Imaging in situ del Timo mouse utilizzando 2-Photon Microscopia

L'imaging a due fotoni è utile per l'immunologia perché ci permette di seguire la migrazione di una singola cellula mentre incontra il suo ambiente. Seguendo la migrazione del sito timico. Utilizzando la microscopia a due fotoni, possiamo caratterizzare il meccanismo della selezione positiva e negativa.

Ciao, sono Ina Lottie del laboratorio della dottoressa Ellen Roby presso l'Università della California a Berkeley. E io sono Paul Herzmark, anche lui del laboratorio di Ellen Robbie. Oggi vi mostreremo come eseguiamo l'imaging in situ del tessuto del timo e vi mostrerò come possiamo utilizzare il nostro microscopio a due fotoni per l'imaging del timo.

E vi mostrerò i passaggi che portano all'imaging a due fotoni. Ciò include le seguenti procedure, isolamento delle cellule staminali ematopoietiche dal midollo osseo, trasferimento adottivo delle cellule del midollo osseo nei neonati, dissezione e bisezione del timo, preparazione del tessuto per l'imaging mediante microscopia a scansione laser a due fotoni. Quindi iniziamo.

Prima di poter preparare il timo per l'imaging, dobbiamo prima trasferire in modo adottivo le cellule del midollo osseo in un topo neonatale. Queste cellule del midollo osseo sono state isolate dalle zampe posteriori di topi transgenici che esprimono GFP in modo ubiquitario. Questa è una siringa da insulina con 50 microlitri di midollo osseo.

Facciamo da due a quattro iniezioni in ospiti che hanno da tre a sette giorni, usando il midollo osseo di un donatore per ogni cucciolo iniettato. E qui abbiamo un cucciolo di cinque giorni, pizzica la pelle all'indietro per evitare che il cucciolo si muova durante l'iniezione e per mantenere la pelle in cima. Puntare a un sito di iniezione che si trovi sotto i polmoni e la gabbia toracica, ma sopra l'intestino e lo stomaco.

Durante l'iniezione, allenta la presa sulla pelle per consentirne l'espansione. Infine, rimuovere lentamente la siringa per limitare la quantità di midollo osseo che si perde. Questi topi saranno lasciati sviluppare per quattro o sei settimane, quindi il timo può essere rimosso per l'imaging.

Dopo quattro o sei settimane, il timo può essere rimosso. Per l'imaging, utilizzerò un set di pinze e forbici grandi, nonché un set di pinze e forbici piccole. Quindi questa massa è stata sacrificata in conformità con il nostro protocollo di utilizzo animale e spruzzata con etanolo.

E userò le grandi pinze per pizzicare la pelle e fare un'incisione sulla linea mediana. Ora posso usare le forbici per tagliare la linea mediana o posso strappare la pelle dal peritoneo e ho intenzione di fissare la pelle per esporre la cavità toracica. E userò lo sterno per aggrapparmi mentre taglio il peritoneo e vado nella cavità toracica attraverso il diaframma e poi taglio lungo i lati della gabbia toracica.

E si può vedere il timo che giace proprio sopra il cuore. Li rimetterò a posto. Quindi c'è il timo.

Eviterò di toccarlo. Usi le pinze più piccole, tieni ancora il tessuto attorno al timo. Ok, ora lo spruzzo con un po' di PBS e inizio a rimuovere un po' del tessuto in eccesso.

Quindi userò il tessuto intorno al timo per aggrapparmi. Quando sto pulendo il timo, tolgo il tessuto in eccesso, tagliandolo via con cura. Ora ci sono due lobi nel timo che dobbiamo anche separare mentre lo puliamo.

Ma prima rimuoverò tutti questi vasi sanguigni in eccesso che si trovano sulla superficie del timo. Sto molto attento a non disturbare l'architettura del timo che andremo a fotografare. Quindi sto solo togliendo il tessuto che è proprio in superficie.

Ora inizierò delicatamente a separare i due lobi. Questo è il lobo ventrale e il lobo dorsale che separeremo e taglieremo delicatamente il tessuto, separandoli. Non vogliamo che il tessuto si asciughi, quindi ci spruzzeremo sopra un po' di PBS.

Ora ho separato i due lobi. Quindi questo è il lobo dorsale, che ha una caratteristica forma a chitarra. E questo è il lobo ventrale proprio qui.

Pulirò il tessuto in eccesso da ciascuno di questi lobi in modo che l'area di imaging sia priva di tessuto in eccesso. Ma lascerò solo un po' di tessuto per tenerci stretto il ti. Quando stiamo per l'imaging, stiamo per ottenere l'imaging attraverso questo tessuto in eccesso, che in realtà non è necessario, e migliorerà la qualità dell'immagine rimuovendolo.

