Imaging in situ del Timo mouse utilizzando 2-Photon Microscopia

L'imaging a due fotoni è utile per l'immunologia perché ci permette di seguire la migrazione di una singola cellula mentre incontra il suo ambiente. Seguendo la migrazione nel timo, mediante microscopia a due fotoni possiamo caratterizzare il meccanismo della selezione positiva e negativa.

Ciao, sono Ina Lottie del laboratorio della dottoressa Ellen Roby presso l'Università della California a Berkeley. E io sono Paul Herzmark, anch'io del laboratorio di Ellen Robby. Oggi vi mostreremo come eseguiamo l'imaging in situ del tessuto timico, e vi farò vedere come possiamo utilizzare il nostro microscopio a due fotoni per osservare il timo.

E vi mostrerò i passaggi che portano all'immagine mediante microscopia a due fotoni. Questi includono le seguenti procedure: isolamento di cellule staminali ematopoietiche dal midollo osseo, trasferimento adottivo di cellule del midollo osseo in neonati, dissezione e bisezione del timo, preparazione del tessuto per l'analisi mediante microscopia a scansione laser a due fotoni. Cominciamo dunque.

Prima di poter preparare il timo per l'analisi mediante imaging, dobbiamo innanzitutto trasferire in modo adottivo cellule del midollo osseo in un topo neonato. Queste cellule del midollo osseo sono state isolate dagli arti posteriori di topi transgenici che esprimono GFP in modo ubiquo. Questa è una siringa per insulina contenente 50 microlitri di midollo osseo.

Eseguiamo da due a quattro iniezioni in ospiti di età compresa tra tre e sette giorni, utilizzando il midollo osseo di un donatore per ogni cucciolo iniettato. Qui abbiamo un cucciolo di cinque giorni: afferrare la pelle per evitare che il cucciolo si muova durante l'iniezione e per mantenere la pelle sollevata. Mirare a un sito di iniezione situato al di sotto dei polmoni e della gabbia toracica, ma al di sopra dell'intestino e dello stomaco.

Mentre si effettua l'iniezione, allentare la presa sulla pelle per consentirne l'espansione. Infine, rimuovere lentamente la siringa per limitare la quantità di midollo osseo che va perduta. Questi topi verranno lasciati sviluppare per quattro-sei settimane, dopodiché il timo potrà essere asportato per l'analisi mediante imaging.

Dopo quattro a sei settimane, il timo può essere rimosso. Per l'analisi di imaging, utilizzerò un paio di pinze e forbici grandi, oltre a un paio di pinze e forbici piccole. Questo campione è stato sacrificato in conformità al nostro protocollo per l'uso degli animali ed è stato irrorato con etanolo.

E userò la pinza grande per afferrare la pelle ed effettuare un'incisione lungo la linea mediana. Ora posso utilizzare le forbici per tagliare lungo la linea mediana oppure posso staccare la pelle dal peritoneo e fisserò la pelle con dei perni per esporre la cavità toracica. Userò lo sterno come punto di appoggio mentre taglio attraverso il peritoneo, accedendo alla cavità toracica attraverso il diaframma, quindi taglierò lungo i lati della gabbia toracica.

E puoi vedere il timo che giace proprio sopra il cuore. Li rimetterò a posto. Quindi ecco il timo.

Eviterò di toccarlo. Usa le pinzette più piccole e continua a tenere i tessuti intorno al timo. Ok, ora lo irriverò con un po' di PBS e inizierò a rimuovere alcuni tessuti in eccesso.

Quindi userò il tessuto intorno al timo per tenerlo fermo. Durante la pulizia del timo, rimuoverò con cura il tessuto in eccesso, tagliandolo delicatamente. Ora, il timo presenta due lobi che dobbiamo separare mentre lo puliamo.

Ma prima rimuoverò tutti questi vasi sanguigni aggiuntivi che si trovano sulla superficie del timo. Farò molta attenzione a non alterare l'architettura del timo che andremo a riprendere. Quindi sto rimuovendo solo il tessuto che si trova esattamente sulla superficie.

Ora inizierò delicatamente a separare i due lobi. Questo è il lobo ventrale e il lobo dorsale che separeremo, tagliando con delicatezza il tessuto e allontanandoli con cautela. Non vogliamo che il tessuto si secchi, quindi ne aggiungeremo un po' di PBS.

Ora ho separato i due lobi. Questo è il lobo dorsale, che ha una caratteristica forma a chitarra. E questo è il lobo ventrale proprio qui.

Rimuoverò il tessuto in eccesso da ciascun lobo in modo che l'area di imaging sia priva di tessuto residuo. Tuttavia, lascerò una piccola quantità di tessuto per poter tenere saldamente il tessuto. Durante l'imaging, immagineremmo attraverso questo tessuto in eccesso, il quale non è realmente necessario, e la qualità delle immagini migliorerà eliminandolo.

