Name: Imaging in situ del Timo mouse utilizzando 2-Photon Microscopia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-01-25T19:52:00.000+00:00
Duration: 15 min
Description: Impara l'imaging in situ del timo con microscopia 2-fotoni per studiare la migrazione cellulare e i meccanismi di selezione dei timociti nel sistema immunitario murino.

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Ringraziamo Paolo Matt e Jimmy Wu di assistenza tecnica.

Trasferimento adottivi Iniettare neonati con 50-100ul di midollo osseo con una siringa per insulina 2-4 volte durante i primi 3-7 giorni di vita, con un finale donatore-to-host rapporto di 1:1. Mirare a un sito di iniezione sotto lo sterno e la gabbia toracica, ma soprattutto l&#39;intestino e lo stomaco. Inserire l&#39;ago quanto basta per penetrare il peritoneo, attenzione a non forare il diaframma. Non è raro che per alcuni del midollo osseo per essere persi durante l&#39;iniezione. È possibile ridurre la perdita allentando la presa sul cucciolo durante l&#39;iniezione in modo da permettere alla pelle di espandersi e, poi, lentamente, togliere l&#39;ago. Dissezione di Timo Fare un&#39;incisione attraverso la linea mediana e tagliare o strappare via la pelle per rivelare la gabbia toracica. Hold on allo sterno e tagliare il peritoneo e il diaframma. Tagliate i lati della gabbia toracica per rivelare la cavità toracica. Il timo si trova sulla parte superiore del cuore. In modo da preservare la struttura del timo, mantenere il tessuto circostante, come si sezionare il timo. Lavare il timo con PBS per evitare che si secchi durante la dissezione. Delicatamente stuzzicare via dei tessuti in eccesso sulla superficie della capsula timica e tagliare i due lobi. Preparazione del tessuto per l&#39;imaging Utilizzare un adesivo per incollare il tessuto veterinario il timo no a un coprioggetto piazza. Utilizzare un pipetteman per mettere una frazione di microlitro di adesivo. Stendere la colla per la lunghezza e la larghezza approssimativa del timo. Costante il timo contro il coprioggetto e trascinarlo in posizione. Due-Photon Imaging Il tessuto viene immerso in DMEM senza rosso fenolo che viene perfuso con il 95% di ossigeno e anidride carbonica del 5% e riscaldato a 37 ° C. Eccitazione a due fotoni è stato raggiunto utilizzando un Spectra-Physics Maitai laser sintonizzati 900nm, e CFP, GFP, YFP e Texas Red emissione luminosa è stata separata con una 495, 515, 560 specchi dicroici e raccolti utilizzando rilevatori di PMT.

<ol><li>Kyewski, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeding+of+thymic+microenvironments+defined+by+distinct+thymocyte-stromal+cell+interactions+is+developmentally+controlled%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Seeding of thymic microenvironments defined by distinct thymocyte-stromal cell interactions is developmentally controlled.</a> J Exp Med. 166, 520-538 (1987).</li>
<li>Ladi, E., Yin, X., Chtanova, T., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymic+microenvironments+for+T+cell+differentiation+and+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymic microenvironments for T cell differentiation and selection.</a> Nat Immunol. 7, 338-343 (2006).</li>
<li>Witt, C. M., Raychaudhuri, S., Schaefer, B., Chakraborty, A. K., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+Migration+of+Positively+Selected+Thymocytes+Visualized+in+Real+Time%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Directed Migration of Positively Selected Thymocytes Visualized in Real Time.</a> PLoS Biol. 3, (2005).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da dichiarare.

Immagini a due fotoni nel timo ci consente di esaminare in vita, gli organi intatti le interazioni e le migrazioni che sono alla base eventi di selezione all&#39;interno del timo.

imaging in situ del timo mouse utilizzando 2-photon microscopia

In situ Imaging of the Mouse Thymus Using 2-Photon Microscopy

Microscopia a due fotoni (TPM) ci permette di immagine in profondità nel timo e documentare gli eventi che sono importanti per lo sviluppo timocita. Per seguire la migrazione degli individui in una folla di timociti, che generano chimere neonatale dove derivano meno dell&#39;uno per cento dei timociti da un donatore che è transgenico per una proteina ubiquitariamente espressa fluorescente. Per generare queste chimere parziale ematopoietiche, i destinatari neonatale vengono iniettati con midollo osseo tra i 3-7 giorni di età. Dopo 4-6 settimane, il mouse è sacrificato ed il timo è attentamente sezionato e bissected preservando l&#39;architettura del tessuto che verrà ripreso. Il timo è incollato su un vetrino in preparazione ex vivo di immagini da TPM. Durante l&#39;imaging del timo è tenuto in DMEM senza rosso fenolo che è perfuso con il 95% di ossigeno e anidride carbonica del 5% e riscaldato a 37 ° C. Usando questo approccio, possiamo studiare gli eventi necessari per la generazione di un diverso repertorio delle cellule T.

Vi presentiamo passo-passo le istruzioni per la generazione di chimere neonatale e la dissezione e la preparazione del timo per ex vivo imaging 2-Photon Microscopia.

