Name: Preparazione di vettori lentivirali per unefficiente modulazione di geni e microRNA di macrofagi residenti nei tessuti della cavità peritoneale in vivo nei topi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: Impara a preparare vettori lentivirali per la modulazione genica efficiente dei macrofagi residenti peritoneali nei topi. Questo metodo consente l'integrazione stabile dei transgeni e l'espressione efficace per studiare l'immunometabolismo in vivo.

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<meta charset="utf8"></head><body>Preparazione di vettori lentivirali per la modulazione genica in vivo

<ol><li>Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+biology+in+development%2C+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Macrophage biology in development, homeostasis and disease.</a> Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).</li>
<li>Jantsch, J., Binger, K. J., Muller, D. N., Titze, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+in+homeostatic+immune+function%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">Macrophages in homeostatic immune function.</a> Front Physiol. 5, 146(2014).</li>
<li>Wynn, T. A., Vannella, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+in+tissue+repair%2C+regeneration%2C+and+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Macrophages in tissue repair, regeneration, and fibrosis.</a> Immunity. 44 (3), 450-462 (2016).</li>
<li>Ginhoux, F., Guilliams, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-resident+macrophage+ontogeny+and+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Tissue-resident macrophage ontogeny and homeostasis.</a> Immunity. 44 (3), 439-449 (2016).</li>
<li>Epelman, S., Lavine, K. J., Randolph, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+functions+of+tissue+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Origin and functions of tissue macrophages.</a> Immunity. 41 (1), 21-35 (2014).</li>
<li>Amit, I., Winter, D. R., Jung, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+local+environment+and+epigenetics+in+shaping+macrophage+identity+and+their+effect+on+tissue+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The role of the local environment and epigenetics in shaping macrophage identity and their effect on tissue homeostasis.</a> Nat Immunol. 17 (1), 18-25 (2016).</li>
<li>Gosselin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environment+drives+selection+and+function+of+enhancers+controlling+tissue-specific+macrophage+identities%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Environment drives selection and function of enhancers controlling tissue-specific macrophage identities.</a> Cell. 159 (6), 1327-1340 (2014).</li>
<li>Lavin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-resident+macrophage+enhancer+landscapes+are+shaped+by+the+local+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tissue-resident macrophage enhancer landscapes are shaped by the local microenvironment.</a> Cell. 159 (6), 1312-1326 (2014).</li>
<li>Davies, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peritoneal+tissue-resident+macrophages+are+metabolically+poised+to+engage+microbes+using+tissue-niche+fuels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Peritoneal tissue-resident macrophages are metabolically poised to engage microbes using tissue-niche fuels.</a> Nat Commun. 8 (1), 2047(2017).</li>
<li>Shi, J., Hua, L., Harmer, D., Li, P., Ren, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre+driver+mice+targeting+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cre driver mice targeting macrophages.</a> Methods Mol Biol. 1784, 263-275 (2018).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+lentiviral+vectors+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+China+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Recent advances in lentiviral vectors for gene therapy.</a> Sci China Life Sci. 64 (11), 1842-1857 (2021).</li>
<li>Kosaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivirus-based+gene+delivery+in+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Artif+Organs%22%5BJournal%5D)">Lentivirus-based gene delivery in mouse embryonic stem cells.</a> Artif Organs. 28 (3), 271-277 (2004).</li>
<li>Naldini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+gene+delivery+and+stable+transduction+of+nondividing+cells+by+a+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector.</a> Science. 272 (5259), 263-267 (1996).</li>
