Name: Isolamento e identificazione delle cellule di nicchia limbari (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-27T14:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: Impara l'isolamento e l'identificazione delle cellule di nicchia limbari umane per la medicina rigenerativa. Questo metodo utilizza sequenziamento single-cell per analizzare le vie di segnalazione e supportare la funzione delle cellule staminali limbari.

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Grazie a Wei Wang, Lingjuan Xu e Rong Liu per la guida su questo lavoro, Yongyao Tan, Bihui Jin, Chunxiu You e Li Guigang per aver fornito parte del materiale, Guanyu Su per aver scritto il manoscritto, Xiao Zhou, Yihong Xiong e Huatao Xie per aver corretto il manoscritto e Guigang Li per la sua guida completa. Questo studio è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (n. 82070936, 81470606, 81570819), dal progetto di ricerca scientifica sulla salute e la pianificazione familiare della provincia di Hubei (n. WJ2017M073), I dieci migliori progetti di ricerca medica traslazionale dell'ospedale di Tongji (n. 2016ZHYX20), Progetto di formazione di giovani pionieri medici nella città di Wuhan (n. 2015whzqnyxggrc10), Programma di reclutamento di talenti globali (G2022154028L), Progetto della Commissione sanitaria nazionale della provincia di Hubei nel 2022 (WJ2021ZH0005) e Fondazione per la costruzione di soggetti del dipartimento finanziario dell'Hubei nel 2022 (42000022815T000000102)