Quindi ora abbiamo i nostri due lobi divisi in due che sono pronti per essere montati su un vetrino coprioggetti per l'imaging. Per preparare il timo diviso in due per l'imaging, avrai bisogno di un adesivo per tessuti veterinari e di vetrini coprioggetto 18 per 18. Mi piace usare un petman per pipa per mettere una frazione di microlitro di colla sul vetrino coprioggetto.

Quindi metterò una goccia di colla che è circa la lunghezza del timo che stiamo per immaginare. E poi mi piace diffonderlo in giro. Quindi, se è la larghezza del timo, di nuovo, metterò entrambi i lobi sullo stesso vetrino coprioggetti.

Quindi ne metterò un altro proprio qui. Quindi prenderò il lobo dal tessuto in eccesso e lo appoggerò sul vetrino coprioggetti e poi lo trascino nell'area in cui si trova la colla. Farò lo stesso per l'altro lobo, di nuovo, toccando il vetrino coprioggetti dove non c'è colla per tenere ferma la mia mano e poi appoggiando l'altro globo timico sul vetrino coprioggetti.

Ora che abbiamo attaccato entrambi i globi timici al vetrino coprioggetto, lo passeremo a Paul per l'imaging. Grazie Ina. Prendiamo questo campione e inseriamolo nel supporto DME che utilizzeremo per l'immagine.

Questa è la nostra configurazione di microscopio a due fotoni. La microscopia a due fotoni è molto buona per l'imaging delle cellule immunitarie perché puoi guardare in profondità nel timo e vedere le cellule fluorescenti che si muovono. Utilizza un laser a infrarossi a impulsi per far sì che le cellule emettano fluorescenza.

E abbiamo nel nostro microscopio da cintura di casa quattro diverse fotocamere che ci permettono di visualizzare contemporaneamente quattro colori diversi e utilizza una speciale lente dell'obiettivo, che è un ingrandimento di 20x. Ed è una lente speciale che si immerge nel mezzo DME in cui abbiamo immerso il timo, e che gli permette di avere un na di 0,95, che è molto buono, renderà le nostre cellule molto luminose. Per mantenere il tessuto sano, facciamo bollire il 95% di ossigeno e il 5% di CO2 attraverso il mezzo DMEM.

Da lì, viene pompato nella camera di perfusione dove viene riscaldato a 37 gradi, ed è lì che vengono immersi i lobi del timo. Con questo sistema, possiamo mantenere sane le cellule del timo per quattro ore di imaging. Quindi vi ho mostrato come impostare l'imaging per il microscopio a due fotoni.

Ora diamo un'occhiata ad alcuni dei nostri risultati in questo film che va in loop. Puoi vedere il timo che abbiamo immaginato in quattro colori diversi qui. Il rosso sono i vasi sanguigni del timo e il giallo sono le cellule dendritiche dell'ospite che esprimono la proteina fluorescente gialla sotto il controllo di un promotore specifico delle cellule dendritiche.

I timociti blu e verdi che vedete qui provengono da due diversi donatori che usiamo per creare una chimera neonatale usando una tecnica di trasferimento adottivo che Ena vi ha mostrato in precedenza. Le cellule verdi sono timociti che esprimono la proteina fluorescente verde e le cellule blu sono timociti della ciambella che esprimeva la proteina fluorescente ciano. Questo è lo stesso filmato in loop che vi ho mostrato prima, ma voglio mostrarvi la tridimensionalità dei set di dati che raccogliamo per ottenere questi filmati.

Ci concentriamo su un piano e scattiamo un'immagine e poi ci concentriamo un po' più a fondo e scattiamo un'altra immagine e un po' più a fondo in un'altra immagine. E poi per questo filmato, siamo scesi di circa 60 micron, e poi abbiamo ripetuto quel volume di immagini circa una volta ogni 30 secondi per ottenere il volume in movimento. E questo film è stato girato per circa 20 minuti.

In questo modo possiamo tracciare le cellule attraverso tre dimensioni nel tempo. Vi abbiamo appena mostrato come immaginiamo il timo utilizzando due fotomicroscopie. Gli aspetti più importanti di questa procedura sono uno, l'iniezione di midollo osseo da donatori nei neonati.

Due, dissezionare e bisezionare il timo senza danneggiarne la struttura. Tre, fissando saldamente il timo a un vetro di copertura quattro immagini utilizzando un microscopio a due fotoni. L'imaging nel timo può rispondere a molte domande sullo sviluppo dei timociti e sulla generazione di un repertorio diversificato di cellule T.

Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.