<li>Yamashita, M., Emerman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capsid+is+a+dominant+determinant+of+retrovirus+infectivity+in+nondividing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Capsid is a dominant determinant of retrovirus infectivity in nondividing cells.</a> J Virol. 78 (11), 5670-5678 (2004).</li>
<li>Wilson, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+delivery+of+RNAi+for+in+vivo+lineage-specific+modulation+of+gene+expression+in+mouse+lung+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Lentiviral delivery of RNAi for in vivo lineage-specific modulation of gene expression in mouse lung macrophages.</a> Mol Ther. 21 (4), 825-833 (2013).</li>
<li>Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicular+stomatitis+virus+G+glycoprotein+pseudotyped+retroviral+vectors%3A+concentration+to+very+high+titer+and+efficient+gene+transfer+into+mammalian+and+nonmammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (17), 8033-8037 (1993).</li>
<li>Finkelshtein, D., Werman, A., Novick, D., Barak, S., Rubinstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LDL+receptor+and+its+family+members+serve+as+the+cellular+receptors+for+vesicular+stomatitis+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">LDL receptor and its family members serve as the cellular receptors for vesicular stomatitis virus.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (18), 7306-7311 (2013).</li>
<li>Ipseiz, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+in+vivo+gene+modification+in+mouse+tissue-resident+peritoneal+macrophages+by+intraperitoneal+delivery+of+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Effective in vivo gene modification in mouse tissue-resident peritoneal macrophages by intraperitoneal delivery of lentiviral vectors.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 16, 21-31 (2020).</li>
<li>Rosas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+Gata6+links+tissue+macrophage+phenotype+and+proliferative+renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The transcription factor Gata6 links tissue macrophage phenotype and proliferative renewal.</a> Science. 344 (6184), 645-648 (2014).</li>
<li>BeckmanCoulter. , https://www.mybeckman.uk/resources/technologies/centrifugation/principles/rotor-balancing (2023).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Rodent+Handling+and+Restraint+Techniques%22">Rodent Handling and Restraint Techniques</a>. , JoVE, Cambridge, MA. (2023).</li>
<li>Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiply+attenuated+lentiviral+vector+achieves+efficient+gene+delivery+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo.</a> Nat Biotechnol. 15 (9), 871-875 (1997).</li>
<li>Nasri, M., Karimi, A., Allahbakhshian Farsani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production%2C+purification+and+titration+of+a+lentivirus-based+vector+for+gene+delivery+purposes%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Production, purification and titration of a lentivirus-based vector for gene delivery purposes.</a> Cytotechnology. 66 (6), 1031-1038 (2014).</li>
<li>Optimized production and concentration of lentiviral vectors containing large inserts. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22J+Gene+Med%22">J Gene Med</a>. al Yacoub, N., Romanowska, M., Haritonova, N., Foerster, J. 9 (7), 579-584 (2007).</li>
<li>Malim, M. H., Bieniasz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+restriction+factors+and+mechanisms+of+evasion%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Med%22%5BJournal%5D)">HIV restriction factors and mechanisms of evasion.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (5), a006940(2012).</li>
<li>Sonza, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Susceptibility+of+human+monocytes+to+HIV+type+1+infection+in+vitro+is+not+dependent+on+their+level+of+CD4+expression%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Res+Hum+Retroviruses%22%5BJournal%5D)">Susceptibility of human monocytes to HIV type 1 infection in vitro is not dependent on their level of CD4 expression.</a> AIDS Res Hum Retroviruses. 11 (7), 769-776 (1995).</li>
<li>Kingston, R. E., Chen, C. A., Rose, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+phosphate+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium phosphate transfection.</a> Curr Protoc Mol Biol. Chapter 9, Unit 9.1(2003).</li>
<li>Brown, L. Y., Dong, W., Kantor, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Improved+protocol+for+the+production+of+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">An Improved protocol for the production of lentiviral vectors.</a> STAR Protoc. 1 (3), 100152(2020).</li>