Il tessuto Limbus proveniente da donatori di età compresa tra i 50 e i 60 anni è stato ottenuto dalla Banca degli Occhi della Croce Rossa, Tongji Hospital (Wuhan, Cina). Il protocollo è stato approvato dal Comitato Etico di Tongji ed è stato condotto in conformità con la Dichiarazione di Helsinki.
1. Isolamento
<ol><li>Ottenere il tessuto limbus dal mezzo di conservazione corneale a medio termine e operare in condizioni asettiche su un banco di lavoro ultra-pulito.</li>
	<li>Raschiare e rimuovere l'iride e l'endotelio intorno alla cornea utilizzando una lama rotonda chirurgica sterile.</li>
	<li>Tagliare il tessuto limbus in dodici pezzi di uguali dimensioni con una lama chirurgica con 1 mm di sinistra su entrambi i lati della cornea e della sclera.</li>
	<li>Trasferire i tessuti limbus su una piastra di coltura di 3,5 cm, aggiungere 1 ml di collagenasi A (2 mg/mL, in terreno DF-12), per immergere tutti i tessuti per la digestione.</li>
	<li>Mettere la piastra nell'incubatrice cellulare a 37 °C, digerire i tessuti limbari per 18 ore. NOTA: Le procedure di follow-up vengono solitamente eseguite il secondo giorno.</li>
	<li>Preparare una piastra di coltura a 6 pozzetti rivestita con matrice di membrana basale al 5% (Matrigel).<ol><li>Rivestire la matrice di membrana basale al 5% (disciolta in MESCM [Tabella 1]) sul fondo del pozzetto.</li>
		<li>Preparare puntali da 200 μL e 1 mL, una provetta centrifuga da 15 mL e una piastra da 6 pozzetti in una sacca sterilizzata.</li>
		<li>Mettere la sacca sterilizzata (compresi i puntali e la provetta centrifuga) e una nuova piastra a 6 pozzetti in un ambiente di -20 °C o -80 °C per 20 minuti. Scongelare la matrice della membrana basale in frigorifero a 4 °C.</li>
		<li>Estrarre i puntali preraffreddati, il tubo centrifugo e la piastra a 6 pozzetti dall'ambiente a -20 °C o -80 °C, quindi eseguire le seguenti operazioni sul banco di lavoro ultra-pulito.</li>
		<li>Trasferire 50 μL di matrice di membrana basale al 5% in 1 mL di MESCM utilizzando una punta da 200 μL e mescolarli delicatamente e in modo uniforme.</li>
		<li>Trasferire la matrice di membrana basale al 5% (disciolta in MESCM) in un pozzetto di una piastra di coltura a 6 pozzetti utilizzando la punta da 1 mL preraffreddata.</li>
		<li>Agitare delicatamente e orizzontalmente la piastra a 6 pozzetti, immergere la piastra di coltura a 6 pozzetti nell'incubatore cellulare a 37 °C per circa 1 ora, quindi eseguire il passaggio successivo.</li>
	</ol></li>
	<li>Dopo 18 ore di digestione, estrarre il tessuto limbare digerito dalla collagenasi A, rimarranno solo alcuni piccoli grappoli visibili e tessuti sclerali non digeriti. NOTA: La microscopia ad alto ingrandimento rivela un cluster composto da molte cellule densamente impacchettate (comprese le LNC).</li>
	<li>Utilizzare un puntale per pipette da 200 μL per staccare i cluster dai tessuti sclerali non digeriti sotto lo stereomicroscopio.</li>
	<li>Trasferire i grappoli sulla piastra di coltura da 3,5 cm e immergerli in TE allo 0,25%, quindi posizionare la piastra nell'incubatore cellulare per 15 minuti.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di MESCM con il 10% di siero knockout per arrestare la digestione cellulare e pipettare delicatamente su e giù per risospendere i cluster nelle singole cellule utilizzando un puntale per pipette da 1 mL.</li>
	<li>Trasferire la sospensione cellulare in una provetta centrifuga da 15 mL e centrifugare a 200 x g per 5 min.</li>
	<li>Rimuovere il surnatante con cautela senza disturbare la precipitazione cellulare, quindi aggiungere 1 mL di MESCM per risospendere le cellule.</li>
	<li>Pipettare su e giù 2-3 volte fino a quando la precipitazione della cellula inferiore non è sospesa uniformemente nel MESCM utilizzando un puntale per pipette da 1 mL e prelevare una sospensione cellulare da 20 μL per il conteggio delle cellule.</li>
	<li>Trasferire la sospensione cellulare nella piastra a 6 pozzetti rivestita con matrice di membrana basale al 5% con un puntale per pipette da 1 mL e aumentare il volume di MESCM a 2,5 mL.</li>
	<li>Agitare delicatamente la piastra a 6 pozzetti orizzontalmente per distribuire uniformemente le cellule.</li>
	<li>Trasferire le cellule nell'incubatore di coltura dopo essere state sottoposte a imaging e registrate. Osservare e fotografare le cellule ogni giorno e cambiare il terreno ogni 3-4 giorni.</li>
</ol>2. Identificazione dei LNC
