificando la piega di diluizione, siamo stati in grado di confrontare direttamente diversi composti in un singolo test (utilizzando una singola piastra) come illustrato nella mappa delle piastre nella Figura 7.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig07.jpg"> Figura 7: Mappa delle lastre per l'esperimento di coltura 3D con due composti. Sono indicati i codici colore per i composti e il controllo. I numeri nei pozzi sono concentrazioni in μM. 10 min, 24 h e 72 h sono tempi di incubazione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig07large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
La Figura 8 mostra le immagini di repliche tecniche selezionate di sferoidi LLC cresciuti a una densità di 1 sferoide/pozzetto in presenza di composti testati e sferoidi di controllo catturati dopo la colorazione.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig08.jpg"> Figura 8: Immagini rappresentative dal saggio di citotossicità della coltura 3D. Le immagini mostrano sferoidi LLC di 48 ore colorati con Hoechst 33342 (blu), calceina AM (verde) e ioduro di propidio (rosso) dopo 10 min, 24 h e 72 h di co-incubazione con fotoforme LMB002 e gramicidina S. Barre di scala = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig08large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Utilizzando il software dello strumento, le curve dose-effetto, come quelle dell'esperimento 2D, sono state ottenute dalle pile di immagini impilate a z (Figura 9A). Inoltre, gli sferoidi compatti e non deformati nelle colture 3D potrebbero essere caratterizzati dal diametro dell'intero sferoide (Figura 9B). È stato anche notato che il diametro sferoide complessivo varia con la concentrazione composta.
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig09.jpg"> Figura 9: Valutazione della citotossicità con colture 3D. (A) Curve di adattamento della citotossicità concentrazione-dipendenti e (B) grafici di diametro dello sferoide dipendenti dalla concentrazione ottenuti nelle colture 3D di LLC co-incubate con gramicidina S per 10 minuti, 24 ore e 72 ore e catturate prima della colorazione. Le barre di errore sono SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig09large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
L'esperimento per la fase 2 consente di determinare le concentrazioni di LMB002 in entrambe le fotoforme utilizzando la cromatografia liquida ad alte prestazioni rilevata dai raggi UV. L'efficienza della fotoconversione nei tessuti modello è stata facilmente valutata e quantificata utilizzando questa configurazione (Figura 3). I dati sono stati ottenuti dall'analisi quantitativa dei cromatogrammi degli estratti campione. In questi esperimenti di prova, i cromatogrammi LMB002 sono stati rilevati spettroscopicamente a 270 nm e 570 nm. A 270 nm, molti segnali aggiuntivi sono stati osservati e attribuiti ai composti co-estratti dal tessuto modello (verificati dall'estratto di controllo senza il composto). Entrambe le fotoforme erano sufficientemente diverse nei tempi di ritenzione e assorbanza. Tuttavia, il segnale "ring-open" LMB002 era separato dalla linea di base da questi segnali di fondo (vedere un cromatogramma rappresentativo in Figura 10A). Pertanto, questo segnale può essere integrato senza problemi. A 570 nm, i cromatogrammi contenevano solo il segnale di forma "ring-closed" LMB002 (Figura 10B). Qui, abbiamo eseguito la determinazione della concentrazione utilizzando RP HPLC. Tuttavia, è possibile ottenere un'accuratezza ancora più elevata e limiti di rilevamento inferiori utilizzando LC/MS come metodo analitico.
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig10.jpg"> Figura 10: Cromatogrammi rappresentativi di LMB002 estratti da tessuti modello. (A) campione a 2 mm dalla superficie irradiata, registrato a 270 nm (LMB002 forma "ring-open" è integrato); (B) campione a 38 mm dalla superficie irradiata, registrato a 570 nm (il picco di LMB002 "ring-closed" è integrato). I valori del tempo di ritenzione (indicati) hanno inoltre confermato l'identità del composto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig10large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
I dati ottenuti dopo aver integrato i segnali corrispondenti di tutti i campioni raccolti sono stati utilizzati per costruire i grafici concentrazione-profondità, come mostrato nella Figura 11. Sulla base di questi grafici, l'efficienza della fotoconversione a diverse profondità del tessuto modello è stata facilmente valutata. Conferma che la nostra sorgente di luce rossa induce la fotoconversione LMB002 "ad anello" a una profondità fino a 1 c, nella carne macinata surrogata del tessuto (a circa 103 mW / cm2).