<li>Moce-Llivina, L., Jofre, J., Muniesa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+polyvinylidene+fluoride+and+polyether+sulfone+membranes+in+filtering+viral+suspensions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of polyvinylidene fluoride and polyether sulfone membranes in filtering viral suspensions.</a> J Virol Methods. 109 (1), 99-101 (2003).</li>
<li>Jiang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+method+for+high-titer+lentivirus+preparations+without+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">An optimized method for high-titer lentivirus preparations without ultracentrifugation.</a> Sci Rep. 5, 13875(2015).</li>
<li>Czubala, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGFbeta+induces+a+SAMHD1-independent+post-entry+restriction+to+HIV-1+infection+of+human+epithelial+langerhans+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">TGFbeta induces a SAMHD1-independent post-entry restriction to HIV-1 infection of human epithelial langerhans cells.</a> J Invest Dermatol. 136 (10), 1981-1989 (2016).</li>
<li>Bouabe, H., Okkenhaug, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+targeting+in+mice%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene targeting in mice: a review.</a> Methods Mol Biol. 1064, 315-336 (2013).</li>
<li>Kim, J. M., Rasmussen, J. P., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+T+cells+prevent+catastrophic+autoimmunity+throughout+the+lifespan+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulatory T cells prevent catastrophic autoimmunity throughout the lifespan of mice.</a> Nat Immunol. 8 (2), 191-197 (2007).</li>
<li>Decalf, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensing+of+HIV-1+entry+triggers+a+Type+I+Interferon+response+in+human+primary+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Sensing of HIV-1 entry triggers a Type I Interferon response in human primary macrophages.</a> J Virol. 91 (15), e00147-e00217 (2017).</li>
<li>Wilson, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amelioration+of+emphysema+in+mice+through+lentiviral+transduction+of+long-lived+pulmonary+alveolar+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Amelioration of emphysema in mice through lentiviral transduction of long-lived pulmonary alveolar macrophages.</a> J Clin Invest. 120 (1), 379-389 (2010).</li>
<li>Markusic, D. M., van Til, N. P., Hiralall, J. K., Elferink, R. P., Seppen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+liver+macrophage+transduction+by+pseudotyping+lentiviral+vectors+with+a+fusion+envelope+from+Autographa+californica+GP64+and+Sendai+virus+F2+domain%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Reduction of liver macrophage transduction by pseudotyping lentiviral vectors with a fusion envelope from Autographa californica GP64 and Sendai virus F2 domain.</a> BMC Biotechnol. 9, 85(2009).</li>
<li>Burke, B., Sumner, S., Maitland, N., Lewis, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+in+gene+therapy%3A+cellular+delivery+vehicles+and+in+vivo+targets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Macrophages in gene therapy: cellular delivery vehicles and in vivo targets.</a> J Leukoc Biol. 72 (3), 417-428 (2002).</li>
<li>Bain, C. C., Jenkins, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+serous+cavity+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Immunol%22%5BJournal%5D)">The biology of serous cavity macrophages.</a> Cell Immunol. 330, 126-135 (2018).</li>
<li>Milone, M. C., O'Doherty, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+use+of+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Clinical use of lentiviral vectors.</a> Leukemia. 32 (7), 1529-1541 (2018).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0,05% Tripsina-EDTA (1x) (Tripsina 500 mg/L o 0,02 mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific 25300054</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,22 &mu; m filtro sterile millex GP</td><td>Merck</td><td>SLGS033SS</td><td></td></tr><tr><td>0,45 &mu; m sterile millex GP filter</td><td>Merck</td><td>SLHP033RS</td><td></td></tr><tr><td>0,5 mL Siringa da insulina U-100 con ago, 0,33 mm x 12,7 mm (29 G)</td><td>BD</td><td>324892</td><td></td></tr><tr><td>1 litro Sharps Container</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>2,4G2 anticorpo (TruStain FcX anti-mouse CD16/32)</td><td>Biolegend</td><td>101320</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; m filtro</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>AimV medium (grado di ricerca), AlbuMax Supplement</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31035025</td><td></td></tr><tr><td>Tampone bloccante</td><td>preparato in casa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Brewer tioglicolato medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2551</td><td>soluzione madre al 4% preparata in acqua, sterilizzata in autoclave e mantenuta congelata.