<ol><li>Colorazione a immunofluorescenza<ol><li>Digerire gli LNC dal fondo della piastra utilizzando 1 mL 0,25% TE per 5 minuti nell'incubatore cellulare a 37°C.</li>
		<li>Terminare la digestione aggiungendo 1 mL di MESCM (contenente siero knockout), centrifugare la sospensione cellulare a 200 x g per 5 minuti e aspirare con cura il surnatante.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di MESCM per risospendere le cellule in sospensione. Preparare una sospensione cellulare da 80 μL (4 × 103 cellule per vetrino) per 4 vetrini (20 μL/vetrino) e utilizzare il sistema di centrifuga per depositare le cellule sui vetrini del microscopio secondo le istruzioni del produttore.</li>
		<li>Fissare le cellule (incollate ai vetrini nel passaggio 3) utilizzando paraformaldeide al 4% per circa 10 minuti, quindi permeabilizzare le cellule sui vetrini con Triton X-100 allo 0,2% in PBS per 15 minuti.</li>
		<li>Bloccare le cellule per 1 ora con albumina sierica bovina al 2% (BSA) prima di incubarle con anticorpi primari (Pan-CK [1:1000], Vim [1:100], CD90 [1:100], CD105 [1:200], SCF [1:100], PDGFRβ [1:100]) su un agitatore per una notte a 4 °C. Dopo l'incubazione, rimuovere gli anticorpi primari non legati lavando (5 min/lavaggio, 3 volte) i vetrini con PBST (PBS + 0,1% Tween 20).</li>
		<li>Incubare gli anticorpi secondari corrispondenti (anticorpo IgG anti-topo asino TRITC [1:1000], anti-coniglio asino IgG FITC [1:500], asino anti-topo IgG 488 [1:300], asino anti-coniglio IgG 594 [1:400]) per 1 ora con anticorpi IgG non specifici adatti a loro. Rimuovere l'anticorpo secondario non legato utilizzando PBST (5 min/lavaggio, 3 volte).</li>
		<li>Controcolorare i nuclei con 5 μg/mL di DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindolo ) e sigillare i vetrini.</li>
		<li>Eseguire l'imaging a fluorescenza utilizzando un microscopio a fluorescenza (ingrandimento: 400x; Tempo di esposizione: 50 ms).</li>
	</ol></li>
	<li>Reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale (qPCR)<ol><li>Prendi il kit di isolamento dell'RNA per estrarre l'RNA totale secondo le istruzioni del produttore.</li>
		<li>Utilizzare un kit di trascrizione del cDNA ad alta capacità per trascrivere inversamente 1-2 μg di RNA totale in cDNA.</li>
		<li>Eseguire la trascrizione inversa (42 °C, 2 min; 50 °C, 85 min) e la qPCR (95 °C, 5 min; 95 °C, 10 s, 40 cicli) in una soluzione di 20 μL contenente cDNA (100 ng), TaqMan Gene Expression Assay Mix (1 μL), Universal PCR Master Mix (10 μL) e ddH2O (fino a 20 μL).</li>
		<li>Utilizzare la tecnica TC comparativa (ΔΔCT)4,9 per esaminare l'espressione genica relativa.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Caratterizzazione dei LNC
<ol><li>Conteggio delle cellule (emocitometro)<ol><li>Digerire gli LNC dal fondo della piastra utilizzando lo 0,25% di TE per 5 minuti nell'incubatore cellulare a 37 °C.</li>
		<li>Terminare la digestione aggiungendo 1 mL di MESCM (contenente siero knockout), centrifugare la sospensione cellulare a 200 x g per 5 minuti e aspirare con cura il surnatante.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di MESCM per risospendere le cellule, quindi prelevare 10 μL di sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 0,5 mL. Aggiungere un volume uguale di soluzione colorante blu Trypan allo 0,4%.</li>
		<li>Posizionare una sospensione cellulare colorata da 10 μL sull'area di conteggio dell'emocitometro e coprirla con un vetrino coprioggetti per il conteggio. NOTA: Il numero di celle nelle cinque aree del quadrato centrale è definito come "A"; il numero di celle in 1 mL è calcolato come 5A × 104 × 2.</li>
	</ol></li>
	<li>Esame dei marcatori LNC e BMMSC con citometria a flusso15<ol><li>Rilevare l'espressione di SCF, CD73, CD90 e CD105 nelle LNC e nelle BMMSC utilizzando la citometria a flusso 15 (2-4 ×10 6 eventi/campione, 2.000 cellule sono state ottenute da ciascuno dei campioni, per un totale di 550.000 cellule che sono state gateed contemporaneamente).</li>
		<li>Raccogliere e colorare le cellule a 20-30 °C per 15 minuti in un tampone bloccante (3% BSA e 0,05% Tween-20 in PBS) utilizzando anticorpi premarcati (SCF [1:50], CD70 [1:50], CD90 [1:50] e CD105 [1:50]) secondo le istruzioni del kit.</li>
		<li>Eseguire l'analisi FACS (Fluorescence-Activated Cell Sorting) utilizzando un citometro a flusso. In questo studio sono stati utilizzati i software FACS Diva e FlowJo. Per ogni campione, registrare 10.000 eventi e controllare e analizzare le cellule vive.</li>
	</ol></li>
</ol>