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig11.jpg"> Figura 11: Valutazione dell'efficienza di fotoconversione. Concentrazione (A, mg/kg) di LMB002 forme "ring-closed" (non attivate, punti blu) e "ring-open" (attivate, punti arancioni) a diverse distanze dalla superficie irradiata del tessuto modello (L, mm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig11large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
I risultati dell'esperimento in vivo - Fase 3 della nostra metodologia eseguita secondo lo schema presentato in Figura 4 - sono stati rappresentati da grafici che mostrano la crescita tumorale in funzione del tempo (Figura 12) e delle curve di sopravvivenza di Kaplan-Meier (Figura 13).
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig12.jpg"> Figura 12: Dinamica di crescita tumorale negli animali. Animali trattati con LMB002 rispetto agli animali trattati con veicolo (modello di allotrapianto LLC sottocutaneo in topi C57BL/6NCrl, dose composta 7 mg/kg, IV, 2 h 40 min di incubazione, quindi irradiazione a 650 nm, 100 mW/cm2, 20 min). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig12large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 13" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig13.jpg"> Figura 13: Curve di mortalità per gli animali. Animali trattati con LMB002 rispetto agli animali trattati con veicolo (modello di allotrapianto LLC sottocutaneo in topi C57BL/6NCrl, dose composta 7 mg/kg, IV, 2 h 40 min di incubazione, quindi irradiazione a 650 nm, 100 mW/cm2, 20 min). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig13large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>

Questo protocollo presenta una serie di esperimenti adottati per la valutazione di peptidi antitumorali fotocommutabili, che possono essere utilizzati nello screening preclinico di tali composti. Ciò include la valutazione della citotossicità in colture cellulari 2D e 3D, la valutazione dell'efficienza di fotoisomerizzazione ex vivo (tessuto modello) e l'efficacia in vivo .

Valutazione in vitro e in vivo di composti biologicamente attivi fotocontrollati - potenziali farmaci candidati per la fotofarmacologia del cancro

Photocontrolled, biologically active compounds are an emerging class of &#34;smart&#34; drug candidates. They provide additional safety in systemic ...

I composti fotocontrollati e biologicamente attivi contengono frammenti fotoisomerizzabili in modo reversibile, fotointerruttori nelle loro molecole. I composti sono peptidi ciclici modificati da un frammento di diariletene che subisce trasformazioni elettrocicliche reversibili indotte dalla luce. Possono passare da una forma biologicamente inattiva generata dai raggi UV a una forma biologicamente attiva generata dalla luce rossa.Si ritiene che i farmaci fotocommutabili siano più sicuri dei farmaci non fotocommutabili. Questo perché è possibile somministrare una forma non tossica e disattivata al corpo umano e attivarla localmente con la luce solo dove ne hai bisogno, che è, ad esempio, tumori, coclee o ferite. Non ci sono metodi o protocolli standard per lo sviluppo preclinico o clinico di tali farmaci fotofarmacologici, quindi qui, vogliamo mostrarvi esperimenti che possono essere utilizzati per questa prima ricerca preclinica.Kateryna Horbatok e Tetiana Makhnii dimostreranno le procedure. Le procedure di cura degli animali e sperimentali sono state approvate dalla Commissione di Bioetica della Società Bienta. Iniziare preparando i buffer utilizzando le procedure standard.In alternativa, utilizzare soluzioni disponibili in commercio. Preparare soluzioni stock di composti. Per ogni composto, pesare due lotti di 5,12 milligrammi del composto nella fotoforma chiusa ad anello in due tubi di Eppendorf da 1,5 millilitri, uno con pareti trasparenti e uno con pareti nere e non trasparenti.Come controllo positivo, pesare 2,28 milligrammi del peptide genitore, non fotocontrollato, in un tubo extra. Aggiungere 100 microlitri di DMSO puro a ciascun campione e vortice per 30 secondi. Fotoisomerizzare la soluzione madre nel tubo a parete chiara irradiando la soluzione con un laser a 650 nanometri, densità di potenza luminosa 6 watt per centimetro quadrato, con vortice per garantire la miscelazione.Continuare fino a quando il colore cambia da viola scuro a marrone chiaro. Proteggere dalla luce con un foglio di alluminio. Seme da 5.000 a 10.000 cellule per pozzetto.Abbiamo usato circa 8.000 cellule di carcinoma polmonare di Lewis in 200 microlitri di DMEM nei 60 pozzetti centrali di una piastra sterile a 96 pozzetti con un fondo trasparente e pareti nere e non trasparenti. Riempire i restanti 36 pozzetti con DMEM puro. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius in un'atmosfera al 5% di CO2 durante la notte.Il giorno successivo, preparare le diluizioni seriali dei composti e il controllo positivo in piastre trasparenti autoclavate in polipropilene. Iniziare con le scorte in DMSO e diluire con DMEM, ma non superare l'1% del volume DMSO nella concentrazione finale più alta. Per evitare la fotoisomerizzazione incontrollata dei composti studiati, spegnere le luci nell'armadio sterile.Trasferire 100 microlitri delle diluizioni in 56 pozzetti con 100 microlitri di DMEM precedentemente aggiunto per raggiungere la concentrazione finale richiesta dei composti nei pozzetti, tipicamente entro l'intervallo da cinque a 150 micromolari. Quindi, aggiungere 100 microlitri di DMEM a quattro pozzetti, che fungono da controllo negativo. Coprire le lastre con un foglio di alluminio o un coperchio di plastica non trasparente per evitare la commutazione incontrollata della foto.Posizionare le piastre in un incubatore di colture cellulari a 37 gradi Celsius per il tempo di incubazione scelto. Dopo le incubazioni, aggiungere 50 microlitri di soluzione colorante per pozzetto alle piastre. Utilizzare Hoechst 33342 a cinque micromolari e ioduro di propidio monomolare come soluzioni di colorazione finali per questo esperimento.Incubare nuovamente a 37 gradi Celsius per 20 minuti. Esegui l'imaging a fluorescenza automatizzato utilizzando un obiettivo con ingrandimento 20X. Le operazioni di laboratorio per questa parte del metodo sono identiche a quelle descritte per l'esperimento 2D: preparazione della coltura cellulare, incubazione con i composti testati e imaging.Tuttavia, in questo caso, le cellule sono preparate come sferoidi compatti e maturi in una piastra a 384 pozzetti, ultra-bassa, con fondo a U con pareti nere e non trasparenti. L'uso di una piastra di queste dimensioni consente di confrontare due composti in un esperimento. In questo esperimento, abbiamo utilizzato in aggiunta calceina AM come terzo componente della soluzione di colorazione multicolore.Le immagini ottenute dagli esperimenti 2D e 3D vengono analizzate utilizzando il software di analisi delle immagini automatizzato degli strumenti. Le cellule sottoposte a coloranti Hoechst e ioduro di propidio sono considerate necroticamente morte e la loro frazione in funzione della concentrazione viene utilizzata per calcolare il valore IC50. Assemblare il treno ottico per l'irradiazione del campione.È costituito da un cavo ottico dalla sorgente di luce laser, una lente con una lunghezza focale variabile, una siringa con un coperchio non trasparente e un'estremità tagliata piatta. Tutte le operazioni successive devono essere eseguite in una stanza buia con illuminazione minima del posto di lavoro. Preparare un campione di tessuto modello caricato con i composti fotoformali inattivi.In una corsa tipica, cinque grammi di carne di maiale macinata fresca vengono miscelati meccanicamente con la soluzione PBS del composto per raggiungere la concentrazione finale di 50 milligrammi per chilogrammo. Riempire la siringa con il campione caricato. Irradiare il campione nel treno ottico per l'esposizione richiesta e il tempo di dosaggio della luce.Dopo l'esposizione, fare quattro fette di campione spesse quattro millimetri spingendo la massa fuori dalla siringa con il pistone e tagliandola con un bisturi. Pesare ed estrarre il composto con acetonitrile, acqua, miscela TFA, 70% acetonitrile e 01% acido trifluoroacetico in un tubo Eppendorf da 1,5 millilitri. Centrifugare a 20XG per 30 minuti due volte per rimuovere il materiale insolubile e raccogliere il surnatante.Registrare cromatogrammi rilevati dai raggi UV a 570 nanometri di rilevamento della loro forma chiusa e rilevamento a 270 nanometri della forma ad anello aperto. Utilizzare i campioni di controllo non irradiati e irradiati preparati in modo simile alle soluzioni madre negli esperimenti sulle cellule per determinare i tempi di ritenzione specifici e calibrare il metodo. Ripetere l'esperimento tre volte e tracciare la percentuale normalizzata di ciascuna fotoforma sul grafico, percentuale rispetto alla distanza dalla superficie del tessuto irradiato.Al giorno zero, inoculare le femmine adulte C57 nere 6 topi del peso di circa 20 grammi ciascuna per via sottocutanea con una sospensione di circa mezzo milione di cellule di carcinoma polmonare di Lewis in circa 100 microlitri di DMEM e Matrigel mix nella zampa posteriore destra. Questa procedura viene eseguita sotto sedazione con isoflurano al 5%. Gli animali sono pronti per il trattamento nei giorni da cinque a otto, quando i tumori sono palpabili.Tutte le operazioni che comportano il test devono essere eseguite in condizioni di semi-oscurità. Questa condizione vale anche quando si trattano gli animali dopo aver ricevuto la dose composta per un periodo di due giorni. Assemblare casualmente quattro gruppi di otto animali e rimuovere la pelliccia dall'area tumorale.I due gruppi di controllo ricevono un'iniezione endovenosa del veicolo. 