</td></tr><tr><td>CD11b</td><td>Biolegend</td><td>101222</td><td>Fare riferimento alla Tabella 1 per la diluizione e la concentrazione</td></tr><tr><td>CD11b</td><td>BD</td><td>550993</td><td>Fare riferimento alla Tabella 1 per la diluizione e la concentrazione</td></tr><tr><td>CD11c</td><td>Biolegend</td><td>117317</td><td>Fare riferimento alla Tabella 1 per la diluizione e la concentrazione</td></tr><tr><td>CD11c</td><td>Biolegend</td><td>117333</td><td>Fare riferimento alla Tabella 1 per la diluizione e la concentrazione</td></tr><tr><td>CD19</td><td>BD</td><td>560375</td><td>Fare riferimento alla Tabella 1 per la diluizione e la concentrazione</td></tr><tr><td>CD19</td><td>Biolegend</td><td>152410</td><td>Fare riferimento alla Tabella 1 per la diluizione e la concentrazione</td></tr><tr><td>CD226</td><td>Biolegend</td><td>128808</td><td>Fare riferimento alla Tabella 1 per la diluizione e la concentrazione</td></tr><tr><td>CD3e</td><td>BD</td><td>560527</td><td>Fare riferimento alla Tabella 1 per la diluizione e la concentrazione</td></tr><tr><td>CD3e</td><td>Biolegend</td><td>152313</td><td>Fare riferimento alla Tabella 1 per la diluizione e la concentrazione</td></tr><tr><td>CD4</td><td>Biolegend</td><td>100412</td><td>Fare riferimento alla Tabella 1 per la diluizione e la concentrazione</td></tr><tr><td>CD73</td><td>eBioscience</td><td>16-0731-82</td><td>Fare riferimento alla Tabella 1 per la diluizione e la concentrazione</td></tr><tr><td>CD8a</td><td>eBioscience</td><td>48-0081-82</td><td>Fare riferimento alla Tabella 1 per la diluizione e la concentrazione</td></tr><tr><td>Pallone per colture cellulari (T175 fask, 175 cm2, 550 mL)</td><td>Greiner Bio One</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>Provette per centrifuga, provette a fondo conico 25 mm x 89 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>358126</td><td></td></tr><tr><td>Centrifughe</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Ultracentrifuga e centrifuga TC</td></tr><tr><td>Collagenasi tipo IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>Provette per centrifuga coniche (15 mL e 50 mL)</td><td>Greiner Bio One</td><td>11512303 & 11849650</td><td></td></tr><tr><td>Cryotube</td><td>Greiner Bio One</td><td>123277</td><td>o crioprovette</td></tr><tr><td>DMEM medium (1x) + 4,5g/L D-glucosio, 400 &; M L-glutammina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41965-062</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11284932001</td><td></td></tr><tr><td>Reagente di trasfezione Effectene</td><td>Qiagen</td><td>301425</td><td></td></tr><tr><td>F4/80</td><td>Biolegend</td><td>123123</td><td>Fare riferimento alla Tabella 1 per la diluizione e la concentrazione</td></tr><tr><td>F4/80</td><td>Biolegend</td><td>123133</td><td>Fare riferimento alla Tabella 1 per la diluizione e la concentrazione</td></tr><tr><td>F4/80</td><td>Biolegend</td><td>123147</td><td>Fare riferimento alla Tabella 1 per la diluizione e la concentrazione</td></tr><tr><td>FceR1</td><td>eBioscience</td><td>48-5898-80</td><td>Fare riferimento alla Tabella 1 per la diluizione e la concentrazione</td></tr><tr><td>del siero fetale di vitello (FCS)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270-106</td><td>inattivato a caldo per 30 min a 56 &deg; C e sterile filtrato attraverso 0,22 &mu; m filtro</td></tr><tr><td>Citometro a flusso</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp; Tampone per</td> citometria a flusso (FACS) Attune NxT <td></td></tr><tr><td></td><td>preparato internamente</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio fluorescente per colture tissutali</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EVOS FL</td><td></td></tr><tr><td>Pinze</td><td>N/A</td><td>N/A Preferenza</td><td>dell'utente</td></tr><tr><td>Soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS)</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>14175-053</td><td></td></tr><tr><td>Linea