Un protocollo per isolare, coltivare e identificare le cellule di nicchia limbare umana

<ol><li>Le, Q., Xu, J., Deng, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diagnosis+of+limbal+stem+cell+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Ocular+Surface%22%5BJournal%5D)">The diagnosis of limbal stem cell deficiency.</a> Ocular Surface. 16 (1), 58-69 (2018).</li>
<li>Polisetty, N., Fatima, A., Madhira, S. L., Sangwan, V. S., Vemuganti, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+cells+from+limbal+stroma+of+human+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal cells from limbal stroma of human eye.</a> Molecular Vision. 14, 431-442 (2008).</li>
<li>Xie, H. T., Chen, S. Y., Li, G. G., Tseng, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+expansion+of+human+limbal+stromal+niche+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Isolation and expansion of human limbal stromal niche cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (1), 279-286 (2012).</li>
<li>Li, G. G., Zhu, Y. T., Xie, H. T., Chen, S. Y., Tseng, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+derived+from+human+limbal+niche+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells derived from human limbal niche cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (9), 5686-5697 (2012).</li>
<li>Li, G. G., Chen, S. Y., Xie, H. T., Zhu, Y. T., Tseng, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+potential+of+human+limbal+stromal+niche+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis potential of human limbal stromal niche cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3357-3367 (2012).</li>
<li>Hu, W., Zhang, Y., Tighe, S., Zhu, Y. T., Li, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+isolation+method+of+human+lacrimal+canaliculus+epithelial+stem+cells+by+maintaining+close+association+with+their+niche+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">A new isolation method of human lacrimal canaliculus epithelial stem cells by maintaining close association with their niche cells.</a> International Journal of Medical Sciences. 15 (12), 1260-1267 (2018).</li>
<li>Kumar, A., Xu, Y., Yang, E., Du, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stemness+and+regenerative+potential+of+corneal+stromal+stem+cells+and+their+secretome+after+long-term+storage%3A+Implications+for+ocular+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Stemness and regenerative potential of corneal stromal stem cells and their secretome after long-term storage: Implications for ocular regeneration.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (8), 3728-3738 (2018).</li>
<li>Xiao, Y. T., Qu, J. Y., Xie, H. T., Zhang, M. C., Zhao, X. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+methods+for+isolation+of+limbal+niche+cells%3A+Maintenance+of+limbal+epithelial+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">A comparison of methods for isolation of limbal niche cells: Maintenance of limbal epithelial stem/progenitor cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (14), 16(2020).</li>
<li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limbal+niche+cells+and+three-dimensional+matrigel-induced+dedifferentiation+of+mature+corneal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Limbal niche cells and three-dimensional matrigel-induced dedifferentiation of mature corneal epithelial cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 63 (5), 1(2022).</li>
<li>Basu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+limbal+biopsy-derived+stromal+stem+cells+prevent+corneal+scarring%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human limbal biopsy-derived stromal stem cells prevent corneal scarring.</a> Science Translational Medicine. 6 (266), 266ra172(2014).</li>
<li>Acar, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+allogeneic+limbal+mesenchymal+stem+cell+therapy+in+corneal+healing%3A+role+of+administration+route%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Research%22%5BJournal%5D)">Effect of allogeneic limbal mesenchymal stem cell therapy in corneal healing: role of administration route.</a> Ophthalmic Research. 53 (2), 82-89 (2015).</li>
<li>Katikireddy, K. R., Dana, R., Jurkunas, U. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+potential+of+limbal+fibroblasts+and+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+to+corneal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Differentiation potential of limbal fibroblasts and bone marrow mesenchymal stem cells to corneal epithelial cells.</a> Stem Cells. 32 (3), 717-729 (2014).</li>
<li>Polisetti, N., Sharaf, L., Reinhard, T., Schlunck, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+ex+vivo+expansion+of+limbal+mesenchymal+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and ex vivo expansion of limbal mesenchymal stromal cells.</a> Bio-Protocols. 12 (14), e4471(2022).</li>
<li>Xie, H. T., Chen, S. Y., Li, G. G., Tseng, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limbal+epithelial+stem%2Fprogenitor+cells+attract+stromal+niche+cells+by+SDF-1%2FCXCR4+signaling+to+prevent+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Limbal epithelial stem/progenitor cells attract stromal niche cells by SDF-1/CXCR4 signaling to prevent differentiation.</a> Stem Cells. 29 (11), 1874-1885 (2011).</li>
<li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+limbal+niche+cells+are+a+powerful+regenerative+source+for+the+prevention+of+limbal+stem+cell+deficiency+in+a+rabbit+model%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Human limbal niche cells are a powerful regenerative source for the prevention of limbal stem cell deficiency in a rabbit model.</a> Scientific Reports. 8, 6566(2018).</li>
<li>Kumar, A., Yun, H., Funderburgh, M. L., Du, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+therapy+for+the+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+In+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Regenerative therapy for the cornea.</a> Progress In Retinal and Eye Research. 87, 101011(2022).</li>
<li>Pineda, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPineda%2C+R+%22World+Corneal+Blindness.+Foundations+of+Corneal+Disease%22">World Corneal Blindness. Foundations of Corneal Disease</a>. , Springer, Cham. 299-305 (2020).</li>
<li>Zieske, J. D., Guimarães, S. R., Hutcheon, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+keratocyte+proliferation+in+response+to+epithelial+debridement%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Kinetics of keratocyte proliferation in response to epithelial debridement.</a> Experimental Eye Research. 72 (1), 33-39 (2001).</li>
<li>Resnikoff, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+data+on+visual+impairment+in+the+year+2002%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+the+World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">Global data on visual impairment in the year 2002.</a> Bulletin of the World Health Organization. 82 (11), 844-851 (2004).</li>
<li>Tan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limbal+bio-engineered+tissue+employing+3D+nanofiber-aerogel+scaffold+to+facilitate+LSCs+growth+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecular+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Limbal bio-engineered tissue employing 3D nanofiber-aerogel scaffold to facilitate LSCs growth and migration.</a> Macromolecular Bioscience. 22 (5), e2100441(2022).</li>
<li>Aghamirsalim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+printed+hydrogels+for+ocular+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">3D printed hydrogels for ocular wound healing.</a> Biomedicines. 10 (7), 1562(2022).</li>
<li>Sasamoto, Y., Ksander, B. R., Frank, M. H., Frank, N. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repairing+the+corneal+epithelium+using+limbal+stem+cells+or+alternative+cell-based+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Biological+Therapy%22%5BJournal%5D)">Repairing the corneal epithelium using limbal stem cells or alternative cell-based therapies.</a> Expert Opinion on Biological Therapy. 18 (5), 505-513 (2018).</li>
<li>Rohaina, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+limbal+stem+cell+deficient+corneal+surface+with+induced+human+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+on+amniotic+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of limbal stem cell deficient corneal surface with induced human bone marrow mesenchymal stem cells on amniotic membrane.</a> Translational Research. 163 (3), 200-210 (2014).</li>
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<li>Hayashi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+generation+of+multiple+ocular-like+cell+lineages+and+fabrication+of+functional+corneal+epithelial+cell+sheets+from+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Coordinated generation of multiple ocular-like cell lineages and fabrication of functional corneal epithelial cell sheets from human iPS cells.</a> Nature Protocols. 12 (4), 683-696 (2017).</li>
<li>Guo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limbal+niche+cells+are+a+potent+resource+of+adult+mesenchymal+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Limbal niche cells are a potent resource of adult mesenchymal progenitors.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (7), 3315-3322 (2018).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+gene+expression+between+limbal+niche+progenitors+and+bone+marrow+derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Differential gene expression between limbal niche progenitors and bone marrow derived mesenchymal stem cells.</a> International Journal of Medical Sciences. 17 (4), 549-557 (2020).</li>
<li>González, S., Deng, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+native+limbal+stromal+cells+increases+the+expansion+efficiency+of+limbal+stem%2Fprogenitor+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Presence of native limbal stromal cells increases the expansion efficiency of limbal stem/progenitor cells in culture.</a> Experimental Eye Research. 116, 169-176 (2013).</li>
<li>Funderburgh, M. L., Du, Y., Mann, M. M., SundarRaj, N., Funderburgh, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAX6+expression+identifies+progenitor+cells+for+corneal+keratocytes%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">PAX6 expression identifies progenitor cells for corneal keratocytes.</a> FASEB Journal. 19 (10), 1371-1373 (2005).</li>
<li>Funderburgh, J. L., Funderburgh, M. L., Du, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+in+the+limbal+stroma%5BTitle%5D)+AND+%22Ocular+Surface%22%5BJournal%5D)">Stem cells in the limbal stroma.</a> Ocular Surface. 14 (2), 113-120 (2016).</li>
<li>Chen, S. Y., Hayashida, Y., Chen, M. Y., Xie, H. T., Tseng, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+isolation+method+of+human+limbal+progenitor+cells+by+maintaining+close+association+with+their+niche+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+C%2C+Methods%22%5BJournal%5D)">A new isolation method of human limbal progenitor cells by maintaining close association with their niche cells.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 17 (5), 537-548 (2011).</li>
<li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SnapShot%3A+Growing+organoids+from+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SnapShot: Growing organoids from stem cells.</a> Cell. 161 (7), 1700-1701 (2015).</li>
</ol>