Imaging in situ del Timo mouse utilizzando 2-Photon Microscopia

La microscopia a due fotoni (TPM) ci consente di ottenere immagini in profondità nel timo e di documentare gli eventi cruciali per lo sviluppo dei timociti. Per seguire i...

L'imaging a due fotoni è utile per l'immunologia perché ci permette di seguire la migrazione di una singola cellula mentre incontra il suo ambiente. Seguendo la migrazione nel timo, mediante microscopia a due fotoni possiamo caratterizzare il meccanismo della selezione positiva e negativa.Ciao, sono Ina Lottie del laboratorio della dottoressa Ellen Roby presso l'Università della California a Berkeley. E io sono Paul Herzmark, anch'io del laboratorio di Ellen Robby. Oggi vi mostreremo come eseguiamo l'imaging in situ del tessuto timico, e vi farò vedere come possiamo utilizzare il nostro microscopio a due fotoni per osservare il timo.E vi mostrerò i passaggi che portano all'immagine mediante microscopia a due fotoni. Questi includono le seguenti procedure: isolamento di cellule staminali ematopoietiche dal midollo osseo, trasferimento adottivo di cellule del midollo osseo in neonati, dissezione e bisezione del timo, preparazione del tessuto per l'analisi mediante microscopia a scansione laser a due fotoni. Cominciamo dunque.Prima di poter preparare il timo per l'analisi mediante imaging, dobbiamo innanzitutto trasferire in modo adottivo cellule del midollo osseo in un topo neonato.

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Due fotoni di imaging ha scoperto la motilità dei linfociti e interazioni cellulari all'interno del linfonodo in condizioni basali e durante una risposta immunitaria 1. In questo studio dimostriamo trasferimento adottivo di cellule T, l'isolamento dei linfonodi, e la motilità imaging di cellule T CD4 + nel linfonodo espiantati.

Dissezione e 2-Photon Imaging di linfonodi periferici nei topi

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Un sottile cranio Tecnica Finestra per cronica a due fotoni In vivo</emImaging> della microglia nei modelli murini di neuroinfiammazione

Abbiamo sviluppato strumenti di laboratorio nuovi e protocolli per l'acquisizione di immagini intravitale del timo. La nostra tecnica dovrebbe aiutare nell'identificazione di "nicchie" all'interno del timo in cui lo sviluppo delle cellule T si verifica.

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Two-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging di spine dendritiche nella corteccia mouse Uso un teschio Diluito-Preparazione

Questo video mostra la procedura di craniotomia che consente l'imaging cronico dei neuroni nella corteccia retrospleniale del topo utilizzando la microscopia a due fotoni in vivo nella linea transgenica Thy1-GFP. Questo approccio è combinato con l'iniezione di virus adeno-associato che esprime mCherry nell'ippocampo dorsale. Queste tecniche consentono il monitoraggio a lungo termine della plasticità strutturale dipendente dall'esperienza in RSC.

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L'obiettivo del protocollo è di mostrare longitudinale videomicroscopia tracking in tempo reale dei timociti di scansione microscopia in impianti timici nell'alloggiamento anteriore dell'occhio del mouse laser. La trasparenza della cornea e la vascolarizzazione dell'innesto permette di registrare continuamente reclutamento di cellule progenitrici e l'uscita di cellula T maturo.

Inseguimento In Vivo dei timociti nell'alloggiamento anteriore dell'occhio di microscopia a scansione Laser in tempo reale

I cambiamenti morfologici si verificano nelle cellule fibroblaste immunitarie dopo l'attivazione e promuovono alterazioni nel reclutamento cellulare. Utilizzo dell'imaging a 2 fotoni in combinazione con una proteina specifica fibroblasta geneticamente ingegnerizzata 1 (FSP1)-cre; tdTomato- linea di mouse flossa-stop-floxed (TB/TB) e verde fluorescente etichettato lipopolysaccharide-FITC, possiamo illustrare l'assorbimento altamente specifico di lipopolissaccharide nei fibroblasti dermici e...

In Vivo a due colori immagini fotone di cellule reporter geneticamente taggate nella pelle

Il presente protocollo descrive una procedura di radiologia interventistica stabilita per l'iniezione intratimica nei topi per evitare il rischio di chirurgia aperta e migliorare l'accuratezza delle iniezioni percutanee cieche.

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Questo protocollo contiene una descrizione dettagliata di un approccio passo dopo passo per un modello murino a finestra cranica cronica e embolia microvascolare, ottimizzato per la microscopia a due fotoni in vivo utilizzando microsfere fluorescenti al polistirene.

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Questo studio presenta un approccio di imaging a due fotoni in vivo per visualizzare le strutture dei terminali assonici dei meccanorecettori (LTMR) a bassa soglia nella pelle delle zampe anteriori dei topi. Utilizzando immagini ripetute ad alta risoluzione di singoli assoni, questo metodo offre una nuova piattaforma per studiare la struttura e la funzione del circuito sensoriale cutaneo durante lo sviluppo e negli adulti.

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Impara l'imaging in situ del timo con microscopia 2-fotoni per studiare la migrazione cellulare e i meccanismi di selezione dei timociti nel sistema immunitario murino.

Imaging in situ del Timo mouse utilizzando 2-Photon Microscopia

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