cellulare</td><td></td> <td>HEK293T</td><td>coltivato per almeno una settimana prima della trasfezione. Antigene centrale HIV-1 libero da micoplasma</td></tr><tr><td></td><td>Beckman Coulter</td><td>6604667</td><td></td></tr><tr><td>Ialuronidasi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>Scrub chirurgico Hydrex, gluconato clorexidente 4% p/v detergente per la pelle</td><td>Ecolab</td><td>3037170</td><td></td></tr><tr><td>I-A/I-E</td><td>Biolegend</td><td>107625</td><td>Fare riferimento alla Tabella 1 per la diluizione e la concentrazione</td></tr><tr><td>ICAM1</td><td>Becton Dickinson</td><td>554970</td><td>Fare riferimento alla Tabella 1 per la diluizione e la concentrazione</td></tr> della <tr><td>linea</td><td></td><td></td> cellulare Jurkat T <td>coltivata per almeno una settimana prima dell'uso. </td></tr><tr><td>Kit di colorazione per cellule morte nel vicino infrarosso fissabile</td> senza micoplasma <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L34975</td><td></td></tr><tr><td>Ly6G</td><td>Biolegend</td><td>127615</td><td>Fare riferimento alla Tabella 1 per la diluizione e la concentrazione</td></tr><tr><td>I topi</td><td></td><td></td><td>qui utilizzati C57BL/6 femmine, di età compresa tra 8 e 12 settimane (Charles Rivers), se non diversamente specificato</td></tr><tr><td>Pipette microcapillari (intervallo di volume 0,5-1.000 &mu; L)</td><td>Fisher Scientific & Starlab</td><td>11963466 & 11943466 & 11973466 & S1111-3700</td><td></td></tr><tr><td>NK1.1</td><td>Biolegend</td><td>108724</td><td>Fare riferimento alla Tabella 1 per la diluizione e la concentrazione</td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148-500G</td><td>preparato al 2% p/v in PBS</td></tr><tr><td>pCMV-&Delta; Il plasmide di imballaggio R8.91</td><td>Zuffrey, R., et al. 1997</td> codifica per la proteina Gag-Pol HIV guidata dal promotore del citomegalovirus.<td></td><td> Resistenza all'ampicilina.</td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina (100x, 10.000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri</td><td>Greiner Bio One</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>pHR'SIN-cPPT-SEW plasmide</td><td></td><td>Rosas, M. et al. 2014</td><td>modificato per studi di espressione di shRNA e miR. Codifica per il marcatore EGFP a valle, promotore SFFV e a monte del potenziatore del virus dell'epatite della marmotta. Resistenza all'ampicilina.</td></tr><tr>Il plasmide <td></td><td>pMD2.G</td><td>Naldini, L. et al. 1996</td><td>codifica per l'involucro della glicoproteina g del virus della stomatide vescicolare (VSV-G). Resistenza all'ampicilina.</td></tr><tr><td>Controllo dell'isotipo IgG1 di ratto, &kappa; Becton</td><td>Dickinson</td><td>550617</td><td>Fare riferimento alla Tabella 1 per la diluizione e la concentrazione</td></tr><tr><td>Siero di ratto</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R9759-10ML</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di lisi ACK del sangue rosso</td><td>preparato in casa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium (1x) + 400 uM L-glutammina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21875-091</td><td></td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4521</td><td></td></tr><tr><td>SiglecF</td><td>BD</td><td>562681</td><td>Fare riferimento alla Tabella 1 per la diluizione e la concentrazione</td></tr><tr><td>Compresse di ipoclorito di sodio (candeggina, 2.000 ppm)</td><td>Guest Medical</td><td>H8818</td><td></td></tr><tr><td>Piastra sterile per colture cellulari a 24 pozzetti</td><td>Greiner Bio One</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Dulbecco's PBS (DPBS) (1x) Mg++ e Ca2+ - senza</td><td>Thermo Fisher Scientific 14190144</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA sterile</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>Pipette di trasferimento monouso sterili VWR (23,0 mL, 30 cm)</td><td>VWR</td><td>612-4515</td><td></td></tr><tr><td>Sucrosio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15503022</td><td></td></tr><tr><td>forbici chirurgiche</td><td>N/A</td><td>N/A Siringhe</td><td>per le preferenze dell'utente</td></tr><tr><td>(50 mL e 1 0 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>10084450 & 768160</td><td></td></tr><tr><td>Tim4</td><td>Biolegend</td><td>130007</td><td>Fare riferimento alla Tabella 1 per la diluizione e la concentrazione Piastra</td></tr> per <tr><td>colture cellulari a 96 pozzetti con fondo a U</td><td>Greiner Bio One</td><td>650180</td><td></td></tr></tbody></table>