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La trasparenza corneale è tipicamente mantenuta dalla disposizione e dalla distribuzione regolare di piccole fibre (25-30 nm di diametro) nello stroma corneale, che è fondamentale per una normale acuità visiva16. Ci sono 253 milioni di persone ipovedenti in tutto il mondo, 36 milioni delle quali sono cieche17. L'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) considera la cecità corneale uno dei rischi più gravi per la vista umana, rappresentando il 5,1% di tutti i casi di cecit...

L'incidenza del deficit di cellule staminali epiteliali corneali (CESD), chiamato anche deficit di cellule staminali limbari (LSCD)1, e la rigenerazione epiteliale corneale (CES) stanno diventando sempre più urgenti a causa di infezioni e lesioni corneali. Se non adeguatamente trattata, la CESD può portare alla cecità che richiede il trapianto di cornea. Di conseguenza, la rigenerazione del CES sta diventando sempre più significativa. Esiste un gruppo di cellule di supporto chiamate cellule di nicchia limbare (LNC) che forniscono un supporto essenziale per la funzione CES. Le cellule staminali stromali limbari sono state isolate per la prima volta da Polisetty et al.2 e identificate da Xie et al.3 come LNC che sono localizzate nell'epitelio limbare sottostante e nello stroma del limbus. Le LNC sono le principali cellule staminali di supporto del bordo corneale e, con la funzione delle MSC derivate dal midollo osseo (BMMSC), potrebbero essere indotte a svilupparsi in cellule epiteliali corneali e cellule stromali corneali, ecc.3,4,5,6,7. Studi precedenti hanno dimostrato che le qualità delle cellule staminali delle LNC sono più primitive rispetto alle BMMSC8, che sono già ampiamente utilizzate in clinica. Le LNC possono anche diventare la prossima opzione praticabile dopo la MSC, soprattutto per il trattamento della CESD. In quanto importanti cellule di supporto per la CES, le LNC sono anche cellule staminali derivate dalla struttura "di nicchia" del limbus. Le LNC possono svolgere un ruolo chiave nella dedifferenziazione delle cellule epiteliali corneali mature (MCEC) in CES9. Tuttavia, gli studi sugli LNC sono ancora relativamente insufficienti e non c'è consenso sulla terminologia, l'isolamento, la purificazione, l'identificazione e le caratteristiche degli LNC. Alcuni ricercatori hanno chiamato cellule staminali stromali derivate da biopsia limbareLNC 10, cellule staminali mesenchimalilimbari 11, cellule staminali dei fibroblasti limbari12 e cellule stromali mesenchimali limbari13. Poiché le caratteristiche di crescita delle LNC non sono state descritte in dettaglio e a causa delle loro promettenti applicazioni scientifiche e cliniche, e potrebbero essere uno degli strumenti clinici più importanti in futuro, è necessario riassumere l'isolamento, la purificazione, l'identificazione e le caratteristiche delle LNC.
Secondo un precedente studio14, le LNC sono presenti principalmente a livello dell'epitelio limbare sottostante e dello stroma del limbus. Questo protocollo include il trattamento del tessuto limbus utilizzando la collagenasi A, l'ottenimento di un cluster costituito da LEPC e LNC e la digestione in singole cellule con lo 0,25% di tripsina-EDTA (TE). Le LNC sono state quindi coltivate selettivamente in un terreno di cellule staminali embrionali modificate (MESCM) per essere purificate. Il protocollo riportato in questo documento è semplice e ha un'elevata efficienza nell'ottenere LNC umani in grandi quantità.
La procedura dettagliata di isolamento, coltura e identificazione dell'LNC è stata registrata nel video per gli scienziati interessati allo studio dell'LNC e può essere comodamente ripetuta quando necessario.