Ora abbiamo i due lobi divisi che sono pronti per essere montati su un coprioggetto per l'acquisizione delle immagini. Per preparare il timo diviso per l'acquisizione delle immagini, sarà necessario un adesivo tissutale veterinario e coprioggetti da 18 per 18. Preferisco utilizzare una pipetta per applicare una frazione di microlitro di colla sul coprioggetto.

Quindi metterò una goccia di colla lunga circa quanto il timo che andremo a osservare. Poi preferisco distribuirla. Se la larghezza corrisponde a quella del timo, metterò entrambi i lobi sullo stesso vetrino coprioggetto.

Quindi ne metterò un altro proprio qui. Prenderò il lobo dal tessuto in eccesso e lo appoggerò semplicemente sul vetrino, poi lo trascinerò nella zona in cui si trova la colla. Farò lo stesso per l'altro lobo, toccando nuovamente il vetrino nella parte senza colla per stabilizzare la mano, quindi posizionerò l'altro globo timico sul vetrino.

Ora che abbiamo fissato entrambi i globi timici al vetrino coprioggetto, lo passeremo a Paul per l'acquisizione delle immagini. Grazie Ina. Prendiamo questo campione e mettiamolo nel mezzo DME che utilizzeremo per acquisirne le immagini.

Questa è la nostra configurazione per la microscopia a due fotoni. La microscopia a due fotoni è molto efficace per l'immagine delle cellule immunitarie perché consente di osservare in profondità nel timo e vedere le cellule fluorescenti in movimento. Utilizza un laser a infrarossi pulsato per indurre la fluorescenza delle cellule.

E nel nostro microscopio con cinghia di fissaggio abbiamo quattro diverse telecamere che ci permettono di visualizzare contemporaneamente quattro colori diversi, e utilizza un obiettivo speciale, con un ingrandimento di 20x. Si tratta di una lente speciale che si immerge nel mezzo DME in cui abbiamo immerso il timo, il che le consente di avere un'apertura numerica di 0,95, valore molto buono che renderà le nostre cellule molto luminose. Per mantenere il tessuto in buone condizioni, insuffliamo nel mezzo DMEM una miscela gassosa composta dal 95% di ossigeno e dal 5% di CO2.

Da lì, viene pompato nella camera di perfusione dove viene riscaldato a 37 gradi, ed è qui che i lobi del timo vengono immersi. Con questo sistema, possiamo mantenere le cellule nel timo in buone condizioni per quattro ore di acquisizione immagini. Quindi vi ho mostrato come configurare l'acquisizione immagini per il microscopio a due fotoni.

Ora esaminiamo alcuni dei nostri risultati in questo filmato in riproduzione continua. È possibile osservare il timo che abbiamo acquisito in quattro colori diversi. Il rosso rappresenta i vasi sanguigni del timo, mentre il giallo indica le cellule dendritiche dell'ospite che esprimono una proteina fluorescente gialla sotto il controllo di un promotore specifico per le cellule dendritiche.

I timociti blu e verdi che vedete qui provengono da due donatori diversi che utilizziamo per creare una chimera neonatale mediante una tecnica di trasferimento adottivo che Ena vi ha mostrato in precedenza. Le cellule verdi sono timociti che esprimono la proteina fluorescente verde, mentre le cellule blu sono timociti del donatore che esprimeva la proteina fluorescente ciano. Si tratta dello stesso filmato in loop che vi ho mostrato prima, ma voglio farvi notare la tridimensionalità dei set di dati che raccogliamo per ottenere questi filmati.

Concentriamo l'obiettivo su un piano e acquisiamo un'immagine, quindi spostiamo leggermente più in profondità e acquisiamo un'altra immagine, e ancora più in profondità ne acquisiamo un'altra. Per questo filmato, siamo andati in profondità di circa 60 micron, quindi abbiamo ripetuto questo volume di immagini circa una volta ogni 30 secondi per ottenere un volume in movimento. Questo filmato è stato registrato nell'arco di circa 20 minuti.

Quindi possiamo tracciare le cellule attraverso tre dimensioni nel tempo. Vi abbiamo appena mostrato come immaginiamo il timo utilizzando la microscopia a due fotoni. Gli aspetti più importanti di questa procedura sono: primo, iniettare nei neonati il midollo osseo proveniente da donatori.

Due, dissezione e bi, dissezione del timo senza danneggiarne la struttura. Tre, fissaggio del timo a una lamella di vetro per l'analisi mediante microscopio a due fotoni. L'analisi del timo può fornire risposte a numerose domande riguardo lo sviluppo dei timociti e la generazione di un repertorio diversificato di cellule T.

Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.