preparazione di vettori lentivirali per un'efficiente modulazione di geni e microrna di macrofagi residenti nei tessuti della cavità peritoneale in vivo nei topi

Lentiviral Vector Preparation for Efficient Gene and MicroRNA Modulation of Peritoneal Cavity Tissue&#45;Resident Macrophages In Vivo in Mice

Preparazione di vettori lentivirali per un'efficiente modulazione di geni e microRNA di macrofagi residenti nei tessuti della cavità peritoneale in vivo nei topi

Peritoneal tissue-resident macrophages have broad functions in the maintenance of homeostasis and are involved in pathologies within local and neighboring ...

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I microRNA hanno un ruolo significativo nella struttura del cervello e la funzione. Qui si descrive un metodo per far rispettare miRNA ippocampale iper-espressione utilizzando l'iniezione stereotassica di lentivirus ingegnerizzati miRNA che esprimono. Questo approccio può servire come un modo relativamente rapido per valutare...

Iniezione stereotassica di microRNA-esprimono lentivirus al mouse Hippocampus CA1 regione e valutazione dei risultati Behavioral

In questo protocollo, descriviamo metodi per trasfettare in modo efficiente linee cellulari di macrofagi murini con siRNA utilizzando il sistema navetta a 96 pozzetti Amaxa Nucleofector, stimolare i macrofagi con lipopolisaccaride e monitorare gli effetti sulla produzione di citochine infiammatorie.

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Descriviamo qui un semplice protocollo per isolare i macrofagi peritoneali murini. Questa procedura è seguita dall'estrazione dell'RNA per effettuare l'analisi dell'espressione genica dopo la stimolazione dei recettori Toll-like.

Isolamento di murini peritoneale macrofagi di effettuare analisi di espressione genica Al Toll-like recettori stimolazione

Iniezione della vena della coda idrodinamica di vettori di integrazione basata su trasposone consente trasfezione stabile di epatociti murini in vivo. Qui, presentiamo un protocollo pratico per sistemi di transfezione che consente l'espressione costitutiva a lungo termine di un transgene singolo o combinato espressione costitutiva e doxiciclina-viscoelastico di un transgene o miR-shRNA nel fegato.

Sistemi costitutive e inducibile per la modificazione genetica In Vivo degli epatociti Mouse usando l'iniezione della vena della coda idrodinamica

Qui, presentiamo un protocollo per promuovere l'integrazione del transgene e produzione di topi transgenici fondatore con alta efficacia mediante una semplice iniezione di un vettore lentivirale nello spazio perivitellino di un ovocita fecondato.

Produzione di topi transgenici mediata lentivirali: un metodo semplice ed altamente efficiente per uno studio diretto dei fondatori

In questo articolo, forniamo che un protocollo dettagliato per l'espressione di proteine di fusione fluorescenti nel midollo osseo murino derivate macrofagi e cellule dendritiche. Il metodo si basa sulla trasduzione del midollo osseo progenitrici con retrovirali seguite da differenziazione in macrofagi e dendritiche cellule in vitro.

Espressione di proteine di fusione fluorescenti in macrofagi e cellule dendritiche derivate da midollo osseo Murine

Descriviamo un metodo di utilizzo polyethyleneimine (PEI)-rivestito di nanoparticelle di ossido di ferro superparamagnetico per macrofagi trasfezione con siRNA. Queste nanoparticelle è in grado di fornire in modo efficiente siRNA di espressione del gene bersaglio macrofagi in vitro e in vivo e silenzio.

Nanoparticelle di ossido di ferro rivestite con Polyethyleneimine come un veicolo per la consegna di piccolo RNA interferente ai macrofagi In Vitro e In Vivo

Mirati epigenome DNA modifica rappresenta un approccio terapeutico potente. Questo protocollo descrive la produzione, purificazione e concentrazione di vettori lentivirali all-in-one che harboring il transgene CRISPR-dCas9-DNMT3A per applicazioni di modifica epigenome in cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC)-derivato di neuroni.

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I macrofagi, in particolare i macrofagi primari, sono difficili da trasfecare in quanto sono specializzati nel rilevamento di molecole di origine non auto. Descriviamo un protocollo che consente una trasfezione altamente efficiente dei macrofagi primari con mRNA generati da modelli di DNA come i plasmidi.

Trasfezione altamente efficiente dei macrofagi primari con mRNA trascritto in vitro

Questo protocollo mira a introdurre un metodo per produrre e purificare biomimetici extracellulari derivati dalle vescicole staminali mesenchimali (MSC) per la terapia genica. La nanovescicola è confinata da bilayer lipidici derivati dalla MSC e racchiude gli AAV ricombinanti che portano il gene di interesse nel lume. Questa nanovescicola offre un vettore potenziato per la trasmissione in vivo dei geni.

Sviluppo di nanovescicole mesenchimali avvolte nella membrana delle cellule staminali per un migliorato apporto genico

Impara a preparare vettori lentivirali per la modulazione genica efficiente dei macrofagi residenti peritoneali nei topi. Questo metodo consente l'integrazione stabile dei transgeni e l'espressione efficace per studiare l'immunometabolismo in vivo.

Preparazione di vettori lentivirali per unefficiente modulazione di geni e microRNA di macrofagi residenti nei tessuti della cavità peritoneale in vivo nei topi (Video) | JoVE Journal

Preparazione di vettori lentivirali per un'efficiente modulazione di geni e microRNA di macrofagi residenti nei tessuti della cavità peritoneale in vivo nei topi

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