<table><tbody><tr><td>4',6-Diamidino-2-Fenilindolo</td><td>ThermoFisher</td><td>D1306</td><td>5&mu; g/mL</td></tr><tr><td>Amfotericina B</td><td>Sigma</td><td>V900919</td><td>1,25 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Anti-CD73</td><td>Abcam</td><td>ab202122</td><td>1:50</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>MERCK</td><td>A1933-CD105</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Proteintech</td><td>67075-1-Ig</td><td>1:200</td></tr><tr><td>CD105</td><td>Abcam</td><td>ab114052</td><td>1:50</td></tr><tr><td>CD90</td><td>Proteintech</td><td>66766-1-Ig</td><td>1:100</td></tr><tr><td>CD90</td><td>Abcam</td><td>ab307736</td><td>1:50</td></tr><tr><td>Incubatore cellulare</td><td>Shanghai Lishen</td><td>K1119K4644</td><td>HF90 (HT)</td></tr> <tr><td>Sistema di centrifuga</td><td>StatSpin&nbsp;</td><td>StatSpin CytoFuge</td> <td>12-Collagenase</td></tr> <tr><td>A</td><td>Roche</td><td>10103578001</td><td>2 mg/mL</td></tr><tr><td>Microscopio confocale</td><td>Zeiss</td><td>LSM700-Piastra</td><td></td></tr> di <tr><td>coltura</td><td>virya</td><td>3500356</td><td>35 mm</td></tr><tr><td>DME/F-12 1:1 (1x)&nbsp;</td><td>cytiva</td><td>SH30023.01</td><td>90%</td></tr><tr><td>Anticorpo secondario anti-topo d'asino (H+L)</td><td>ThermoFisher</td><td>A16016</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Anticorpo secondario anti-coniglio d'asino (H+L)</td><td>ThermoFisher</td><td>31568</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>FACS Diva sofware</td><td>BD Biosciences</td><td>Citometro</td><td></td> a flusso stellare</tr> <tr><td></td><td>ad albero BD Biosciences</td><td>Becton Dickinson LSRII</td><td>-</td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza</td><td>olympus</td><td>cx31&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Sigma</td><td>G1914</td><td>50 &mu; Emocitometro g/mL</td></tr><tr><td></td><td>MERCK</td><td>Z359629</td><td>Bright-Line</td></tr><tr><td>Kit di trascrizione del cDNA ad alta capacità</td><td>ThermoFisher</td><td>4374966</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a contrasto di fase invertito</td><td>&nbsp; UOP</td><td>DSZ2000X</td><td></td></tr><tr><td>ITS (insulina, transferrina, selenito di sodio)</td><td>Sigma</td><td>I3146</td><td>5 &mu; g/mL di insulina, 5 &mu; g/mL di transferrina, 5 ng/mL di selenito di sodio</td></tr><tr><td>Sostituzione del siero KnockOut SR per ESC/iPSC</td><td>gibco</td><td>10828-028</td><td>10%</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BioCoat</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>356234-Pan-CK</td><td>Abcam</td><td>ab7753</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>NoninBio</td><td>NBS0135</td><td>4,00%</td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>MKBio</td><td>MM-1505</td><td>4%</td></tr><tr><td>PDGFR&beta;</td><td>Abclonal</td><td>A1444</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Strumento di PCR quantitativa a fluorescenza in tempo reale</td><td>Applied Biosystems</td><td>Step One</td><td></td></tr> <tr><td>Plus-Recombinant Human FGF-basic</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>4 ng/mL</td></tr><tr><td>Recominant Human Leukemia Inhibitory Factor (Lif)</td><td>Peprotech</td><td>300-05</td><td>10 ng/mL</td></tr><tr><td>RNeasy Mini RNA Isolation Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>-</td></tr><tr><td>SCF</td><td>Bioss</td><td>bs-0545R</td><td>1:100</td></tr><tr><td>SCF</td><td>Abcam</td><td>ab52603</td><td>1:50</td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>ZEISS</td><td>SteREO Discovery. V8</td><td></td></tr><tr><td>Lama rotonda chirurgica sterile</td><td>Careforde</td><td>29500</td><td>taglia 10</td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Assay Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4448489</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>MERCK</td><td>X100</td><td>0,20%</td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>ThermoFisher</td><td>15250061</td><td>0,40%</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Genview</td><td>GP3108</td><td>0,25%</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>MERCK</td><td>P9416-Ultra</td><td></td></tr> <tr><td>Clean Bench</td><td>LaiTe</td><td>LT20200705</td><td>SW-CJ-IFDG</td></tr> Universal <tr><td>PCR Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4304437</td><td></td></tr><tr><td>Vim&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab92547</td><td>1:100</td></tr></tbody></table>