100 microlitri di soluzione salina per animale da 20 grammi, e gli animali nei due gruppi sperimentali hanno ricevuto il composto testato nella fotoforma inattiva in una soluzione di un milligrammo per millilitro di soluzione salina. Somministrare il bolo composto nella vena caudale a cinque millilitri per chilo.Due ore e 45 minuti dopo l'iniezione del composto, irradiare l'area tumorale per 20 minuti in anestesia isoflurana con un laser a 650 nanometri, utilizzando una densità di potenza luminosa di 100 milliwatt per centimetro quadrato. Osservare attentamente le condizioni degli animali nei prossimi 30 minuti. Osserva quotidianamente gli animali e misura il loro peso e le dimensioni dei loro tumori.Misurare i volumi del tumore e notare la progressione della necrosi. Determinare il tasso di sopravvivenza utilizzando la procedura standard. I risultati del nostro protocollo per la fase uno nel caso di esperimenti di coltura cellulare 2D possono essere presentati come immagini, come illustrato qui su un'immagine rappresentativa per cellule di carcinoma polmonare di Lewis incubate con LMB002 a diverse concentrazioni e per diversi periodi di incubazione.Il costaining con Hoechst e ioduro di propidio consente la visualizzazione dei nuclei cellulari nel canale blu, fornendo così un conteggio totale delle cellule. Nel canale rosso sono state osservate cellule con integrità compromessa della membrana plasmatica. Supponendo che quest'ultimo sia necroticamente morto, l'apparente citotossicità di un composto in studio può essere quantificata come percentuale delle cellule positive allo ioduro di propidio.I risultati della quantificazione dei dati ottenuti attraverso l'analisi automatizzata delle immagini sono mostrati qui. Per LMB002, si possono osservare dipendenze sigmoidali della percentuale di cellule positive allo ioduro di propidio nella concentrazione del composto. Da questi dati è possibile determinare i valori IC50.Il nostro esperimento ha rivelato che la forma aperta di LMB002 è circa una fase di diluizione meno tossica del peptide prototipo, Gramicidina S, mentre la forma chiusa dimostra da tre a quattro fasi di diluizione una tossicità inferiore, che aumenta con il tempo di incubazione. Gli esperimenti sulle cellule 3D hanno prodotto lo stesso tipo di dati grezzi, le immagini sferoidi risolte a singola cellula una per parete. L'inclusione della calceina come terzo colorante colorante consente la quantificazione della frazione di cellule metabolicamente attive osservate nel canale verde.Le curve dell'effetto dose, come quelle dell'esperimento 2D, sono state ottenute dalle pile di immagini Z-stack. Il pannello A illustra tali curve, confermando i risultati 2D. Come mostrato nel pannello B, il diametro sferoide complessivo varia con la concentrazione del composto.L'esperimento per la fase due consente di determinare le concentrazioni di LMB002 in entrambe le fotoforme utilizzando la cromatografia liquida ad alte prestazioni rilevata dai raggi UV. Entrambe le fotoforme erano sufficientemente diverse nei tempi di ritenzione e assorbanza, mostrate integrate sui pannelli A e B della figura. I dati ottenuti sono riassunti in figura, confermando che la nostra sorgente di luce rossa induce la fotoconversione LMB002 ad anello chiuso ad una profondità fino a un centimetro nel tessuto surrogato, carne macinata a circa 103 milliwatt per centimetro quadrato.I risultati dell'esperimento in vivo, fase tre della nostra metodologia, sono stati rappresentati da grafici che mostrano la crescita del tumore in funzione del tempo nelle curve di sopravvivenza di Kaplan-Meier. La strategia qui rappresentata per valutare i candidati farmaci fotocommutabili è pratica e adatta per composti con fotointerruttori di tipo diariletene. La prima fase, la quantificazione della citotossicità può essere utilizzata per lo screening iniziale delle librerie dei composti fotocontrollati.Fase due, la valutazione dell'efficienza di fotocommutazione è facile da configurare ed etica. Non richiede animali vivi. Fase tre, modelli fotofarmacologici in vivo, la terapia può essere applicata a piccoli animali.

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