isolamento e identificazione delle cellule di nicchia limbari

Isolation and Identification of Limbal Niche Cells

Di seguito riportiamo una procedura standard per l'isolamento e l'identificazione delle cellule di nicchia limbare (LNC). Il tessuto di libus ottenuto da una banca degli occhi è stato utilizzato per l'isolamento degli LNC. Il tessuto è stato diviso in 12 pezzi in condizioni asettiche e digerito per 18 ore a 37 °C nell'incubatore di colture cellulari utilizzando la collagenasi A per ottenere cluster cellulari con LNC e cellule progenitrici epiteliali limbari. I cluster di cellule sono stati ulteriormente digeriti per 15 minuti a 37 °C utilizzando tripsina-EDTA allo 0,25% per ottenere singole cellule e quindi coltivati in terreno di coltura con cellule staminali embrionali modificate (MESCM) su una superficie di plastica rivestita con Matrigel al 5%. Le cellule sono state fatte passare dopo una confluenza del 70% e le LNC sono state identificate utilizzando l'immunofluorescenza, la PCR quantitativa in tempo reale (qPCR) e la citometria a flusso. Gli LNC primari sono stati isolati e attraversati più di 12 volte. L'attività di proliferazione dei LNC da P4 a P6 è stata la più alta. Le LNC esprimevano marcatori di cellule staminali più elevati rispetto alle BMMSC (SCF, Nestin, Rex1, SSEA4, CD73, CD90, MSX1, P75NTR e PDGFRβ). Inoltre, i risultati hanno mostrato che gli LNC P4 esprimevano uniformemente VIM, CD90, CD105 e PDGFRβ, ma non Pan-CK, che potrebbe essere utilizzato come marcatore per l'identificazione degli LNC. L'analisi citofluorimetrica ha mostrato che circa il 95%, 97%, 92% e 11% degli LNC esprimeva rispettivamente CD73, CD90, CD105 e SCF, mentre erano rispettivamente il 68%, il 99%, il 20% e il 3% nelle BMMSC. Il processo standard per l'isolamento e l'identificazione degli LNC potrebbe fornire una base di laboratorio affidabile per l'uso diffuso degli LNC.

Crescita di LNC Le LNC sono state isolate con successo secondo il metodo di digestione della collagenasi A (2 mg/mL) di digestione del tessuto corneosclerale, come descritto sopra (Figura 1). Coerentemente con uno studioprecedente riportato 3, dopo la digestione della collagenasi A, sono stati visualizzati al microscopio cluster simili a bruchi (Figura 2). La proporzione di cellule fusiformi aumentava gradualmente con ...

Qui, presentiamo un protocollo per isolare e identificare le cellule di nicchia limbare umane.

Isolamento e identificazione delle cellule di nicchia limbari

Here we report a standard procedure for the isolation and identification of limbal niche cells (LNCs). Limbus tissue obtained from an eye bank was used ...

I nostri studi si concentrano sulla ricostruzione della nicchia limbare per trattare il deficit di cellule staminali limbari e per ripristinare la vista del paziente. Stiamo cercando di rispondere se le cellule di nicchia limbari sono o meno le cellule chiave che supportano la funzione delle cellule staminali limbari e, in caso affermativo, come funziona. Studi recenti hanno riportato che il trapianto subcongiuntivale di cellule staminali mesenchimali dal midollo osseo ha impedito la carenza di cellule staminali limbari degli occhi bruciati dagli alcali.Una delle tecnologie attualmente utilizzate per far progredire la nostra ricerca è il sequenziamento di singole cellule, in grado di analizzare le attività chiave della via di segnalazione a livello di singola cellula per la caratterizzazione delle cellule di nicchia limbare. Sebbene le LNC abbiano il potenziale per diventare un importante strumento clinico in futuro, le loro caratteristiche di crescita non sono state esplorate in modo molto dettagliato. Considerando le loro promettenti applicazioni scientifiche e cliniche, è necessario riassumere l'isolamento, la purificazione, l'identificazione e le caratteristiche dei LNC.

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Riportiamo una tecnica per la realizzazione di micropockets all'interno membrane elettrofilate in cui studiare il comportamento delle cellule. In particolare, si descrive una combinazione di microstereolithography e elettrofilatura per la produzione di PLGA (Poly (lattide-co-glicolico)) dispositivi biomateriale corneali dotati microfeatures.

Combinazione di Microstereolithography e Electrospinning per la Produzione di Membrane Equipaggiato con nicchie per la rigenerazione della cornea

In questo articolo descriviamo i principi per progettare ed eseguire un esperimento di tracciamento del lignaggio multicolore utilizzando i topi R26R-Confetti. Forniamo un protocollo specifico per il tracciamento delle cellule epiteliali corneali che può essere modificato per altri tessuti di interesse.

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Un esempio di terapia genica adenovirale nelle cornee umane in coltura di organi diabetici viene presentato verso la normalizzazione della guarigione ritardata delle ferite e l'espressione marcatamente ridotta dei marcatori delle cellule staminali epiteliali in queste cornee. Descrive anche l'ottimizzazione di questo processo in colture epiteliali limbari arricchite con cellule staminali.

Adenovirale Terapia genica per diabetici cheratopatia: Effetti sulla guarigione delle ferite e Stem Cell Marker Expression in Human Organ cornee-coltura e le cellule epiteliali Limbal

Il seguente articolo fornisce un facile, tecnica riproducibile per creare efficacemente un modello sostenibile del mouse di carenza di cellule staminali limbari (LSCD). Questo modello animale è utile in fase di test e confrontando l'efficacia dei trattamenti per le malattie di cellule staminali del limbus.

Una semplice procedura meccanica per creare Limbal carenza Stem Cell in mouse

La superficie oculare normale esposta è costituita da cornea e congiuntiva. Le cellule epiteliali, le cellule calde e le cellule immunitarie sono presenti nella congiuntiva. Qui viene descritta una tecnica non invasiva di citologia di impronta usando un dispositivo di citologia di impressione e una citometria a flusso per analizzare le cellule immunitarie nella congiuntiva.

Un modo non invasivo per isolare e fenotipo le cellule della Conjunctiva

Questo protocollo introduce un metodo in due semplici passaggi per la differenziazione delle cellule staminali corneali epiteliali limbal da cellule staminali pluripotenti umane in condizioni di coltura senza cellula di xeno - e alimentatore. I metodi di coltura cellulare presentati qui abilitare produzione costo-efficiente, su larga scala di celle di qualità clinica applicabili all'utilizzo di terapia corneale delle cellule.

Efficiente e scalabile di differenziazione diretto di clinicamente compatibile corneale Limbal cellule staminali epiteliali da cellule staminali pluripotenti umane

La ghiandola lacrimale (LG) ha due tipi di cellule che esprimono α-liscio muscolo actina (αSMA): cellule miepiteliali (MECs) e pericytes. I MECs sono di origine ectodermica, trovati in molti tessuti ghiandolari, mentre i periciti sono cellule muscolari lisce vascolari di origine endodermica. Questo protocollo isola i MECs e i periciti di murine LGs.

Isolamento delle cellule Miepiteliali da adulti murina lacrimale e ghiandole sottomandibolari

Qui è presentato un protocollo per l'isolamento e l'amplificazione di batteri commenali congiuntivali anaerobici aerobici e facultativi del topo utilizzando un tampone oculare unico e una fase di arricchimento basata sulla coltura con successiva identificazione con metodi microbiologici basati e spettrometria di massa MALDI-TOF.

Isolamento e identificazione congiuntivale dei commensali nei topi

Questo protocollo descrive un metodo per indurre una lesione alcalina corneale e limbare accurata e riproducibile in un modello murino. Il protocollo è vantaggioso in quanto consente una lesione uniformemente distribuita alla cornea e al limbus del topo altamente curvi.

Induzione di lesioni alcaline corneali e limbari utilizzando una tecnica punch-trephine in un modello murino

Abbiamo sviluppato un modello di ratto di grave infiammazione corneale attraverso il curettage dell'epitelio corneale combinato con suture corneali. Lo studio ha valutato i modelli di infiammazione corneale, la proliferazione epiteliale e i cambiamenti nelle cellule staminali limbari in condizioni infiammatorie.

Definizione di un modello di grave infiammazione corneale nei ratti basato sul curettage dell'epitelio corneale combinato con suture corneali

Qui presentiamo un protocollo per ottenere sospensioni monocellulari di alta qualità da intere cornee di topo attraverso la digestione sequenziale con collagenasi A e tripsina. Questo metodo produce cellule singole vitali con alta integrità dell'RNA, rendendole compatibili con applicazioni a valle come il sequenziamento a RNA a singola cellula e il citometroa flusso y.

Un protocollo per il prelievo della sospensione a singola cellula dalle cornee dei topi

Impara l'isolamento e l'identificazione delle cellule di nicchia limbari umane per la medicina rigenerativa. Questo metodo utilizza sequenziamento single-cell per analizzare le vie di segnalazione e supportare la funzione delle cellule staminali limbari.

Isolamento e identificazione delle cellule di nicchia limbari

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